Summary
संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के साथ एक काँपने के गुणवाला प्रवाह bioreactor में सभ्य elastomeric PGS scaffolds देशी ECM उत्पादन के साथ एक अपेक्षाकृत कम संस्कृति की अवधि में होनहार छोटे व्यास धमनी constructs के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
Protocol
1. ट्यूबलर पाड़ निर्माण
- पाड़ के लिए एक साँचे में ढालना के रूप में. ग्लास टयूबिंग (लघु पार्ट्स, Miramar, FL लंबाई = 70 मिमी, बाहरी व्यास = 9.0 मिमी, दीवार मोटाई = 1.0 मिमी) तैयार
- विआयनीकृत पानी की 10 मिलीलीटर में हा की 100 मिलीग्राम भंग करके 1.0 wt / खंड% hyaluronic एसिड (हा) (सिग्मा Aldrich, सेंट लुइस, MO) तैयार करें. एक रातोंरात अंग को घुमानेवाली पेशी का उपयोग कर जब तक वहाँ समाधान में कोई हवाई बुलबुले हैं मिक्स.
- ग्लास टयूबिंग के शीर्ष में 1.0%, हा समाधान डालो. चलो यह आचारण के भीतरी दीवार के साथ धीरे धीरे नीचे प्रवाह. टयूबिंग पर पलटें जब समाधान अंग को घुमानेवाली पेशी का उपयोग कर मोल्ड के नीचे पहुँच गए और इस कदम दोहराएँ जब तक आचारण के भीतरी दीवार में समान रूप से समाधान द्वारा लेपित है.
- कोटिंग के बाद, 37 पर वैक्यूम ओवन ° सी में 24 एच. के लिए सभी ग्लास tubings सूखी
- पीस और चलनी नमक कणों (आकार सुक्ष्ममापी 25-32 =) porogens के रूप में इस्तेमाल किया.
- एक गिलास (1.0%, हा समाधान अंदर के साथ लेपित) टयूबिंग, खराद का धुरा (स्टेनलेस स्टील PTFE ट्यूबिंग द्वारा encased), गर्मी shrinkable आस्तीन (एचएस), और PTFE की अंगूठी के रूप में 8 पहले से वर्णित इकट्ठे .
- कांच सिलिकॉन रबर कीप के माध्यम से एक रंग का उपयोग कर मोल्ड करने के लिए इच्छित आकार का नमक कणों जोड़ें. मोल्ड धीरे ठोकर नमक कणों का भी वितरण सुनिश्चित. रंग की ओर का उपयोग कर मोल्ड के शीर्ष भर में अतिरिक्त नमक कणों परिमार्जन.
- मोल्ड नमक पैक को स्थानांतरित करने से पहले 30 मिनट के लिए संकरण इनक्यूबेटर पर मुड़ें. संकरण इनक्यूबेटर मुड़ें और संकरण इनक्यूबेटर में नमक संलयन के लिए नमक - पैक मोल्ड रखो.
- संकरण इनक्यूबेटर से molds निकालें और 37 में वैक्यूम ओवन में उन्हें सूखी ° C 24 एच. के लिए
- नमक पैक molds वैक्यूम ओवन से निकालें और उन्हें कमरे के तापमान पर ठंडा करने के लिए अनुमति देते हैं. यह PTFE अंगूठी धारण के साथ नीचे धक्का द्वारा स्टेनलेस स्टील खराद का धुरा निकालें. यदि खराद का धुरा भी मोल्ड करने के लिए तंग है, सुई सरौता का उपयोग करने के लिए इसे बाहर खींच. आचारण के नीचे से PTFE अंगूठी निकालें.
- 120 में डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए ओवन में molds एचएस आस्तीन हटना करने के लिए रखो. जाँच करें अगर एचएस आस्तीन सिकुड़ है. एचएस आस्तीन नमक पैक molds से निकालें और उन्हें कमरे के तापमान पर ठंडा करने के लिए अनुमति देते हैं. Dessicator में molds के रखें जब तक वे उपयोग किया जाता है.
- Tetrahydrofuran के 15 मिलीलीटर (THF) (सिग्मा Aldrich, सेंट लुइस, MO) में PGS के 3 ग्राम भंग करने के लिए एक 20 wt / खंड% समाधान फार्म द्वारा PGS समाधान तैयार है.
- नमक पैक molds के लुमेन के लिए इसे छोड़ने हमे हुड में एक spoid का उपयोग करके PGS समाधान जोड़ें. 45 ° के बारे में गिलास ढालना झुक और भीतरी लुमेन में ढालना धीरे घूर्णन के साथ PGS समाधान ड्रॉप. जाँच करें अगर PGS समाधान मोल्ड के दीवार के साथ नीचे बहती है. यदि शुष्क स्थान में मनाया जाता है, अधिक समाधान जोड़ें.
- PGS समाधान जोड़ने के बाद, हमे हुड में THF evaporating के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए नए नए साँचे जगह.
- पूर्व निर्धारित इलाज समय के लिए वैक्यूम ओवन (उदा. 24 / 36 / 48 घंटे) में 100 mTorr और 150 डिग्री सेल्सियस इलाज PGS के लिए molds रखो.
- इलाज करने के बाद, molds के बाहर ले और उन्हें कमरे के तापमान पर जगह शांत. ऊर्ध्वाधर स्थिति धीरे धीरे के साथ विआयनीकृत जल में डुबकी प्रत्येक मोल्ड. उन्हें पानी तेजी में डुबकी क्योंकि हवा बुलबुले पाड़ आंसू कारण हो सकता है मत करो.
- पानी के स्नान के लिए नए नए साँचे ध्यान से स्थानांतरण और उन्हें 1 सिलिकॉन ट्यूब का उपयोग करने के लिए हा आसानी से भंग घंटे के लिए एक कोण पर जगह है. जाँच करें अगर हा मोल्ड से भंग कर रहा है. यदि कोई हा मोल्ड से जारी है, पाड़ के एक छोर से धीरे धीरे रंग का उपयोग करने के लिए यह मोल्ड से जारी धक्का. पाड़ के अन्य अंत में इस चरण को दोहराएँ और मोल्ड पानी के स्नान में धीरे धीरे आगे और पीछे हिला. जाँच करें अगर पाड़ मोल्ड के अंदर ले जाया जाता है.
- दोषी के साथ एक पानी स्नान ध्यान से पाड़ स्थानांतरण. मजबूती पाड़, जो पाड़ दरार सकता है हड़पने मत करो. नमक कणों बाहर नमकीन पानी के लिए पानी को बदलने के साथ कम से कम 3 दिनों के लिए पानी के स्नान में पाड़ प्लेस.
- नमक कणों बाहर leaching के बाद, 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र विआयनीकृत जल से भरा ट्यूब प्रत्येक पाड़ हस्तांतरण और उन्हें सूखी बर्फ बॉक्स में 1 घंटे के लिए फ्रीज के लिए जगह है. Lyophilizer (सभी ट्यूब cabs खोला जाना चाहिए) अपकेंद्रित्र ट्यूबों में रखो और उन्हें 2 दिनों के लिए lyophilize.
- Dessicator में जब तक वे उपयोग किया जाता है से पहले सभी scaffolds रखो.
2. पाड़ सेल बोने के लिए तैयार
- बाहर dessicator से scaffolds ले लो और उन्हें की लंबाई 25-30mm के रूप में कटौती.
- दो सिलिकॉन रबड़ stoppers (व्यास = 20 मिमी, दीवार मोटाई = 6.35 मिमी, मध्यम छेद व्यास = 3 मिमी) तैयार है और दो PTFE tubings (बाहरी व्यास = 3.97 मिमी भीतरी व्यास कनेक्ट = 2.38 मिमी, दीवार मोटाई = 0.79 मिमी, लंबाई = 60 मिमी और प्रत्येक डाट के बीच छेद के माध्यम से 40 मिमी).
- एक 1.5 मिमी की लंबाई के रूप में एक एच एस अंगूठी कट और यह पाड़ के एक छोर की शीर्ष पर डाल दिया. संभव के रूप में छोटे अतिव्यापी भाग के रूप में एक पाड़ के अंत में एक PTFE ट्यूबिंग (सिलिकॉन रबड़ डाट जुड़ा है) पुश.
- ओवन में 120 पर पाड़ और PTFE ट्यूबिंग डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए एच एस अंगूठी हटना करने के लिए रखो. जाँच करें अगर एचएस अंगूठी सिकुड़ है और scaffolds PTFE ट्यूबिंग से जुड़े रहे हैं दृढ़ता.
- पाड़ और PTFE ट्यूबिंग ले लो और उन्हें कमरे के तापमान पर जगह शांत. Polycarbonate (बाहरी व्यास = 15.5 मिमी भीतरी व्यास = 9 मिमी लंबाई, = 50 मिमी) ट्यूब एक bioreactor चैम्बर के रूप में टयूबिंग पाड़ PTFE विधानसभा रखो.
- पाड़ के लिए 2.3 कदम) और 2.4) के रूप में PTFE टयूबिंग की एक और अंत कनेक्ट.
- दो सिलिकॉन रबड़ stoppers समायोजित polycarbonate ट्यूब के दोनों सिरों को अपने भीतरी सतहों को देते हैं. (, चौड़ाई = 20 मिमी लम्बाई, मिमी = 70, मोटाई = 6.35 मिमी ऊपर और नीचे) दो एल्यूमीनियम मिश्र धातु प्लेटें सिलिकॉन रबड़ stoppers के दोनों बाहरी सतहों संलग्न. थाली की ओर छेद में दो लड़ी पिरोया rods रखो और प्लेटों के लिए थाली पर अंगूठे नट पेंच कस द्वारा polycarbonate ट्यूब (पाड़ अंदर शामिल) तय.
- Seedable लंबाई (दो एचएस छल्ले के बीच लंबाई) प्रत्येक पाड़ के उपाय और प्रत्येक पाड़ की अंदरूनी सतह (π x भीतरी व्यास x seedable लंबाई) सेल बोने के लिए क्षेत्र की गणना.
- लपेटें एल्यूमीनियम पन्नी के साथ एक bioreactor चैम्बर इकाई है और यह 120 ° 30 मिनट के लिए सी में autoclaving बाँझ. 30 मिनट के लिए 120 ° C पर autoclaving bioreactor के प्रत्येक भाग (मध्यम जलाशय, पंप टयूबिंग, गैस एक्सचेंजर, manifolds, और सुई वाल्व) जीवाणुरहित और उन्हें सेल संस्कृति हुड के अंदर इकट्ठा.
- पूर्व इलाज के लिए और perfusions की एक श्रृंखला (70, 50, और 25% इथेनॉल 1 घंटे के लिए, खारा (पीबीएस फॉस्फेट बफर के साथ कुल्ला scaffolds Mediatech;, Herndon, VA) 2 के लिए घंटे, और 24 घंटे के लिए एसएमसी संस्कृति के माध्यम का उपयोग करके 1.0 मिलीलीटर / प्रवाह सर्किट में मिनट में एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप.
3. सेल बोने और संस्कृति
- किशोर पुरुष बबून्स (Papio Anubis) के मन्या धमनियों से प्राथमिक धमनियों चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (SMCs) को अलग करने और उन्हें दो आयामी (2d) संस्कृति में चिह्नित पहले passaging और बोने के रूप में 9 पहले से वर्णित है.
- विस्तार के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (Lonza, Walkersville, एमडी), 1% एल glutamine (Mediatech), 50 / μg मिलीलीटर ascorbic एसिड (फिशर साइंटिफिक, फेयर लॉन MCDB 131 मध्यम (Mediatech, Herndon, VA) का उपयोग कर SMCs, न्यू जर्सी), और एक एंटीबायोटिक antimycotic समाधान (10,000 IU / मिलीलीटर पेनिसिलिन, +१०,००० μg / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 25 μg / मिलीलीटर amphotericin बी; Mediatech).
- Bioreactor में प्रवाह सर्किट से प्रत्येक bioreactor चैम्बर अलग. पाड़ के बीज (4-6 बीतने) 5 मिलीलीटर सिरिंज के साथ बंद दोनों (प्रवेश) abluminal और luminal प्रवाह (आउटलेट) काटने के बाद scaffolds के लुमेन में निलंबन इंजेक्शन द्वारा 2x10 6 कोशिकाओं / 2 सेमी की एक घनत्व के साथ SMCs .
- संकरण इनक्यूबेटर में सभी bioreactor कक्षों 37 डिग्री सेल्सियस पर रखो और उन्हें 4 घंटे के लिए 2 rpm पर बारी बारी से करने के लिए कोशिकाओं को समान रूप से पाड़ में प्रसार करने के लिए अनुमति देते हैं.
- संकरण इनक्यूबेटर उन्हें पुनः अनुलग्न से bioreactor कक्षों bioreactor के हुड में सर्किट प्रवाह ले लो. सेल संस्कृति इन्क्यूबेटर में सभी bioreactor प्रणाली स्थानांतरण.
- क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के उपास्थि के लिए पंप टयूबिंग (भीतरी व्यास = 1.6 मिमी) कनेक्ट और जलाशय में ताजा संस्कृति के माध्यम लोड. 1.0 मिलीग्राम / केवल luminal प्रवाह द्वारा पीछा किया 15 मिनट के लिए मिनट में छिड़काव के माध्यम से दीवार (luminal abluminal के लिए) शुरू करो.
- और दिन पर 20 mmHg: 1 करने के लिए 14,2 मिलीग्राम / मिनट (15.3 dynes / 2 सेमी) और 21 दिन पर 120 mmHg क्रमशः प्रवाह दर और दबाव धीरे - धीरे 1.0 मिलीग्राम / मिनट से (1.1 dynes / 2 सेमी luminal कतरनी तनाव) बढ़ाएँ. (भीतरी व्यास = 3.2 मिमी) 4 दिन में पंप टयूबिंग और सप्ताह में एक बार हर माध्यम बदलें.
4. ऊतक फसल काटने वाले और विश्लेषण के लिए नमूना तैयार
- 21 दिन की संस्कृति के बाद, और मध्यम जलाशय के पंप दबाना tubings (Inlet और आउटलेट) बंद करो. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप और हुड में हस्तांतरण bioreactor प्रणाली के उपास्थि से अलग पंप टयूबिंग.
- प्रत्येक bioreactor चैम्बर के Inlet और आउटलेट tubings दबाना और यह प्रवाह पाश से अलग. इनलेट टयूबिंग खोलें और आउटलेट टयूबिंग पर एक पेट्री डिश तैयार करने के लिए polycarbonate ट्यूब अंदर संस्कृति के माध्यम एकत्र. आउटलेट टयूबिंग धीरे खोलें और चैम्बर से मध्यम हटायें.
- चैम्बर से abluminal गेज सुई और luminal सिलिकॉन टयूबिंग अलग और अंगूठे screws को रिहा द्वारा एल्युमिनियम प्लेटें अलग. Polycarbonate ट्यूब निकालें और ऊतक के एक छोर अलग PTFE टयूबिंग से निर्माण.
- एक पीबीएस के 10 मिलीलीटर से भरा पेट्री पकवान तैयार है और PTFE टयूबिंग से निर्माण के दूसरे छोर अलग. पीबीएस में निर्माण और तीन बार कुल्ला रखो.
- 5 मिमी की लंबाई के रूप में एक धार के साथ कट का निर्माण. यह जैव रासायनिक परख के लिए -80 ° सी फ्रीजर में रुक या 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र यांत्रिक परीक्षण के लिए या ऊतक टेक इष्टतम काटने तापमान यौगिक (Sakura Finetek इंक, Torrance, CA में तस्वीर फ्रीज ताजा माध्यम के 5 मिलीलीटर से भरा ट्यूब को हस्तांतरण ) के लिए / ऊतक विज्ञान immunofluorescence धुंधला हो जाना.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
ट्यूबलर PGS scaffolds नमक संलयन विधि (छवि 1A) द्वारा biodegradable elastomer का उपयोग कर गढ़े गए थे. प्रत्येक bioreactor चैम्बर दोनों luminal और abluminal प्रवाह के साथ scaffolds प्रदान की है और एक मुख्य प्रवाह पाश (छवि 1B) से एक अलग इकाई के रूप में अलग किया जा सकता है. Bioreactor प्रणाली संवर्धन चार scaffolds के लिए एक समय को नियंत्रित करने और प्रवाह के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दबाव (छवि 1C एवं विकास) की निगरानी के द्वारा डिजाइन किया गया था.
Bioreactor संस्कृति के योजनाबद्ध चित्र में दिखाया गया था. 2. SMCs बोने के बाद, प्रत्येक bioreactor कक्ष 37 में घुमाया था ° C 4 कोशिकाओं पाड़ के लुमेन में समान रूप से वितरित घंटे के लिए. और फिर, काँपने के गुणवाला प्रवाह धीरे धीरे बढ़ती प्रवाह की दर (छवि 2A) और दबाव (छवि 2B) के साथ 14 दिन तक scaffolds के लिए लागू किया गया था. 14 दिन के बाद है, प्रवाह और दबाव संस्कृति (21 दिन) के अंत तक स्थिर रखा.
PGS पाड़ के भूतल आकारिकी स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) के द्वारा जांच की गई थी. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन micrographs से पता चला है कि पाड़ था संगत दीवार (539 ± 18 सुक्ष्ममापी) thicknesses (छवि 3A) और बेतरतीब ढंग से luminal सतह (3B छवि) पर स्थूल और सूक्ष्म है pores वितरित. पाड़ के Morphometric मानकों microcomputed (सूक्ष्म सीटी) टोमोग्राफी और इमेजिंग विश्लेषण से मापा गया था. औसत रोमकूप आकार 23.3 ± 3.9 सुक्ष्ममापी और ताकना interconnectivity 99.4 ± 0.62% है, जिसका अर्थ है कि सभी pores के पूरी तरह से पाड़ में जुड़े रहते हैं. इथेनॉल विस्थापन द्वारा मापा porosity 75.6 ± 2.7% है.
PGS निर्माण के सेलुलर आकारिकी SEM (4 छवि) द्वारा जांच की गई थी. Multilayered SMCs पूरी तरह से luminal सतह को कवर किया और वे लंबरूप प्रवाह की दिशा के लिए उन्मुख थे. ये परिणाम दिखाते हैं कि काँपने के गुणवाला प्रवाह bioreactor से यांत्रिक कंडीशनिंग पाड़ में एसएमसी अभिविन्यास का समर्थन करता है.
बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) और लोचदार फाइबर की उपस्थिति एच एंड ई धुंधला हो जाना और elastin autofluorescence (5 छवि) द्वारा जांच की गई. एच एंड ई धुंधला दिखा दिया कि कोशिकाओं और ECM प्रोटीन पूरी तरह PGS के लुमेन कवर निर्माण. Elastin autofluorescence भी निर्माण के luminal सतह पर circumferentially संगठित लोचदार फाइबर दिखाया. PGS constructs में ECM प्रोटीन का उत्पादन जैव रासायनिक assays से मापा गया. अघुलनशील elastin और कोलैजेन सामग्री 20.2 ± 9.1 μg / ऊतक और 6.3 मिलीग्राम की ± 1.9 / ऊतक के μg मिलीग्राम, क्रमशः थे.
चित्रा 1. पाड़ निर्माण और bioreactor प्रणाली. (ए) ट्यूबलर पाड़ निर्माण के योजनाबद्ध. (बी) bioreactor कक्ष. Scaffolds PTFE ट्यूबिंग जुड़े हुए थे, polycarbonate ट्यूब में रखा, और सिलिकॉन रबड़ stoppers और एल्यूमीनियम मिश्र धातु प्लेटें के द्वारा तय. : प्रत्येक कक्ष में दो प्रवाह पथ (सिलिकॉन टयूबिंग द्वारा) luminal और abluminal (गेज सुई द्वारा) बहती है. (सी) bioreactor इनक्यूबेटर अंदर रखा प्रणाली. यह मध्यम जलाशय, क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप मॉड्यूल, गैस एक्सचेंजर, दबाव transducers, दो manifolds (ऊपर और नीचे), और सुई वाल्व शामिल हैं. (डी) bioreactor प्रणाली इनक्यूबेटर बाहर रखा. यह प्रेशर मॉनीटर, प्रवाह नियंत्रण इकाई, डाटा अधिग्रहण प्रणाली, और कंप्यूटर शामिल हैं.
चित्रा 2 bioreactor संस्कृति के योजनाबद्ध. (ए) संस्कृति प्रोटोकॉल. (बी) हर बार बिंदु (1 दिन, 4, 7, और 14) पर दबाव प्रोफाइल एप्लाइड.
चित्रा 3. PGS पाड़ के भूतल आकारिकी. (ए) क्रॉस अनुभाग. (बी) लुमेन.
चित्रा 4 PGS के सेलुलर आकारिकी का निर्माण . (ए) लुमेन. (बी) 45 ° कटौती के क्रॉस अनुभाग. दोनों आंकड़े में तीर प्रवाह दिशा का प्रतिनिधित्व करते हैं.
चित्रा 5. प्रोटोकॉल और elastin PGS के autofluorescence निर्माण. (ए) एच एंड ई धुंधला हो जाना. (बी) इसी elastin autofluorescence. एल: लुमेन. आवर्धन: 40x. स्केल पट्टी: 50 सुक्ष्ममापी.
Discussion
निर्माण तकनीक का उपयोग कर एक biodegradable यहाँ वर्णित elastomer कई विशेषताएं है. (1) एक साँचे में ढालना रिलीज hyaluronic एसिड (हा) के रूप में इस्तेमाल किया. चूंकि हा पानी घुलनशील है, पाड़ आसानी से यह पानी में भिगोने के बाद गिलास ढालना से जारी है. इस रिपोर्ट में, हम 1.0% / wt खंड हा समाधान के इस्तेमाल क्योंकि समाधान की कम एकाग्रता (<0.5% / wt खंड) चिपचिपा नहीं है और नीचे बहता है इतनी तेजी से जब हम यह ग्लास टयूबिंग के शीर्ष पर गिरने. कोट हा समाधान करने के लिए समान रूप से, हम ग्लास टयूबिंग खत्म रूप से फ़्लिप जब समाधान टयूबिंग के नीचे उड़ गए और इस कदम को दोहराया. यह हा कोटिंग अंतिम scaffolds रिहा करने के लिए हमारे निर्माण प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है. (2) हम ग्लास टयूबिंग में लवण को बनाए रखने के लिए गर्मी shrinkable आस्तीन (एचएस) का इस्तेमाल किया. चूंकि लवण घनी ग्लास टयूबिंग और एचएस आस्तीन के भीतरी दीवार के बीच अंतरिक्ष में खचाखच भरे थे, एच एस आस्तीन टयूबिंग के नीचे में खराद का धुरा और PTFE की अंगूठी को हटाने के बाद लवण बनाए रखा. हम आसानी से एक ओवन में 120 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए मोल्ड में डाल द्वारा एच एस आस्तीन सकता है निकालने के लिए, और फिर मिल ट्यूबलर नमक टेम्पलेट्स. (3) हम नमक संलयन विधि का इस्तेमाल किया. यह सर्वविदित है कि नमक संलयन विधि संलयन समय 10 अलग ताकना interconnectivity और यांत्रिक गुणों में सुधार कर सकते हैं. इसके अलावा, के बाद से हम PGS इस्तेमाल किया, मैक्रो - pores के leaching की प्रक्रिया के दौरान नमक कणों द्वारा उत्पादित थे, जबकि सूक्ष्म है pores की संभावना ग्लिसरॉल वाष्प द्वारा उत्पन्न थे इलाज के रूप में हम पहले 11 में वर्णित PGS के दौरान गठित . इस प्रकार, इस पद्धति का एक अलग स्थूल और सूक्ष्म संरचनाओं के साथ नमक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कणों हालत इलाज PGS अलग से झरझरा ट्यूबलर scaffolds बनाना क्षमता है.
bioreactor से यांत्रिक कंडीशनिंग काँपने के गुणवाला प्रवाह छिड़काव प्रदान की गई है (अधिकतम प्रवाह मतलब = 14 मिलीग्राम / मिनट, अधिकतम कतरनी तनाव = 15.3 Dyne / 2 सेमी, आवृत्ति = 0,5 - 1,7 हर्ट्ज) और physiologically PGS पाड़, जो करने के लिए नेतृत्व के साथ प्रासंगिक दबाव एसएमसी विकास और ओरिएंटेशन (4 छवि). इन परिणामों पिछले अध्ययनों कि इस आवृत्ति में चक्रीय खिंचाव रिपोर्टिंग और कतरनी तनाव एसएमसी 12 प्रसार, और ECM प्रोटीन 13,14 उत्पादन बढ़ जाती है के साथ संगत कर रहे हैं. एसएमसी विकास और उन्मुखीकरण के अलावा, PGS ECM प्रोटीन के उत्पादन समर्थित निर्माण, विशेष रूप से 3 सप्ताह की संस्कृति के भीतर circumferentially लोचदार फाइबर (छवि 5) bioreactor में संगठित है. कुछ एक छोटे व्यास धमनियों का निर्माण के रूप में एक elastomeric पाड़ का उपयोग अध्ययन यांत्रिक शक्ति और फट देशी 15 धमनियों, और अनुरूप स्पिनर 16,17 कुप्पी का उपयोग scaffolds में तेजी एसएमसी एकीकरण करने के लिए तुलनीय दबाव दिखा दिया है, जबकि कोई लोचदार फाइबर इन constructs में पाए गए. हमारे परिणाम बताते हैं कि bioreactor से चक्रीय रेडियल बढ़ाव यांत्रिक संकेत transduction और अधिक प्रभावी ढंग से SMCs PGS पाड़, जो की संभावना के संश्लेषण और संगठन elastin के योगदान में सुधार.
चूंकि संवहनी SMCs है कि हमारे दृष्टिकोण, मौन endothelium में ECM प्रोटीन का उत्पादन और यांत्रिक शक्ति में सुधार के एक नैदानिक सफल छोटे व्यास धमनी constructs विकसित करने के लिए आवश्यक हैं केवल कोशिकाओं थे. हमें सूचित किया है कि endothelial कोशिकाओं मिला हुआ है और हमारी संस्कृति शर्तों और यांत्रिक 9 कंडीशनिंग के तहत समर्थित phenotype प्रोटीन अभिव्यक्ति monolayer उत्पन्न SMCs के साथ सह - सुसंस्कृत. इसलिए, हमारे दृष्टिकोण के आधार पर यहाँ वर्णित, सह संस्कृति प्रयोग की शर्तों का संशोधन अगले कदम परिणामी constructs के कार्यों में सुधार और nonthrombogenic मजबूत उत्पन्न होगा, और आज्ञाकारी धमनी देशी धमनियों की तरह का निर्माण.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखक डा. जिन गाओ PGS संश्लेषण, bioreactor सेटअप, डीआरएस के लिए व्यावहारिक चर्चा के लिए डॉ. पीटर Crapo के लिए धन्यवाद. मोहम्मद Ezzelarab और लंगूर मन्या धमनियों explanting के लिए वी वू. इस अध्ययन के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (HL089658 R01) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H7630 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
| MCDB 131 | Mediatech, Inc. | 15-100-CV | |
| Fetal bovine serum | Lonza Inc. | BW14-502F | |
| L-glutamine | Mediatech, Inc. | 25-005-CV | |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A62-500 | |
| Antibiotic-antimycotic solution | Mediatech, Inc. | 30-004-CI | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Mediatech, Inc. | 21-031-CV | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature compound, 4583 | Sakura Finetek | 25608-930 |
References
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