Summary
PGS elastomérico andamios con células musculares lisas vasculares cultivadas en un biorreactor de flujo pulsátil puede llevar a prometedores de pequeño diámetro arterial construye con la producción de ECM nativa en un período de cultivo relativamente corto.
Abstract
La enfermedad cardiovascular es una de las principales causas de mortalidad en los EE.UU. y, sobre todo, la enfermedad coronaria aumenta con envejecimiento de la población y aumento de la obesidad 1. En la actualidad, la cirugía de bypass utilizando vasos autólogos, los aloinjertos, injertos sintéticos y que se conoce como un uso común de los sucedáneos de 2 arterial. Sin embargo, estos injertos tienen aplicaciones limitadas cuando un diámetro interior de las arterias es inferior a 6 mm, debido a la escasa disponibilidad, las complicaciones trombóticas, el desajuste de cumplimiento, y la hiperplasia de la íntima finales de 3,4. Para superar estas limitaciones, la ingeniería de tejidos ha sido aplicado con éxito como una alternativa prometedora para el desarrollo de pequeño diámetro que se construye arterial nonthrombogenic, robusto y compatible. Varios estudios previos han desarrollado estructuras de pequeño diámetro arterial con tri-laminar estructura, excelentes propiedades mecánicas y la presión de rotura comparables a las arterias nativas 5,6. Mientras que la fuerza de alta resistencia y presión de ruptura mediante el aumento de la producción de colágeno a partir de un material rígido o células hoja de andamio, estas construcciones aún tenía bajo la producción de elastina y el cumplimiento, que es un problema importante para causar el fracaso del injerto después de la implantación. Teniendo en cuenta estas cuestiones, la hipótesis de que un biomaterial elastoméricas combinadas con acondicionamiento mecánico que proporcionan elasticidad y llevar a cabo las señales mecánicas de manera más eficiente a las células vasculares, que aumentan la producción de matriz extracelular y apoyar la orientación celular.
El objetivo de este informe es presentar una técnica de fabricación de andamios tubulares porosa y un condicionamiento mecánico dinámico para su aplicación a la ingeniería de tejido arterial. Se utilizó un elastómero biodegradables poli (sebacato de glicerol) (PGS) 7 para la fabricación de andamios tubulares porosa del método de fusión de sal. Células adultas de la primaria babuino del músculo liso (SMC) se sembraron en el lumen de los andamios, que se cultivan en nuestro biorreactor diseñado flujo pulsátil durante 3 semanas. Andamios PGS había espesor constante y una distribución aleatoria de macro y micro-poros. Acondicionamiento mecánico del bioreactor de flujo pulsátil SMC apoya la orientación y la mayor producción de MEC en los andamios. Estos resultados sugieren que los andamios de elastómero y el acondicionamiento mecánico de la cultura biorreactor puede ser un método prometedor para la ingeniería de tejidos arteriales.
Protocol
1. Andamio tubular de fabricación
- Preparar un tubo de vidrio (longitud = 70 mm, diámetro externo = 9,0 mm, espesor de pared = 1,0 mm, piezas pequeñas, Miramar, FL) como molde para andamio.
- Prepare 1,0 wt / vol% de ácido hialurónico (HA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) mediante la disolución de 100 mg de HA en 10 ml de agua destilada. Mezclar con un rotor de la noche hasta que no queden burbujas de aire en la solución.
- Vierta 1,0% solución de alta en la parte superior del tubo de vidrio. Deja que fluya lentamente a lo largo de la pared interior del molde. Dé la vuelta a la tubería cuando la solución alcanza el fondo del molde con el rotador y repetir este paso hasta que la pared interior del molde es uniformemente recubiertos por la solución.
- Después del recubrimiento, en seco todos los tubos de vidrio en el horno al vacío a 37 ° C durante 24 h.
- Molienda y las partículas de sal tamiz (size = 25-32 micras), utilizado como porogens.
- Montar un tubo de vidrio (en el interior recubierto con HA 1,0% solución), el mandril (de acero inoxidable recubierto por un tubo de PTFE), termorretráctiles manga (SA), y el anillo de PTFE como se describió anteriormente 8.
- Añadir las partículas de sal del tamaño deseado para el molde de vidrio con una espátula a través del embudo de caucho de silicona. Toque en el molde con cuidado para garantizar una distribución uniforme de partículas de sal. Raspar las partículas de sal en exceso en la parte superior del molde con el lado de la espátula.
- A su vez en la hibridación incubadora durante 30 minutos antes de transferir el molde lleno de sal. Apague la hibridación incubadora y poner la sal llena de moho en la hibridación incubadora para la fusión de la sal.
- Retire los moldes de la hibridación incubadora y secarlos en el horno de vacío a 37 ° C durante 24 h.
- Retire el molde lleno de sal de la estufa de vacío y permita que se enfríen a temperatura ambiente. Retire el mandril de acero inoxidable, presionando hacia abajo con la celebración del anillo de PTFE. Si el mandril es demasiado estrecho para el molde, utilice el alicates para tirar de él hacia fuera. Retire el anillo de PTFE desde el fondo del molde.
- Ponga el molde en el horno a 120 ° C durante 5 minutos para reducir la manga SA. Comprobar si la manga del SA, se está reduciendo. Retire la funda del SA de los moldes lleno de sal y deje que se enfríen a temperatura ambiente. Mantener los moldes en el desecador hasta su utilización.
- Prepare la solución de PGS mediante la disolución de 3 g de la DGP en 15 ml de tetrahidrofurano (THF) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) para formar un peso de 20 / solución vol%.
- Añadir la solución de PGS a la luz de la sal lleno de moldes dejándolo caer con un spoid en la campana de Hume. Incline el molde de vidrio de unos 45 ° y dejar la solución de PGS en la cavidad interna con rotación del molde lentamente. Compruebe si la solución PGS fluye hacia abajo a lo largo de la pared del molde. Si la mancha seca se observa, añadir más solución.
- Después de añadir la solución de PGS, coloque los moldes en la campana de Hume por lo menos durante 30 minutos para evaporar THF.
- Ponga el molde en el horno de vacío para el tiempo de curado pre-determinado (por ejemplo, 24 / 36 / 48 h) a 100 mTorr y 150 ° C para curar PGS.
- Después de curar, sacar los moldes y ponerlos a la temperatura ambiente se enfríe. Sumerja cada molde en el agua destilada con la posición vertical lentamente. No sumerja ellos en el ayuno de agua debido a las burbujas de aire pueden causar desgarro del andamio.
- La transferencia de los moldes para el baño de agua con cuidado y colocarlos en un ángulo de 1 h con tubo de silicona para disolver HA fácilmente. Compruebe si HA se disuelve en el molde. Si no se libera HA del molde, empuje el extremo del andamio lentamente con una espátula para que la liberación del molde. Repita este paso en el otro extremo del andamio y sacudir el molde de un lado a otro lentamente en el baño de agua. Revise si el andamio se mueve dentro del molde.
- Transferir el andamio a otro baño de agua con un agitador con cuidado. No tomar el andamio con firmeza, lo que podría romper el andamio. Coloque el armazón en el baño de agua durante al menos 3 días con el cambio de agua para lixiviar las partículas de sal.
- Después de la lixiviación de las partículas de sal, la transferencia de cada uno de andamios para el tubo de centrífuga de 15 ml llena de agua destilada y colocarlos en la caja de hielo seco durante 1 h para congelar. Poner tubos de centrífuga en el liofilizador (todas las cabinas del tubo debe estar abierto) y liofilizar ellos por 2 días.
- Ponga todos los andamios en el desecador antes hasta su utilización.
2. Andamio Preparación para la siembra de células
- Saque de andamios en el desecador y se cortan en un 25-30mm de longitud.
- Prepare dos tapones de goma de silicona (diámetro = 20 mm, espesor de pared = 6,35 mm, diámetro medio = 3 mm) y conectar dos tubos de PTFE (diámetro externo = 3,97 mm, diámetro interior = 2,38 mm, espesor de pared = 0,79 mm, longitud = 60 mm y 40 mm) a través de los orificios de centro de cada tapón.
- Cortar un anillo de SA como de 1,5 mm de longitud y lo puso en la cima de uno de los extremos del andamio. Impulsar un tubo de PTFE (conectado tapón de goma de silicona) en el extremo de un andamio en pequeña parte se superponen como sea posible.
- Coloque el tubo de andamio y PTFE en el horno a 120 ° C durante 10 minutos para reducir el tamaño del anillo SA. Comprobar si el anillo SA es reducido y los andamios están conectados a un tubo de PTFE con firmeza.
- Saque el tubo de andamio y PTFE y ponerlos a la temperatura ambiente se enfríe. Monte el conjunto de tubos de andamio-PTFE en el tubo de policarbonato (diámetro externo = 15,5 mm, diámetro interior = 9 mm, longitud = 50 mm), como una cámara de biorreactor.
- Conecte el otro extremo del tubo de PTFE al patíbulo como pasos 2.3) y 2.4).
- Ajustar dos tapones de goma de silicona para fijar sus superficies interiores de los dos extremos del tubo de policarbonato. Coloque las dos superficies exteriores de los tapones de goma de silicona para dos placas de aleación de aluminio (superior e inferior, ancho = 20 mm, longitud = 70 mm, espesor = 6,35 mm). Poner dos varillas roscadas en el orificio lateral de la placa y fijar el tubo de policarbonato (incluido el interior de andamios) a las placas apretando la tuerca de tornillo en la placa.
- Medir la longitud de cada seedable andamio (una longitud de entre dos anillos SA) y calcular el área de la superficie interna (π x diámetro interno x longitud seedable) de cada andamio para la siembra de células.
- Envuelva un biorreactor unidad de cámara con papel de aluminio y esterilizar en autoclave a 120 ° C durante 30 min. Esterilizar a cada parte (depósito medio, tubo de la bomba, intercambiador de gas, colectores, y la válvula de aguja) del biorreactor en autoclave a 120 ° C durante 30 minutos y ensamblarlas dentro de la campana de cultivos celulares.
- Pre-tratar y aclarar los andamios con una serie de infusiones (70, 50, y 25% de etanol durante 1 h, tampón fosfato salino (PBS; Mediatech, Herndon, VA) durante 2 horas y media SMC cultivo durante 24 h mediante el uso de una bomba peristáltica a 1,0 ml / min en el circuito de flujo.
3. La siembra de células y Cultura
- Aislar las células primarias del músculo liso arterial (SMC) de las arterias carótidas de menores babuinos machos (Papio anubis) y caracterizarlos en dos dimensiones (2D) la cultura antes de pases y la siembra, como se describió anteriormente 9.
- Ampliar las CML con el MCDB 131 medianas (Mediatech, Herndon, VA) con un 10% de suero fetal bovino (Lonza, Walkersville, MD), 1% de L-glutamina (Mediatech), 50 mg / ml de ácido ascórbico (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), y una solución de antibiótico-antimicótico (10.000 UI / ml de penicilina, 10000 mg / ml de estreptomicina y 25 mg / ml de anfotericina B; Mediatech).
- Separe cada cámara biorreactor desde el circuito de flujo en el biorreactor. SMC semillas (paso 4-6) al cadalso con una densidad de 2x10 6 células / cm 2 mediante la inyección de la suspensión con una jeringa de 5 ml en la luz de los andamios después de cortar dos abluminal (entrada) y los flujos de luminal (salida).
- Ponga todas las cámaras de biorreactor en la hibridación incubadora a 37 ° C y girarlas a 2 rpm durante 4 horas para permitir que las células se repartirán uniformemente en el andamio.
- Saque cámaras biorreactor de la hibridación incubadora de volver a conectar a flujo de circuito del biorreactor en el capó. La transferencia de todo el sistema de biorreactores en cultivo celular incubadora.
- Conecte el tubo de la bomba (diámetro interno = 1,6 mm) en el cartílago de la bomba peristáltica y la carga de medio de cultivo fresco en el depósito. Iniciar la perfusión a través de la pared (luminal de abluminal) a 1,0 ml / min durante 15 minutos seguido por el flujo luminal solamente.
- Aumentar el caudal y la presión poco a poco a partir de 1,0 ml / min (estrés luminal de corte: 1,1 dinas / cm 2) y 20 mmHg en el día de 1 a 14,2 ml / min (15,3 dinas / cm 2) y 120 mmHg en el día 21, respectivamente. Cambiar el tubo de la bomba (diámetro interno = 3,2 mm) en el día 4 y el medio de una vez por semana.
4. Tejido de cosecha y preparación de muestras para el análisis
- Después de 21 días de la cultura, la parada de la bomba y los tubos de sujeción (entrada y salida) del yacimiento medio. Separe el tubo de la bomba del cartílago de la bomba peristáltica y un sistema de biorreactor de transferencia en el capó.
- Abrazadera de entrada y salida de tubos de cada cámara de bioreactor y sáquelo del circuito de flujo. Abra el tubo de entrada y preparar un plato de Petri-en la tubería de salida para recoger el medio de cultivo en el interior del tubo de policarbonato. Abrir el tubo de salida lentamente y se elimina el medio de la cámara.
- Separe aguja abluminal y tubo de silicona luminal de la cámara y retire las placas de aluminio por la liberación de tornillos. Retire el tubo de policarbonato y separar uno de los extremos del tejido construcción de la tubería de PTFE.
- Preparar un petri plato lleno con 10 ml de PBS y separar al otro lado de la construcción de la tubería de PTFE. Ponga en la construcción de la PBS y enjuáguese la boca tres veces.
- Cortar la construcción con una cuchilla de afeitar como de 5 mm de longitud. Congelarlo a -80 ° C congelador para análisis bioquímico o transferirla a 15 ml tubo de centrífuga llena con 5 ml de medio fresco para ensayos mecánicos o congelamiento rápido en el Tissue-Tek compuesto óptimo de temperatura de corte (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA ) para el estudio histológico / inmunofluorescenciatinción orescence.
5. Los resultados representativos:
Los andamios tubulares PGS fueron fabricados utilizando elastómeros biodegradables por el método de la sal de fusión (Fig. 1A). Cada cámara biorreactor siempre andamios con los flujos tanto luminal y abluminal y podría ser separada como una unidad separada de un circuito de corriente principal (Fig. 1B). Biorreactor sistema fue diseñado para el cultivo de cuatro andamios a la vez, controlar y supervisar el flujo, así como la presión (Fig. 1C y D).
Esquemática de la cultura biorreactor se muestra en la figura. 2. Después de la siembra SMC, cada cámara biorreactor fue girado a 37 ° C durante 4 horas para distribuir uniformemente las células en el lumen del andamio. Y entonces, el flujo pulsátil se aplicó a los andamios hasta el día 14 con el caudal aumenta gradualmente (Fig. 2A) y presión (Fig. 2B). Después de 14 días, el flujo y la presión se mantiene constante hasta el final de la cultura (día 21).
Morfología de la superficie del andamio PGS fue examinado por microscopía electrónica de barrido (SEM). Micrografías electrónicas de barrido mostró que el andamio había pared grosor consistente (539 ± 18 micras) (Fig. 3A) y distribuidas al azar de macro y micro-poros en la superficie luminal (Fig. 3B). Parámetros morfométricos del andamio se midió desde microcomputed tomografía computarizada (micro-CT) y análisis de imágenes. Tamaño de poro promedio es de 23,3 ± 3,9 micras y la interconectividad de los poros es del 99,4 ± 0,62%, lo que significa que todos los poros están totalmente interconectados en andamios. La porosidad medida por el desplazamiento de etanol es de 75,6 ± 2,7%.
Morfología de las células de la construcción de PGS fue examinada por SEM (Fig. 4). SMC completamente cubierta de varias capas de la superficie luminal y fueron orientadas perpendicularmente a la dirección del flujo. Estos resultados muestran que el condicionamiento mecánico de biorreactor de flujo pulsátil compatible con la orientación de SMC en el andamio.
La presencia de la matriz extracelular (MEC) y las fibras elásticas fueron examinadas por tinción H & E y la elastina autofluorescencia (Fig. 5). Tinción H & E demostrado que las células y las proteínas ECM completamente cubierto de la luz del PGS construir. Elastina autofluorescencia también mostró circunferencialmente organizado fibras elásticas en la superficie luminal de la construcción. Producción de proteínas ECM en los constructores de PGS fueron medidos a partir de los análisis bioquímicos. La elastina insoluble y el contenido de colágeno fueron 20,2 ± 9,1 mg / mg de tejido y 6,3 ± 1,9 mg / mg de tejido, respectivamente.
Figura 1. Andamio de fabricación y sistema de biorreactores. (A) Esquema de andamio tubular de fabricación. (B) la cámara de biorreactor. Los andamios se conecta a un tubo de PTFE, se coloca en el tubo de policarbonato, y se fija con tapones de goma de silicona y las placas de aleación de aluminio. Cada cámara tiene dos vías de flujo: flujo luminal (por tubo de silicona) y abluminal (por aguja). (C) biorreactor sistema que dentro de la incubadora. Incluye depósito de medio módulo de la bomba peristáltica, el intercambiador de gas, transductores de presión, dos colectores (superior e inferior), y la válvula de aguja. (D) sistema de biorreactor de colocarse fuera de la incubadora. Incluye monitor de la presión, la unidad de control de flujo, sistema de adquisición de datos, y el ordenador.
Figura 2. Esquema de la cultura biorreactor. (A) protocolo de cultivo. (B) aplicado perfiles de presión en cada momento (día 1, 4, 7 y 14).
Figura 3. Morfología superficial del andamio PGS. (A) Sección transversal. (B) Lumen.
Figura 4. Morfología celular de la construcción de PGS. (A) Lumen. (B) Sección de corte de 45 °. Las flechas en ambas cifras representan la dirección del flujo.
Figura 5. Histología y elastina autofluorescencia de los PGS construir. (A) H & E tinción. (B) autofluorescencia elastina correspondiente. L: lumen. Aumentos: 40X. Barra de escala: 50 micras.
Discussion
La técnica de fabricación con un elastómero biodegradable descrito aquí tiene varias características. (1) Utilizamos el ácido hialurónico (HA) como una liberación del molde. Desde HA es soluble en agua, andamios fue liberado fácilmente de los moldes de vidrio después de la inmersión en agua. En este informe, se utilizaron 1,0 wt / vol% de solución de alta ya que la concentración baja (<0.5 wt / vol%) de la solución no es viscosa y fluye hacia abajo tan rápido cuando se vierte en la parte superior del tubo de vidrio. A la solución de capa de HA de manera uniforme, que se volcó el tubo de vidrio cuando la solución voló la parte inferior de la tubería y se repite este paso. Este recubrimiento de HA es una crítica a nuestro procedimiento de fabricación de andamios para la liberación de final. (2) Se utilizó termorretráctil (SA) de manga para retener las sales en el tubo de vidrio. Ya que las sales se densamente poblado en el espacio entre la pared interior del tubo de vidrio y la manga del SA, manga SA mantiene sales después de la eliminación del mandril y el anillo de PTFE en la parte inferior de la tubería. Podríamos eliminar manga SA fácilmente poniendo el molde en un horno a 120 ° C durante 5 minutos, y luego las plantillas tubular de sal. (3) Se utilizó el método de fusión de sal. Es bien sabido que el método de la sal de fusión puede mejorar la interconectividad de los poros y las propiedades mecánicas, variando el tiempo de fusión 10. Por otra parte, ya que utilizamos PGS, macroporos fueron producidas por las partículas de sal durante el proceso de lixiviación, mientras que los microporos se han generado probablemente por vapor de glicerol formados durante PGS curado como hemos descrito previamente 11. Por lo tanto, este método tiene un gran potencial para la fabricación de andamios tubulares poroso con diferentes macro y micro-estructuras mediante la variación de las partículas de sal, así como PGS curar enfermedad.
El acondicionamiento mecánico del biorreactor ha proporcionado la perfusión flujo pulsátil (media máxima del flujo = 14 ml / min, esfuerzo cortante máximo = 15,3 dinas / cm 2, la frecuencia = 0,5 a 1,7 Hz) y fisiológicamente relevantes de presión con el andamio PGS, lo que llevó a SMC crecimiento y la orientación (Fig. 4). Estos resultados son consistentes con estudios previos de información que se extienden cíclico en esta frecuencia y tensión de corte aumenta la proliferación de SMC 12, y la producción de proteínas ECM 13,14. Además del crecimiento de SMC y la orientación, la construcción de PGS apoyo a la producción de proteínas ECM, especialmente circunferencialmente organizado fibras elásticas (Fig. 5) dentro de la cultura de 3 semanas en el biorreactor. Algunos estudios con un elastómero andamio como una construcción de pequeño diámetro arterial han demostrado resistencia mecánica y la presión de rotura comparables a las arterias nativas 15, y una rápida integración de SMC en los andamios cumplen con spinner frasco de 16,17, mientras que las fibras elásticas no se encuentran en estas construcciones. Nuestros resultados sugieren que la distensión cíclica radial desde el biorreactor mejorar la transducción de señales mecánicas con mayor eficacia a las CML en PGS andamio, lo que probablemente contribuyó a la síntesis de elastina y de la organización.
Desde las CML vasculares fueron las únicas células que producen proteínas ECM en nuestro enfoque, el endotelio quiescente y mejorar la resistencia mecánica es necesaria para lograr un éxito clínico de pequeño diámetro construye arterial. Nos han informado de que las células endoteliales co-cultivadas con SMC genera una monocapa y la expresión de proteínas fenotipo apoyado en nuestras condiciones de cultivo y el acondicionamiento mecánico 9. Por lo tanto, sobre la base de nuestro método aquí descrito, la modificación de las condiciones del experimento de co-cultivo sería un siguiente paso para mejorar las funciones de las construcciones resultantes y generar sólidas nonthrombogenic, y conforme arterial construcción similar a las arterias nativas.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El autor agradece a la Dra. Gao Jin para la síntesis de PGS, el Dr. Peter Crapo para el debate profundo de biorreactor de configuración, los Dres. Mohamed Ezzelarab y Wei Wu de explante babuino arterias carótidas. Este estudio fue apoyado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud (R01 HL089658).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H7630 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
| MCDB 131 | Mediatech, Inc. | 15-100-CV | |
| Fetal bovine serum | Lonza Inc. | BW14-502F | |
| L-glutamine | Mediatech, Inc. | 25-005-CV | |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A62-500 | |
| Antibiotic-antimycotic solution | Mediatech, Inc. | 30-004-CI | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Mediatech, Inc. | 21-031-CV | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature compound, 4583 | Sakura Finetek | 25608-930 |
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