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Bioengineering

Elastomer-PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

doi: 10.3791/2691 Published: April 8, 2011

Summary

Elastomer-PGS Gerüste mit vaskulären glatten Muskelzellen in einem pulsatilen Fluss Bioreaktor kultiviert kann, um vielversprechende kleinem Durchmesser arteriellen Konstrukte mit nativen ECM-Produktion in einem relativ kurzen Zeitraum Kultur führen.

Abstract

Kardiovaskuläre Erkrankungen sind eine der führenden Todesursachen in den USA und vor allem, erhöht koronarer Herzkrankheit mit einer alternden Bevölkerung und der steigenden Fettleibigkeit 1. Derzeit Bypass-Operation unter Verwendung von autologen Gefäßen, Allografts und synthetische Transplantate werden als gemeinhin für arterielle Ersatzstoffe verwendet 2 bekannt. Allerdings haben diese Transplantate begrenzte Anwendungen bei einem inneren Durchmesser von Arterien weniger als 6 mm aufgrund der geringen Verfügbarkeit, thrombotischen Komplikationen, Compliance mismatch, und am späten Intimahyperplasie 3,4 ist. Um diese Einschränkungen zu überwinden, hat das Tissue Engineering erfolgreich als eine vielversprechende Alternative zu kleinem Durchmesser arteriellen Konstrukte, die nonthrombogenic, robust und konform sind zu entwickeln angewendet. Mehrere frühere Studien haben kleinem Durchmesser arteriellen Konstrukte mit Tri-Lamellenstruktur, ausgezeichnete mechanische Eigenschaften und Berstdruck vergleichbar mit nativen Arterien 5,6 entwickelt. Während eine hohe Zugfestigkeit und Berstdruck durch die Erhöhung die Produktion von Kollagen aus einem starren Material oder Zellrasen Gerüst, diese Konstrukte immer noch niedrigen Elastin Produktions-und Compliance, die ein großes Problem für Transplantatversagen nach der Implantation zu verursachen. Angesichts dieser Probleme stellten wir die Hypothese, dass eine elastomere Biomaterial mit mechanischer Klimaanlage kombiniert würden Elastizität bieten und führen mechanische Signale effizienter zu vaskulären Zellen, die extrazelluläre Matrix Produktion zu erhöhen und die Unterstützung zelluläre Orientierung.

Das Ziel dieses Berichts ist es, eine Herstellungstechnik von porösen röhrenförmigen Gerüsten und einer dynamisch-mechanischen Konditionierung ihrer Anwendung auf arterielle Tissue Engineering vorstellen. Wir haben ein biologisch abbaubares Elastomer, Poly (Glycerin sebacat) (PGS) 7 zur Herstellung von porösen röhrenförmigen Gerüsten aus dem Salz Fusion-Methode. Adult primäre Pavian glatten Muskelzellen (SMC) wurden auf das Lumen von Gerüsten, die in unserem konzipiert pulsatilen Fluss Bioreaktor für 3 Wochen kultiviert ausgesät. PGS Gerüste hatte konstante Dicke und zufällig verteilten Makro-und Mikro-Poren. Mechanische Konditionierung von pulsatilen Fluss Bioreaktor unterstützt SMC Orientierung und verbesserte ECM-Produktion in Gerüsten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass elastomere Gerüste und mechanische Aufbereitung der Bioreaktor Kultur kann eine Erfolg versprechende Methode für die arterielle Tissue Engineering werden.

Protocol

1. Tubular Scaffold Fabrication

  1. Bereiten Glasrohr (Länge = 70 mm, Außendurchmesser = 9,0 mm, Wandstärke = 1,0 mm; Kleinteile, Miramar, FL) als Form für Gerüst.
  2. Bereiten 1,0 Gew. / Vol-% Hyaluronsäure (HA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durch Lösen von 100 mg HA in 10 ml VE-Wasser. Mix mit einem Rotator über Nacht, bis keine Luftblasen in der Lösung sind.
  3. Gießen Sie 1,0% HA-Lösung in der Spitze der Glasröhren. Lassen Sie es langsam entlang der Innenwand der Form. Flip über den Schlauch, wenn die Lösung erreicht den Boden der Form mit dem Rotator und wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Innenwand der Form wird gleichmäßig von der Lösung beschichtet.
  4. Nach der Beschichtung trocken alle Glas-Schläuche in den Vakuum-Trockenschrank bei 37 ° C für 24 h
  5. Grind und Sieb Salzpartikel (size = 25-32 um) als Porenbildner eingesetzt.
  6. Bauen Sie ein Glasrohr (beschichtet mit 1,0% HA-Lösung innen), Dorn (Edelstahl umhüllt von PTFE-Schlauch), Schrumpf (HS) Hülse und PTFE-Ring, wie vorher beschrieben 8.
  7. Mit Salz Teilchen der gewünschten Größe auf die Glasform mit einem Spatel durch die Silikon-Gummi Trichter. Tippen Sie auf die Form vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung von Salz Partikel zu gewährleisten. Abkratzen das überschüssige Salz Partikel am oberen Rand der Form mit der Seite der Spachtel.
  8. Schalten Sie die Hybridisierung Inkubator für 30 min vor der Übertragung das Salz verpackt Schimmel. Schalten Sie die Hybridisierung Inkubator-und Put-Salz-packed Form, in der Hybridisierung Inkubator für Salz Fusion.
  9. Entfernen Sie die Formen aus der Hybridisierung Inkubator und trocknen Sie sie in den Vakuum-Trockenschrank bei 37 ° C für 24 h
  10. Entfernen Sie das Salz verpackt Formen aus den Vakuum-Trockenschrank und es ihnen ermöglichen, auf Raumtemperatur abkühlen. Entfernen Sie die Edelstahl-Dorn, indem es sich mit dem Halten der PTFE-Ring. Wenn der Dorn ist zu eng, um die Form, die Nadel Zange, ihn herauszuziehen. Entfernen Sie die PTFE-Ring aus dem Boden der Form.
  11. Legen Sie die Formen in den Ofen bei 120 ° C für 5 min auf HS Ärmel schrumpfen. Prüfen Sie, ob die HS Hülse geschrumpft. Entfernen Sie den HS Hülse aus dem Salz-packed Formen und es ihnen ermöglichen, auf Raumtemperatur abkühlen. Halten Sie die Formen in den Exsikkator, bis sie verwendet werden.
  12. Bereiten Sie die PGS-Lösung durch Lösen von 3 g PGS in 15 ml Tetrahydrofuran (THF) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) zu einer 20 wt / vol% ig.
  13. Fügen Sie die PGS Lösung für das Lumen des Salz-packed Formen, indem Sie es mit einem spoid in der Hume Kapuze. Lean die Glasform ca. 45 °-and-Drop die PGS-Lösung in Innenlumen mit rotierendem Werkzeug langsam. Prüfen Sie, ob die PGS-Lösung fließt entlang der Wand von Schimmel. Wenn trockene Stelle beobachtet wird, fügen Sie mehr Lösung.
  14. Nach dem Hinzufügen der PGS-Lösung, legen Sie die Formen in der Hume Haube für mindestens 30 min für die Verdampfung THF.
  15. Legen Sie die Formen in den Vakuum-Trockenschrank für vorgegebene Aushärtezeit (ex. 24/36 / 48 h) bei 100 mTorr und 150 ° C für die Aushärtung PGS.
  16. Nach dem Aushärten nehmen Sie die Formen und platzieren sie bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Dip jeder Form, in der VE-Wasser mit vertikaler Position langsam. Nicht tauchen sie in das Wasser schnell, weil Luftblasen kann dazu führen, reißen das Schafott.
  17. Übertragen Sie die Formen in das Wasserbad vorsichtig und legen Sie sie in einem Winkel für 1 h mit Silikonschlauch zum HA leicht auflösen. Prüfen Sie, ob HA aus der Form gelöst ist. Wenn keine HA aus der Form gelöst wird, drücken Sie das eine Ende des Gerüsts langsam mit Spachtel, um es von der Form lösen. Wiederholen Sie diesen Schritt am anderen Ende des Gerüsts und schütteln Sie die Form hin und her langsam im Wasserbad. Prüfen Sie, ob das Gerüst im Inneren der Form bewegt wird.
  18. Übertragen Sie die Gerüst zu einem anderen Wasserbad mit Rührer sorgfältig. Versuchen Sie nicht das Gerüst fest, die das Gerüst knacken könnte. Legen Sie das Gerüst in das Wasserbad für mindestens 3 Tage mit wechselnden Wasser auslaugen Salzpartikel.
  19. Nach Auslaugen Salzpartikel, Transfer jedem Gerüst um die 15 ml Zentrifugenröhrchen mit dem VE-Wasser gefüllt und legen Sie sie in der Trockeneis-Box für 1 h zu frieren. Put Zentrifugenröhrchen in die Lyophilisator (alle Rohr Kabinen geöffnet werden muss) und lyophilisieren sie für 2 Tage.
  20. Legen Sie alle Gerüste in den Exsikkator vor, bis sie verwendet werden.

2. Scaffold Vorbereitung für Cell Seeding

  1. Nehmen Sie Gerüsten aus dem Exsikkator und schneiden Sie sie als 25-30mm Länge.
  2. Bereiten Sie zwei Silikon-Gummistopfen (Durchmesser = 20 mm, Wandstärke = 6,35 mm, mittlerer Durchmesser = 3 mm) und verbinden zwei PTFE-Schläuche (Außendurchmesser = 3,97 mm, Innendurchmesser = 2,38 mm, Wandstärke = 0,79 mm, Länge = 60 mm und 40 mm) durch die Mitte Löcher von jedem Anschlag.
  3. Schneiden Sie ein HS-Ring als 1,5 mm Länge und setzen Sie es auf ein Ende des Gerüsts. Schieben Sie eine PTFE-Schlauch (Silikon verbunden Gummistopfen) in das eine Ende des Gerüsts als kleine Schnittmenge wie möglich.
  4. Legen Sie die Gerüst-und PTFE-Schlauch in den Ofen bei 120 ° C für 10 min bis HS Ring schrumpfen. Prüfen Sie, ob HS Ring ist geschrumpft und Gerüste sind PTFE-Schlauch verbunden fest.
  5. Nehmen Sie die Gerüst-und PTFE-Schläuche und legen Sie sie bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Legen Sie die Gerüst-PTFE-Schlauch-Baugruppe in der Polycarbonat-Rohr (Außendurchmesser = 15,5 mm, Innendurchmesser = 9 mm, Länge = 50 mm) als Bioreaktor Kammer.
  6. Schließen Sie das andere Ende des PTFE-Schlauch zum Schafott als Schritte 2,3) und 2,4).
  7. Passen zwei Silikon Gummistopfen an ihren inneren Oberflächen an beiden Enden der Polycarbonat-Rohr befestigen. Befestigen Sie die beiden äußeren Oberflächen aus Silikon Gummistopfen mit zwei Aluminium-Legierung Platten (oben und unten, Breite = 20 mm, Länge = 70 mm, Dicke = 6,35 mm). Legen Sie zwei Gewindestangen in die seitliche Öffnung der Platte und befestigen Sie die Röhrchen aus Polycarbonat (im Lieferumfang enthalten das Gerüst innen) zu den Platten durch Anziehen Flügelmutter Schraube auf der Platte.
  8. Messen Sie die Länge der einzelnen seedable Gerüst (mit einer Länge zwischen zwei HS Ringe) und berechnen innere Oberfläche (π x Innendurchmesser x seedable Länge) jedes Gerüst für die Zell-Aussaat.
  9. Wickeln Sie ein Bioreaktor-Kammer-Anlage mit Alufolie und sterilisieren sie durch Autoklavieren bei 120 ° C für 30 min. Sterilisieren jedes Teil (mittel-Reservoir, Pumpe-Schlauch-, Gas-Wärmetauscher, Verteiler und Nadelventil) des Bioreaktors durch Autoklavieren bei 120 ° C für 30 min und montieren sie in der Zellkultur Kapuze.
  10. Pre-treat und spülen Gerüste mit einer Reihe von Infusionen (70, 50 und 25% Ethanol für 1 h-, Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS; Mediatech, Herndon, VA) für 2 h und SMC Kulturmedium für 24 h mit einer Schlauchpumpe bei 1,0 ml / min in den Fluss-Schaltung.

3. Zellaussaat und Kultur

  1. Isolieren primären arteriellen glatten Muskelzellen (SMC) von der Halsschlagadern von jugendlichen männlichen Pavianen (Papio Anubis) und kennzeichnen sie in zweidimensionale (2D) Kultur vor Passagierung und Aussaat, wie vorher beschrieben 9.
  2. Expand SMCs mit dem MCDB 131 Medium (Mediatech, Herndon, VA) mit 10% fötalem Rinderserum (Lonza, Walkersville, MD), 1% L-Glutamin (Mediatech), 50 pg / ml Ascorbinsäure (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), und eine Antibiotika-Antimykotika-Lösung (10.000 IE / ml Penicillin, 10.000 pg / ml Streptomycin und 25 ug / ml Amphotericin B; Mediatech).
  3. Lösen Sie jeden Bioreaktor Kammer von der Strömung Schaltung in den Bioreaktor. Seed SMCs (Passage 4-6), um das Gerüst mit einer Dichte von 2x10 6 Zellen / cm 2 durch die Injektion Suspension mit 5 ml-Spritze in das Lumen von Gerüsten nach dem Abschneiden beider abluminalen (Einlass) und luminalen (Ausgang) fließt.
  4. Legen Sie alle Bioreaktor Kammern in die Hybridisierung bei 37 ° C und drehen Sie sie um 2 min für 4 h, damit die Zellen gleichmäßig in das Gerüst verteilt.
  5. Nehmen Sie Bioreaktor Schränke aus der Hybridisierung Inkubator bringen Sie sie Schaltung des Bioreaktors in der Haube fließen. Übertragen Sie alle Bioreaktor-System in Zellkulturbrutschrank.
  6. Schließen Sie die Pumpe-Schlauch (Innendurchmesser = 1,6 mm), um den Knorpel der Schlauchpumpe und Last frischem Kulturmedium in das Reservoir. Starten Sie den durch-Wand-Perfusion (luminalen zu abluminalen) bei 1,0 ml / min für 15 min durch luminale Strömung nur gefolgt.
  7. Erhöhung der Strömungsgeschwindigkeit und Druck allmählich von 1,0 ml / min (luminalen Scherspannung: 1,1 Dyn / cm 2) und 20 mmHg am Tag 1 bis 14,2 ml / min (15,3 Dyn / cm 2) und 120 mmHg am Tag 21, bzw.. Ändern Sie den Pumpenschlauch (Innendurchmesser = 3,2 mm) an Tag 4 und das Medium einmal pro Woche.

4. Tissue Ernte und Probenvorbereitung für die Analyse

  1. Nach 21-Tage-Kultur, stoppen Sie die Pumpe und Schläuche Klemme (Einlass und Auslass) des Mediums Reservoir. Lösen Sie den Pumpenschlauch aus dem Knorpel der Schlauchpumpe und Transfer-Bioreaktor-System in der Motorhaube.
  2. Clamp Ein-und Auslass-Schläuche jeder Bioreaktor Kammer und nehmen Sie ihn aus dem Fluss-Schleife. Öffnen Sie den Zulaufschlauch und bereiten eine Petrischale am Ausgang Schlauch an Kulturmedium in der Polycarbonat-Röhrchens zu sammeln. Öffnen Sie den Ablaufschlauch langsam und entfernen Sie das Medium aus der Kammer.
  3. Lösen Sie abluminalen Gauge-Nadel und luminalen Silikonschlauch aus der Kammer und lösen Aluminiumplatten durch Loslassen Rändelschrauben. Entfernen Sie die Polycarbonat-Rohr und lösen Sie ein Ende des Gewebes Konstrukt aus dem PTFE-Schlauch.
  4. Bereiten Sie eine Petrischale mit 10 ml PBS gefüllt und lösen andere Ende des Konstrukts aus dem PTFE-Schlauch. Legen Sie bauen in die PBS und spülen dreimal.
  5. Schneiden Sie das Konstrukt mit einer Rasierklinge als 5-mm Länge. Frieren sie bei -80 ° C Gefrierschrank für biochemische Assays oder ihn an 15 ml Zentrifugenröhrchen mit 5 ml frisches Medium für mechanische Prüfungen oder Snap freeze in den Tissue-Tek optimale Schnittqualität Temperatur Verbindung (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA gefüllt ) für die Histologie / immunofluorescence Färbung.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Der röhrenförmige PGS Gerüste wurden unter Verwendung biologisch abbaubarer Elastomer, das durch Salz Fusion-Methode (Abb. 1A). Jeder Bioreaktor Kammer vorgesehen Gerüste mit beiden luminalen und abluminalen fließt und könnte als eine separate Einheit aus einem Hauptstrom-Schleife (Abb. 1B) gelöst werden. Bioreaktor-System wurde für die Kultivierung vier Gerüsten zu einer Zeit, durch die Steuerung und Überwachung von Durchflussmengen sowie Druck (Abb. 1C & D) entwickelt.

Schematische Darstellung des Bioreaktors Kultur wurde in Abb.. 2. Nach dem Impfen SMCs wurde jeder Bioreaktor Kammer gedreht bei 37 ° C für 4 h auf Zellen gleichmäßig zu verteilen in das Lumen des Gerüsts. Und dann war pulsatilen Fluss auf Gerüsten bis Tag 14 mit allmählich zunehmender Strömungsgeschwindigkeit (Abb. 2A) und Druck (Abb. 2B) angewendet. Nach Tag 14, gehalten Durchfluss und Druck bis zum Ende der Kultur (Tag 21) konstant.

Oberflächenmorphologie der PGS Gerüst wurde durch Rasterelektronenmikroskopie (SEM) untersucht. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass Gerüst hatte konsequente Wandstärken (539 ± 18 um) (Abb. 3A) und zufällig verteilten Makro-und Mikro-Poren auf der luminalen Oberfläche (Abb. 3B). Morphometrische Parameter des Gerüsts wurde aus welche unser Tomographie (Mikro-CT) und Imaging-Analyse gemessen. Die durchschnittliche Porengröße beträgt 23,3 ± 3,9 um und Poren Interkonnektivität beträgt 99,4 ± 0,62%, was bedeutet, dass alle Poren vollständig in Gerüst verbunden ist. Porosität von Ethanol Verschiebung gemessen beträgt 75,6 ± 2,7%.

Cellular Morphologie der PGS-Konstrukt wurde durch SEM (Abb. 4) untersucht. Mehrschichtige SMCs völlig der luminalen Oberfläche bedeckt und sie waren senkrecht orientierten zur Strömungsrichtung. Diese Ergebnisse zeigen, dass mechanische Konditionierung von pulsatilen Fluss Bioreaktor SMC Orientierung unterstützt in dem Schafott.

Die Anwesenheit der extrazellulären Matrix (ECM) und elastischen Fasern wurden von H & E-Färbung und Elastin Autofluoreszenz (Abb. 5) untersucht. H & E Färbung zeigte, dass Zellen und ECM Proteine ​​vollständig das Lumen des PGS abgedeckt konstruieren. Elastin Autofluoreszenz zeigten auch, den Umfang organisiert elastischen Fasern an der luminalen Oberfläche des Konstrukts. Produktion von ECM-Proteinen in PGS-Konstrukte wurden von biochemischen Assays gemessen. Die unlöslichen Elastin und Kollagen Inhalte waren 20,2 ± 9,1 pg / mg Gewebe und 6,3 ± 1,9 pg / mg Gewebe bzw..

Abbildung 1
Abbildung 1. Scaffold Herstellung und Bioreaktor-System. (A) Schematische Darstellung des röhrenförmigen Gerüst Fertigung. (B) Bioreaktor Kammer. Gerüste wurden PTFE-Schlauch verbunden, platziert in der Polycarbonat-Rohr eingesetzt und durch Silikon-Gummistopfen und Aluminium-Legierung Platten. Jede Kammer hat zwei Fließwege: luminalen (durch Silikonschlauch) und abluminalen (durch Nadel) fließt. (C) Bioreaktor-System in den Brutschrank gestellt. Es umfasst mittlere Reservoir, Schlauchpumpe Modul-, Gas-Wärmetauscher, Drucksensoren, zwei Verteiler (oben und unten), und Nadelventil. (D) Bioreaktor-System platziert außerhalb des Inkubators. Es umfasst Druck-Monitor, Flow Control Unit, Datenerfassung und-Computer.

Abbildung 2
Abbildung 2. Schematische Darstellung des Bioreaktors Kultur. (A) Kultur-Protokoll. (B) Applied Druckprofile zu jedem Zeitpunkt (Tag 1, 4, 7 und 14).

Abbildung 3
Abbildung 3. Oberflächenmorphologie der PGS Gerüst. (A) Querschnitt. (B) Lumen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Cellular Morphologie der PGS zu konstruieren. (A) Lumen. (B) Querschnitt von 45 ° schneiden. Arrows in beiden Figuren stellen die Fließrichtung.

Abbildung 5
Abbildung 5. Histologie und Elastin Autofluoreszenz der PGS zu konstruieren. (A) H & E Färbung. (B) Entsprechende Elastin Autofluoreszenz. L: Lumen. Vergrößerung: 40x. Maßstab: 50 pm.

Discussion

Die Herstellungstechnik mit einem biologisch abbaubaren Elastomer hier beschriebenen hat mehrere Funktionen. (1) Wir verwendeten Hyaluronsäure (HA) als Trennmittel. Da HA ist wasserlöslich, war Gerüst leicht von der Glasform nach Einweichen in Wasser gelöst. In diesem Bericht verwendeten wir 1,0 Gew. / Vol% der HA-Lösung, weil niedrige Konzentration (<0,5 wt / vol%) der Lösung ist nicht zähflüssig und fließt so schnell, als wir es in Strömen auf der Glasröhren. Zur Beschichtung HA-Lösung gleichmäßig, klappte die wir in den Glasröhren, wenn die Lösung flog der Unterseite der Schläuche und wiederholt diesen Schritt. Diese HA-Beschichtung ist eine kritische, um unsere Fertigung Verfahren zur Freigabe letzten Gerüste. (2) Wir verwendeten Schrumpfschlauch (HS) Hülse für die Beibehaltung Salze in den Glasröhren. Da Salze wurden dicht in den Raum zwischen der Innenwand der Glasröhren und die HS Ärmel gepackt, behielt HS Ärmel Salze nach dem Entfernen Dorn und PTFE-Ring in den Boden des Schlauchs. Wir konnten HS Ärmel leicht entfernen, indem man die Form in einem Ofen bei 120 ° C für 5 min, und dann bekommen röhrenförmigen Salz-Vorlagen. (3) Wir benutzten das Salz Fusion-Methode. Es ist bekannt, dass Salz Fusion-Methode kann Pore Interkonnektivität und die mechanischen Eigenschaften durch Variation fusion Zeit 10 zu verbessern. Darüber hinaus, da wir PGS verwendet wurden Makro-Poren, die durch das Salz Partikel während der Laugung Verfahren hergestellt, während die Mikroporen wurden wahrscheinlich durch Glycerin erzeugte Dampf gebildet während PGS Aushärtung wie wir vorher 11 beschrieben. So hat diese Methode das Potenzial, porösen röhrenförmigen Gerüsten mit verschiedenen Makro-und Mikro-Strukturen herzustellen durch Variation Salzpartikel sowie PGS Aushärtung Zustand.

Die mechanische Konditionierung aus dem Bioreaktor hat pulsatilen Fluss Perfusion zur Verfügung gestellt (maximale mittlere Durchfluss = 14 ml / min, maximale Schubspannung = 15,3 dyn / cm 2, Frequenz = 0,5 bis 1,7 Hz) und physiologisch relevanten Druck mit dem PGS Gerüst, das dazu geführt, SMC Wachstum und Orientierung (Abb. 4). Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Studien berichten, dass zyklische Dehnung bei dieser Frequenz und Schubspannung erhöht SMC-Proliferation 12 und ECM Proteinproduktion 13,14. Zusätzlich zu SMC Wachstum und Orientierung, PGS ECM Protein-Produktion unterstützt zu konstruieren, insbesondere den Umfang elastischen Fasern (Abb. 5) innerhalb von 3-Wochen-Kultur im Bioreaktor organisiert. Einige Studien unter Verwendung eines elastomeren Gerüst als kleinem Durchmesser arteriellen konstruieren, mechanische Festigkeit und Berstdruck vergleichbar mit nativen Arterien 15, und eine schnelle Integration in SMC-konform Gerüste mit Spinnerflasche 16,17 gezeigt, während keine elastischen Fasern in diesen Konstrukten gefunden wurden. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass zyklische radiale Ausdehnung aus dem Bioreaktor verbesserte mechanische Signalübertragung effizienter zu SMCs in PGS Gerüst, was wahrscheinlich dazu beigetragen, Synthese und Organisation Elastin.

Da vaskuläre SMCs waren die einzigen Zellen, die ECM-Proteine ​​in unserem Ansatz, Ruhestrom Endothel produziert und Verbesserung der mechanischen Festigkeit sind notwendig, um eine klinisch erfolgreiche kleinem Durchmesser arteriellen Konstrukte zu entwickeln. Wir haben berichtet, dass Endothelzellen mit SMCs erwirtschaftete einen Monolayer und unterstützt Phänotyp-Protein-Expression unter unseren Kulturbedingungen und mechanischen Konditionierung 9 Co-kultiviert. Deshalb, basierend auf unserem Ansatz hier beschriebenen Modifikation der Co-Kultur Versuchsbedingungen wäre ein nächster Schritt, um die Funktionen der daraus resultierenden Konstrukte zu verbessern und zu generieren nonthrombogenic, robust sein und konform arteriellen Konstrukt ähnlich nativen Arterien.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Der Autor dankt Dr. Jin Gao für PGS-Synthese, Dr. Peter Crapo für aufschlussreiche Diskussion für Bioreaktor-Setup, Drs. Mohamed Ezzelarab und Wei Wu für Explantation Pavian Halsschlagadern. Diese Studie wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health (R01 HL089658) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hyaluronic acid sodium salt Sigma-Aldrich H7630
Tetrahydrofuran Sigma-Aldrich 401757
MCDB 131 Mediatech, Inc. 15-100-CV
Fetal bovine serum Lonza Inc. BW14-502F
L-glutamine Mediatech, Inc. 25-005-CV
Ascorbic acid Fisher Scientific A62-500
Antibiotic-antimycotic solution Mediatech, Inc. 30-004-CI
Phosphate Buffered Saline (PBS) Mediatech, Inc. 21-031-CV
Tissue-Tek optimal cutting temperature compound, 4583 Sakura Finetek 25608-930

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References

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Lee, K., Wang, Y. Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (50), e2691, doi:10.3791/2691 (2011).More

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