Summary
に焦点を当てて細菌の病原体による宿主細胞の浸潤の研究のための一般的なプロトコル、
Abstract
ここで我々は細菌性病原体黄色ブドウ球菌によるヒト内皮細胞の浸潤を調べる方法について説明します。一般的なプロトコルは、事実上すべての培養可能な細菌が細胞の浸潤の研究に適用することができます。このようなアクチンの再編成やカベオラの役割としての侵略の特定の側面を検討されることができるステージが、、強調表示されます。宿主細胞はフラスコとするときに使用可能な状態で栽培されてThermanoxのカバースリップを含む24ウェルプレートに播種されています。カバースリップを使用すると、井戸からの細胞のその後の除去は、井戸（ 黄色ブドウ球菌は、添付する先）の側面に堆積した血清タンパク質からの干渉を低減することができます。細菌は、必要な密度まで増殖させ、任意の分泌タンパク質（例えば毒素）除去するために洗浄されています。内皮細胞のコンフルエントな層とカバースリップは、細菌を添加する前に新鮮な培養培地を含む新しい24ウェルプレートに転送されます。細菌や細胞を37℃5％CO 2で時間を必要な量のために一緒に℃でインキュベートする。 S.用黄色ブドウ球菌は、これは通常、15〜90分の間です。 Thermanoxカバースリップは、各ウェルから除去し、アタッチされていない細菌を除去するためにPBSで浸漬洗浄されています。合計られている細菌（付着と内部化されたが）定量化する場合は、カバースリップをPBSでX - 100 0.5％のトリトンを含む新鮮なもに配置されます。穏やかなピペッティングは、細胞溶解を完了すると、細菌は寒天培地段階希釈し、メッキによって列挙されているリード。細胞に侵入している細菌の数が必要な場合は、カバースリップはすべて外部の細菌を殺す1時間、継続ゲンタマイシンとインキュベーションを添加した500μlの組織培養の培地を含むウェルに追加されます。カバースリップをして洗浄することができる、細胞が溶解し、上記のような細菌は、寒天の上にメッキで列挙。実験は、直接可視化を必要とする場合、カバーガラスを固定して、染色、光蛍光または共焦点顕微鏡、あるいは電子顕微鏡用に調製することができる。
Protocol
次のプロトコルは、S.の内皮細胞の浸潤の研究を紹介します黄色ブドウ球菌は、しかし、理論的には任意の培養可能な細菌による細胞侵入を研究するために使用することができます。 S.への特定の段階黄色ブドウ球菌と内皮細胞が示されている。
1。細菌の調製
- 文化S. 37 10ミリリットルブレインハートインフュージョン（BHI）ブロス中で4月16日H（必要な成長段階に応じて）℃〜200 rpmで振盪しながら空気中のため黄色ブドウ球菌株。これらの成長条件は、Sの固有のものです黄色ブドウ球菌と他の細菌のために適切に調整する必要があります。
- DMEMに相当量の細菌のペレットの培養上清と再懸濁の除去、室温で遠心分離の代替ラウンドで（5,000 × g、10分）;ダルベッコ変法イーグル培地（Invitrogen DMEM）中の細菌を3回洗浄する。その後、必要に応じて調節することができる細菌の得られた懸濁液の光学密度を測定します。 S.用黄色ブドウ球菌は、我々は、〜10 9 CFU ml -1のに対応するOD 600 = 1、懸濁液を準備。
2。内皮細胞培養
- 文化ウシ胎児血清（FBS; 10％）を添加したDMEMで内皮細胞株EA.hy926 1 37時とL -グルタミン（2mMの）°、5％CO 2でCを。また、プールされた初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECを）ロンザ（バーゼル、スイス）から購入し、37℃で2％FBS、ウシ脳抽出物（ヘパリンを含む）、ヒト内皮成長因子およびヒドロコルチゾンを添加した内皮基礎培地で培養することができます° C、5％CO 2、メーカーの指示（ロンザ）によると。これらの成長条件は、これらの細胞に特異的であり、他の宿主細胞の種類に適応する必要があります。
- 目で検証、コンフルエントに完了するためにT75フラスコで内皮細胞を成長させる。
- カバースリップの挿入のための24ウェルプレートを準備します。ファイン鉗子は、（火炎滅菌）1つの不透明な一光沢のある表面を持ってカバースリップを、移動するために必要である。細胞接着を可能にするために上向きに直面している不透明な面を持つ24ウェルプレートのウェルに配置してカバースリップ。
- 3ミリリットルトリプシン- EDTA（0.25％）とT75フラスコから細胞を解放すると、関連する培地10mlに加える。
- Thermanoxのガラス製カバースリップを含む24ウェルプレートに再懸濁した細胞を500μlを添加します。細胞の一つT75コンフルエントフラスコは約5で得られた2 24ウェルプレート、× 1ウェルあたり10 5細胞（500μlの培地中で）のために十分な細胞を提供した。
- 前述のように48時間プレートをインキュベートし、反転光顕微鏡によるコンフルエント100％のセルを確認してください。
- ディップ洗浄PBSでカバースリップをし、各ウェルに10％FBSを含む490μlのDMEMを含む新しい24ウェルプレートに加える。
- 細胞の浸潤における特定の代謝過程の役割を調べるために、阻害剤は培養細胞にアッセイ中に維持細菌や濃度を添加する前に1時間を追加することができます。例えば、S.のアクチン再構成の役割を決定する内皮細胞の黄色ブドウ球菌の侵入、50μMのサイトカラシンDを追加することができる、またはカベオラの役割のために、5mMのメチル-β-シクロデキストリンを添加することができる。
3。浸潤アッセイ
- よく、10％FBSを含む490μlのDMEMで内皮細胞のコンフルエントな層で洗浄したカバースリップを含む各洗浄細菌の10μlを（約2 × 10 7 CFU ml -1の 黄色ブドウ球菌での結果）を追加します。
- 37℃で15〜90分間インキュベート° Cを5％CO 2で。
- 細胞（付着性と内部化）に関連する細菌の総数を測定するために、カバースリップをPBSで3回浸漬洗浄し、PBSで500μlの0.5パーセントトリトンX - 100を含有する新鮮なウェルに加える。細胞が完全にすべての内部化された細菌を溶解し、解放を確保するために、直接カバーグラスの表面でピペットの先端を指して、数回ピペッティング。
- TSAプレートの表面に液体懸濁液（またはこの必要なの希釈液）をめっきによって細菌を列挙する。 TX - 100は多くのグラム陰性菌を溶解するので、サポニンは、代わりに2を使用できます。
- 内部化された細菌数を測定するために、各ウェルを含むバインドされていない細菌から培養上清を除去し、200μgのml -1のゲンタマイシンを添加した500μlのDMEM/10％FBSに交換してください。我々は日常的にそれが安価であるので、ここではなく、リソスタフィンよりゲンタマイシンを使用し、私たちは実験的なプロトコルを変更することなく、細菌の種類によって（ブドウ球菌とLactococci）を用いた実験を切り替えることができます。
- 37プレートをインキュベート℃、5％のC 60分間CO 2のすべての細胞外細菌を殺すために。
- 、カバースリップをPBSで3回洗浄する溶解し、上記の接着アッセイのために説明されているようにTSA上にめっきによって列挙する。
- いくつかのケースでは、視覚的に光学顕微鏡を用いて細菌の数をカウントすることが好ましいかもしれない。このインスタンス内の、および特定のS.へ黄色ブドウ球菌の細胞浸潤は、物理的に細胞外細菌を破壊する代わりに、ゲンタマイシンのリソスタフィン（10μgのml -1）を使用してください。
- 37℃20分のためのカバースリップをインキュベート· CO 2のCは、リソスタフィンのソリューションで、その後すすぎとCytopath（Cellpath）で固定。
- 5分間クリスタルバイオレット（0.5％、w / v）のとカバーグラスを覆います。
- 空気乾燥、水に浸漬洗い、ガラススライド上にマウントします。コンフルエント内皮細胞の1mm 2あたりの細菌の数は、光学顕微鏡を用いて定量することができます。
4。代表的な結果：
S.の表面上のフィブロネクチン結合タンパク質の発現（FnBPAとFnBPB） 黄色ブドウ球菌は、内皮細胞に侵入する能力を付与する。最近の研究は、FnBPA 3のフィブロネクチン結合ドメインを再定義しています。野生型（WT）S.黄色ブドウ球菌 8325.4はFnBPAとB（ΔFNB）の両方を欠いている株が内部化の有意な減少レベル（図1A）を示した一方、高効率で血管内皮細胞に侵入する。をコードするプラスミドのFNBと変異体の相補マイナスフィブロネクチン結合ドメイン（pFnR0は）（図1A）の侵入を促進しなかった。これとは対照的に、コードするプラスミドと変異体の相補全体FNB遺伝子（pFnBA4）はWTのレベル（図1A）に侵略を復元。
内皮細胞の浸潤におけるFnBPAの役割は、異種発現宿主ラクトコッカスラクティスを使用して実証することができます。 L.のプラスミドにコードされたFnBPAの発現ラクティス （pRM9 9）有意にないFnBPA（CTL）を（オープンバー、図1B）を発現しない細菌と比較して内皮細胞への接着を増強しなかった。対照的に、FnBPA発現L.ラクティスは、非発現株（クローズドバー、図1B）に比べ有意に高いレベルでの内皮細胞に侵入した。
実験は、重複に4回行ったし、平均値±標準偏差が表示されます。 * WTまたはCTLの値から（P = <0.05）統計的に有意に異なるデータを表す。
図1 EAの侵略。 S.のHy926内皮細胞黄色ブドウ球菌 （A）またはL.ラクティス （B）。
Discussion
我々が記述するアッセイは、細菌による宿主細胞の浸潤を調べるために広く使用されているゲンタマイシンプロテクションアッセイに基づいています。細胞内細菌を殺すためにゲンタマイシンと他の抗生物質の無力の観測は、細菌4月8日から宿主細胞の浸潤の初期の研究に活用された。 24、48あるいは96ウェルプレートの使用は、短期間で比較的低コストで定量的、再現性の高い大量のデータを生成することができます。それは専門機器を必要としない、それが様々な細菌や細胞と動作するように調整することができる、と侵略9で細菌と宿主の両方の細胞プロセスの役割を研究するために使用できるため、アッセイはまた魅力的です。確かに、最古の実験以来、ゲンタマイシン保護アッセイは、広くさまざまな細菌や細菌10,11の偶数の組み合わせの範囲が宿主細胞の浸潤を測定するために採用されている。核となる原則は同じである一方、メソッド内の多くの微妙な変化が報告されている。この記事では、我々のバージョンを記載し、変更が他の細菌や宿主細胞のために必要となる場合がありますどこに示されている。このアプローチを使用して、宿主細胞の浸潤を測定する実験を設計する際に考慮すべき重要な点の数があります。
ゲンタマイシンに対する細菌感受性が。これは明らかに見えるかもしれませんが、それは研究されている細菌は、濃度、温度、使用する時間の長さ以上でゲンタマイシンの影響を受けやすいことを確認することが重要です。鈍感の場合には、それは他の抗生物質5を使用することも可能です。別のアプローチは、溶菌酵素（リソスタフィン、mutanolysin、リゾチーム）12を使用することができます。
インキュベーションと接種は。最初にこのアッセイを実行する場合には、使用される最適なインキュベーション時間と細菌の接種を確立することが重要です。したがって、初期の実験は、時間をかけて接着し、侵入（最大6時間まで5分）の両方を調べる必要があります。それは、侵略が感染の多重度に影響されるかを評価することも重要である（MOI、細胞当たりの細菌数）。一般的に、これは培養細胞への損傷を低減するので可能な細菌の少ない番号を使用するのが最適です。長期潜伏期間や大規模な接種が9,13を使用している場合は株の間の重要な相違点を見逃す可能性があります。
細胞の損傷が。使用前に細菌を洗浄することが重要です。しかし、細胞損傷は、毒素産生に限定されるものではありません。細菌の侵入、アポトーシスと正常な細胞機能の破壊の誘導は、すべての細胞の損傷を引き起こす可能性があります。これは内部化細菌を殺し、侵略が14を発生していないという印象を与え、細胞内へのゲンタマイシンの浸透につながることができます。
インキュベーション条件は、温度および培地の組成は、侵攻に大きな影響を与えることがあります。例えば、 化膿連鎖球菌によるHeLa細胞の浸潤は通常、血清15の存在する可溶性フィブロネクチンの存在に依存している。別の考慮事項は、実験の過程で培地中の細菌の増殖です。
文化と細胞内細菌の定量化。TX - 100は細胞内細菌を殺すしないかもしれないが、それは彼らの成長を阻害することがあります。そのため、界面活性剤の存在下で固体培地上に細菌の複製を確認することが重要です。影響を受ける場所、それは洗剤の低濃度を使用したり、サポニンなどの代替を使用することがあります。クリスタルバイオレット染色および顕微鏡アッセイ上ゲンタマイシンプロテクションアッセイの利点は、集中的に少ない労働力であるということです、そしてそれは内部化された細菌の亜集団の検出と分化することができます。例えば、S.黄色ブドウ球菌は通常のコロニーのタイプ（NCT）または個々の細菌細胞の顕微鏡による区別はないと小コロニーの変異体（SCV）16を 、生成することができます。ゲンタマイシンプロテクションアッセイ上クリスタルバイオレット染色および顕微鏡アッセイの利点は、細胞の凝集が考慮することができますし、"実行可能な、非培養可能"状態に入る細胞内細菌が17日に検出されることです。
細菌の侵入における宿主細胞のプロセスの役割を検討 。多くの研究は、アクチン再構成を妨げるサイトカラシンD、などの宿主細胞機能の阻害剤を用いている。このような研究はまた、標的細胞表面の受容体と特異的な遺伝子18のsiRNAのノックダウンその抗体を含めることができます。それは、これらの治療は、培養細胞の生存または添付ファイルに影響を与えたり、細菌の毒性を持っていないことを確認するために極めて重要です。
今後の方向性：
ontent">このアッセイは、通常、マルチウェル細胞培養プレート中で行われるため、それは潜在的な細胞機能の阻害剤のライブラリの検討を巻き込むようなハイスループットスクリーニングの操作、それを適応することは理論上可能です、抗感染薬または抗生物質細胞内細菌を標的とするように設計。また、そのようなアプローチは接着、浸潤や細胞生存に関与する遺伝子を同定するために変異体ライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。いくつかのケースでは、モデルシステムでせん断力を（フロー）に含めることが望ましいかもしれない、より密接に生体環境における模倣する。フローセルとマイクロ流体細胞培養システムの設計および製造における現在の進歩は、せん断力を組み込む宿主-病原体のモデルにゲンタマイシン保護アッセイを採用する可能性を提供し、内皮細胞をモデル化するときなど。要約すると、ここで説明するプロトコルは、長年にわたって使用される同じようなアプローチに基づいています。それは広く、培養細胞や細菌種の多くの種類に適用可能であり、迅速かつ比較的少ないコストで、大量のデータを生成することができます。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、ウェルカムトラスト（WT 0795880）によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 31885-023 | |
| Brain heart infusion | BioChemika | 53286 | |
| F–tal bovine serum | Invitrogen | 10091-148 | |
| HUVECs | Lonza Inc. | CC-2519 | |
| Endothelial basal medium | Lonza Inc. | CC-3121 | |
| Bovine brain extract (including heparin) | Lonza Inc. | CC-4092 | |
| Human endothelial growth factor | Lonza Inc. | CC-4017C | |
| Hydrocortisone | Lonza Inc. | CC-4035C | |
| GA-1000 | Lonza Inc. | CC-4092C | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710 | |
| Lysostaphin | AMBI | LSPN-50 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TKT-210-330P | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Cytopath | TCS Biosciences | HC8595 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | C3886 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| T75 flasks | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 430641 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C2618 | |
| Methyl-B-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | 332615 |
References
- Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 3734-3737 (1983).
- Makino, S., van Putten, J. P., Meyer, T. F. Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells. EMBO J. 10, 1307-1315 (1991).
- Schwarz-Linek, U., Werner, J. M., Pickford, A. R., Gurusiddappa, S., Kim, J. H., Pilka, E. S., Briggs, J. A., Gough, T. S., Höök, M., Campbell, I. D., Potts, J. R. Pathogenic bacteria attach to human fibronectin through a tandem beta-zipper. Nature. 423, 177-181 (2003).
- Magoffin, R. L., Spink, W. W. The protection of intracellular Brucella against streptomycin alone and in combination with other antibiotics. J. Lab. Clin. Med. 37, 924-930 (1951).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria. Antimicrob. Agents Chemother. 52, 1673-1679 (1973).
- Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrob. Agents Chemother. 16, 743-749 (1979).
- De Melo, M. A., Pechere, J. C. Effect of mucin on Campylobacter jejuni association and invasion on HEp-2 cells. Microb. Pathog. 5, 71-76 (1988).
- Shaw, J. H., Falkow, S. Model for invasion of human tissue culture cells by Neisseria gonorrhoeae. Infect. Immun. 56, 1625-1632 (1988).
- Edwards, A. M., Potts, J. R., Josefsson, E., Massey, R. C. Staphylococcus aureus Host Cell Invasion and Virulence in Sepsis is Facilitated by the Multiple Repeats within FnBPA. PLoS Pathog. 6 (6), e1000964-e1000964 (2010).
- Meyer, D. H., Sreenivasan, P. K., Fives-Taylor, P. M. Evidence for invasion of a human oral cell line by Actinobacillus actinomycetemcomitans. Infect. Immun. 59, 2719-2726 (1991).
- Edwards, A. M., Grossman, T. J., Rudney, J. D. Fusobacterium nucleatum transports noninvasive Streptococcus cristatus into human epithelial cells. Infect. Immun. 74, 654-662 (2006).
- Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis. Infect. Immun.. 66, 5994-5998 (1998).
- Schröder, A., Schröder, B., Roppenser, B., Linder, S., Sinha, B., Fässler, R., Aepfelbacher, M. Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells. Mol. Biol. Cell. 17, 5198-5210 (2006).
- Molinari, G., Rohde, M., Talay, S. R., Chhatwal, G. S., Beckert, S., Podbielski, A. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol. Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Cue, D., Dombek, P. E., Lam, H., Cleary, P. P. Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells. Infect. Immun. 66, 4593-4601 (1998).
- Eiff, C. von Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians. Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).
- Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells. Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).
