Summary
Odaklanan bir bakteriyel patojen tarafından işgalinin ana hücrelerinin çalışma için genel bir protokol,
Abstract
İşte biz insan endotel hücreleri istila bakteriyel patojen Staphylococcus aureus çalışmanın nasıl anlatacağız. Genel protokol, hemen hemen her kültürlenebilen bakterinin hücre işgali çalışma yapılabilir. Örneğin aktin düzenlenmesi veya caveolae rolü işgali belirli yönlerini ele olabilir hangi aşamaları, vurgulanır. Konak hücrelerine şişeler yetişen ve kullanıma hazır manox lamelleri içeren 24 kuyucuğu içine numaralı seribaşı. Lamelleri kullanarak, kuyulardan (S. aureus eklemek için) tarafı üzerine yatırılır serum proteinlerinin kuyulardan hücrelerinin sonraki kaldırma girişimi azaltılması sağlanır . Bakteriler gerekli yoğunluğu büyüdü ve herhangi bir salgılanan proteinler (örneğin toksinler) uzaklaştırmak için yıkanır. Endotel hücreleri konfluent katmanları ile lameller bakteri eklenmesi önce taze kültür ortamı içeren yeni 24-kuyucuğu aktarılır. Bakteri ve hücreler daha sonra 37 o zaman gerekli miktarı için% 5 CO 2 birlikte inkübe edilir ° C S için aureus bu genellikle 15-90 dakika arasında. Manox lamelleri her kuyudan çıkarılmış ve unattached bakterileri kaldırmak için PBS daldırma yıkanır. Toplam ilişkili bakteriler (yapışık ve içselleştirilmiş) sayısal edilecekse, lamelleri sonra PBS içinde X-100% 0.5 Triton içeren yeni bir kuyu yerleştirilir. Nazik pipetleme hücre parçalama tamamlamak ve bakteriler agara seri seyreltme ve kaplama tarafından numaralandırılan açar. Hücreleri istila bakteri sayısı gerekli ise, tüm dış bakterileri öldürecektir gentamisin ve inkübasyon ile desteklenen 500 ul doku kültür ortamı içeren kuyu 1 saat boyunca devam etti, lamelleri eklenir. Lameller sonra yıkanabilir, parçalanmış hücreler ve yukarıda açıklandığı gibi bakteriler agara kaplama ile numaralandırılan. Deney doğrudan görselleştirme gerektiriyorsa, lamelleri sabit ve lekeli, ışık, floresan veya konfokal mikroskobu veya elektron mikroskobu için hazırlanmış olabilir.
Protocol
Aşağıdaki protokol S. endotel hücre işgali çalışma açıklayacağız aureus ama teorik olarak herhangi bir kültürlenebilen bakteri tarafından hücresel işgali incelemek için de kullanılabilir. S. için özel Aşamaları aureus ve endotel hücreleri gösterilir.
1. Bakterilerin hazırlanması
- Kültür S. 4-16 saat 37 10 ml Beyin-Kalp İnfüzyon (BHI) suyu (gerekir büyüme aşamasında bağlı olarak) ° C 200 rpm'de sallayarak ile hava aureus suşlarının. Bu büyüme koşulları S. için özel aureus ve diğer bakteriler için adapte edilmesi gerekebilir.
- Oda sıcaklığında (5.000 x g, 10 dakika), DMEM, bir eşdeğer hacmi bakteriyel pelet kültür süpernatant ve tabanda kaybolmasına santrifüj, alternatif tur; bakteri Dulbecco'nun Modifiye Kartal Kullanıcı orta üç kez (Invitrogen DMEM) yıkayın. Bakterilerin gerektiği gibi ayarlanabilir süspansiyon optik yoğunluk ölçülür. S için aureus, ~ 10 9 kob ml -1 karşılık gelen OD 600 = 1, bir süspansiyon hazırlamak.
2. Endotel hücre kültürü
- 37 ° ve L-glutamin (2 mM) ° C,% 5 CO 2; Kültür DMEM endotel hücre hattı EA.hy926 1 fetal sığır serumu (% 10 FBS) ile desteklenmiştir. Alternatif olarak, havuzlu birincil insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVECs) Lonza (Basel, İsviçre) satın alınmış ve 37% 2 FBS, sığır beyin ekstraktı (heparin dahil), insan endotelyal büyüme faktörü ve hidrokortizon ile desteklenmiş endotel bazal orta kültürlü olabilir ° C,% 5 CO 2, üreticinin talimatlarına (Lonza) göre . Bu büyüme koşulları, bu hücreler için spesifik ve diğer ev sahibi hücre türleri için adapte edilmesi gerekebilir.
- T75 şişeler endotel hücreleri, göz tarafından doğrulanmadı confluency tamamlamak büyütün.
- Lamelleri yerleştirilmesi için 24-iyi bir tabak hazırlayın. Güzel forseps (alev steril) bir opak ve parlak bir yüzeye sahip lamelleri taşımak için ihtiyaç vardır. Lamelleri, hücre tutunmasını sağlar yukarı bakacak şekilde opak yüzeyi ile 24 plaka kuyular yerleştirin.
- 3 ml tripsin-EDTA (% 0.25) ile T75 balon hücreleri özgürleştirmek ve ilgili kültür ortamı 10 ml ekleyin.
- Manox cam lamelleri içeren 24 kuyucuğu yeniden süspanse hücreleri 500 ul ekleyin. Bir T75 konfluent balon hücre yaklaşık 5 × ortalama 10 5 hücreleri (500 inoküle), iki adet 24-kuyucuğu için yeterli hücreleri sağladı .
- Yukarıda açıklandığı gibi 48 saat süreyle inkübe plakaları, ve ters ışık mikroskobu ile confluency% 100 hücre doğrulamak.
- Dip-yıkama PBS içinde lamelleri ve her biri de% 10 FBS içeren 490 ul DMEM içeren yeni 24 kuyucuğu eklemek.
- Hücre işgali belirli metabolik süreçlerin rolünü incelemek için inhibitörleri saat önce tahlil sırasında tutulan bakteri ve konsantrasyonlarının yanı sıra kültür hücreleri 1 eklenebilir. Örneğin, S. aktin düzenlenmesi rolünü belirlemek için endotel hücreleri aureus işgali, 50 mcM cytochalasin D eklenebilir; veya caveolae, 5 rolü için mM metil-β-siklodekstrin eklenebilir.
3. Invasion Testi
- Her biri% 10 FBS içeren 490 ul DMEM konfluent tabaka endotel hücreleri ile yıkanmış lamel içeren yıkanmış bakterilerin 10 ul (yaklaşık 2 × 10 7 kob ml -1 S. aureus) ekleyin .
- 15-90 dakika boyunca 37 ° ° C'de% 5 CO 2.
- Lamelleri bakteri hücreleri (yapışık ve içselleştirilmiş) ile ilgili toplam sayısı ölçmek için, PBS içinde üç kez dip yıkayın ve PBS içinde 500 ul% 0.5 Triton X-100 içeren taze kuyu eklemek. Hücrelerin tam olarak içselleştirilmiş tüm bakteri lyse ve serbest sağlamak için, doğrudan lamel yüzeyinde pipet ucu işaret ederek, birkaç kez pipetle.
- TSA plakaların yüzeyine sıvı süspansiyon (veya bu gerekli dilüsyonları) kaplama ile bakteri numaralandırılamıyor. TX-100 birçok Gram-negatif bakteriler lyse beri, saponin yerine 2 kullanılabilir.
- Içselleştirilmiş bakteri sayısını ölçmek için, her bir kuyunun içeren bağlanmamış bakteri kültürü süpernatant kaldırmak ve 200 mg ml -1 gentamisin ile desteklenen 500% ul DMEM/10 FBS ile değiştirin. Biz rutin olarak daha ucuz olduğu gibi burada oldukça lysostaphin daha gentamisin kullanımı ve bize deneysel protokol değiştirmek zorunda kalmadan, farklı bakteri türleri (örneğin Stafilokok ve Lactococci) kullanarak deneyler arasında geçiş yapmanıza olanak tanır.
- 37 ° plakaları inkübe ° C ekstrasellüler bütün bakterileri öldürmek için 60 dakika süreyle% 5 CO 2.
- Lamelleri PBS içinde 3 kere yıkayınTSA üzerine kaplama lyse ve numaralandırmak yapışma testi için yukarıda anlatılan.
- Bazı durumlarda, görsel ışık mikroskobu kullanılarak bakterilerin sayısını saymak için tercih edilebilir. Bu durumda, özel S. aureus hücre işgali, fiziksel ekstraselüler bakterileri yok etmek için lysostaphin yerine gentamisin (10 mg ml -1) kullanmak.
- 37 20dk için lamelleri inkübe ° C CO 2 lysostaphin çözüm, sonra durulayın ve Cytopath (Cellpath) ile düzeltmek.
- 5min lamelleri kristal viyole (% 0.5 w / v) ile boyayın.
- Su, hava-kuru Dip-durulayın ve cam slayt üzerine monte. Konfluent endotel hücreleri mm 2 başına bakteri sayısı, ışık mikroskobu kullanılarak belirlenebilir .
4. Temsilcisi Sonuçlar:
S. yüzey fibronektin bağlayıcı proteinlerin Anlatım (FnBPA ve FnBPB) aureus endotel hücreleri istila yeteneği bahşeder. Son çalışmalar, FnBPA 3 fibronektin bağlayıcı bir etki ortaya koymuştur. Wild-tip (WT), S. aureus 8325,4 yüksek verimlilik ile endotel hücreleri işgal FnBPA ve B (Δ FNB) olmayan bir yük önemli ölçüde azaltılmış internalizasyonunda düzeyleri (Şekil 1A) gösterdi iken. Plazmid bir kodlama FNB mutant tamamlama bir eksi fibronektin bağlayıcı etki alanı (pFnR0) (Şekil 1A) işgali teşvik etmedi . Buna karşılık, mutant bir plazmid kodlama tüm FNB WT düzeyleri (Şekil 1A) işgali restore geni (pFnBA4) ile tamamlama.
Endotel hücre işgali FnBPA rolü de heterolog ifade host Lactococcus lactis kullanarak ortaya konabilir. L. plazmid kodlanmış FnBPA Açıklanması lactis (pRM9 9) anlamlı hiçbir FnBPA (KVK) (açık barlar, Şekil 1B) ifade bakterilere göre endotel hücrelerine yapışma geliştirmek vermedi. Buna karşılık, L. FnBPA-ifade lactis olmayan ifade suşu (kapalı bar, Şekil 1B) göre anlamlı derecede yüksek düzeyde endotel hücreleri istila etti.
Deneyler, iki nüsha halinde dört kez ve ortalama ± standart sapma sunulmaktadır yapıldı. * WT veya CTL değerleri (p <0.05) istatistiksel olarak anlamlı derecede farklı verileri temsil eder.
Şekil 1, EA Invasion . S. Hy926 endotel hücreleri aureus (A) veya L. lactis (B).
Discussion
Tarif tahlil ana hücreleri bakteriler tarafından işgali incelemek için yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır gentamisin koruma testi dayanmaktadır. Gentamisin ve diğer hücre içi bakteri öldürmek için antibiyotik edememe Gözlemler bakteri 4-8 ev sahibi hücrelerin işgali erken çalışmalarında kullanılmıştır. 24, 48 hatta 96-kuyucuğu kullanılması büyük miktarda zaman ve nispeten düşük maliyetle kısa bir süre içinde nicel ve tekrarlanabilir veri üretimi sağlar. Hiç uzman ekipman gerektirir, çeşitli bakteri ve hücreleri ile çalışmak için uygun olabilir, ve işgali 9 hem bakteri ve konak hücre süreçlerinin rolünü araştırmak için kullanılabilir çünkü tahlil de çekici. Gerçekten de, ilk deneylerde bu yana, gentamisin koruma testinin yaygın konak hücre işgali ölçmek için bir dizi farklı bakteri veya bakteri 10,11 bile kombinasyonları istihdam edilmiştir. Temel ilkeler, yöntem aynı, çok ince varyasyonların olsa bildirilmiştir. Bu yazıda bizim sürümü açıklanan ve değişiklikler diğer bakteri veya konak hücreler için gerekli olabilir göstermiştir. Konak hücre işgali, dikkate alınması gereken önemli noktalar vardır bu yaklaşım kullanarak ölçmek için bir deney tasarımı:
Gentamisine Bakteriyel hassasiyet. Bu apaçık ortada, ama çalışılan bakteri konsantrasyonu, sıcaklık ve süre boyunca kullanılmak üzere gentamisin duyarlı olmasını sağlamak için önemlidir. Duyarsızlık söz konusu olduğunda, diğer antibiyotiklere 5 kullanmak mümkün olabilir. Parçalayıcı enzimler (lysostaphin, mutanolysin, lizozim) 12 kullanmak için alternatif bir yaklaşım olabilir.
Kuluçka ve inokulum ilk kez bu testte yaparken kullanılacak en uygun inkübasyon sürelerinde ve bakteriyel inokulum kurmak için önemlidir. Bu nedenle, ilk deneylerde, zaman içinde yapışma ve invazyon (6 saat 5 dakika) hem de incelemek gerekir. Bu işgali enfeksiyon çokluğu tarafından nasıl etkilendiğini değerlendirmek için de önemlidir (İçişleri Bakanlığı; hücre başına bakteri sayısı). Genel olarak bu kültür hücrelerinin hasarı azaltacaktır mümkün olan en az sayıda bakteri kullanmak en iyisidir. Uzun kuluçka dönemleri veya büyük inocula 9,13 kullanılması halinde suşlar arasında önemli farklılıklar kaçırmış olabilir.
Hücresel hasar kullanmadan önce bakterileri yıkamak önemlidir. Ancak, hücresel hasar toksin üretimi ile sınırlı değildir. Bakteriyel işgali, apoptoz ve normal hücresel işlevlerin bozulması indüksiyon hücre hasarına neden olabilir. Bu içselleştirilmiş bakterileri öldürerek ve işgali 14 oluştu olduğu izlenimi veren, gentamisin hücre içine nüfuz etmesine yol açabilir.
İnkübasyon koşulları, sıcaklık ve kültür ortamı bileşimi işgali üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir . Örneğin, HeLa hücrelerinde Streptococcus pyogenes tarafından işgali, genellikle serum 15 çözünür fibronektin, varlığı bağlıdır . Diğer bir önemli husus, kültür ortamında deney seyri sırasında bakteriyel büyüme.
Kültür ve hücre içi bakteri ölçümü. TX-100 hücre içi bakterileri öldürmek olsa da, onların büyüme inhibe edebilir. Gibi, katı ortam üzerinde deterjan varlığında bakteriyel çoğaltma kontrol etmek için önemlidir. Etkilenen nerede, deterjan düşük konsantrasyonlarda kullanmak veya böyle bir saponin alternatif olarak kullanmak mümkün olabilir. Kristal viyole boyama ve mikroskopi tahlil üzerinden gentamisin koruma testinin bir yararı da, yoğun daha az emek olduğunu ve bu algılama ve içselleştirilmiş bakteriler alt popülasyonlarının farklılaşma sağlar. Örneğin, S. aureus (NCT) ya da normal bir koloni tipi veya bireysel bakteri hücrelerinin mikroskobu ile ayırt edilebilir olmayacaktır küçük koloni varyant (SCV) 16, üretebilir. 17 'yaşayabilir ama olmayan kültürlenebilen' devlet tespit edilecektir girmek hücre içi bakteri ve hücre topaklanma muhasebeleştirilir gentamisin koruma tahlil üzerinde kristal viyole boyama ve mikroskopi tahlil bir yararı olabilir.
Bakteri istilası konak hücre süreçlerinin rolü incelenmesi. Birçok çalışma, aktin düzenlenmesi ile müdahale cytochalasin D, konak hücre fonksiyonu inhibitörleri istihdam var. Bu tür çalışmalar da antikorlar içerebilir hedef hücre yüzey reseptörleri ve belirli genlerin 18 siRNA demonte . Bu tedaviler kültür hücreleri canlılığını veya ek etkiler veya bakteriler üzerinde toksik etkilere sahip olduğunu sağlamak için hayati önem taşımaktadır.
Gelecekteki yönelimler:
Bu testte genellikle çok iyi hücre kültürü plakaları yapılır ontent "> Çünkü bu potansiyel hücre fonksiyonu inhibitörlerinin kütüphanelerin incelenmesi, enfeksiyonlar ya da ilgili olabilir, yüksek verimli bir tarama çalışma için uyarlamak için teorik olarak mümkün. hücre içi bakteri hedef için tasarlanmış antibiyotikler. Alternatif olarak, böyle bir yaklaşımın mutant kütüphaneler ekrana yapışma, işgal ya da hücre içi sağkalım ilgili genleri tanımlamak için kullanılan olabilir, bazı durumlarda model sistem kesme kuvvetleri (akış) de istenebilir Örneğin endotel modelleme zaman daha yakından in vivo ortamda taklit etmek için akış hücreleri ve mikroakışkan hücre kültürü sistemleri tasarımı ve üretimi, güncel gelişmeler, kesme kuvvetleri dahil konak-patojen modelleri gentamisin koruma tahlil istihdam imkanı da sağlar .Özetle, burada açıklanan protokol uzun yıllardır kullanılan benzer yaklaşımlar üzerine kuruludur. Bu yaygın kültür hücreleri ve bakteri türlerinin birçok türleri için geçerli olup, hızlı ve nispeten daha az maliyetle büyük miktarda veri oluşturabilir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Wellcome Trust (WT 0.795.880) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 31885-023 | |
| Brain heart infusion | BioChemika | 53286 | |
| F–tal bovine serum | Invitrogen | 10091-148 | |
| HUVECs | Lonza Inc. | CC-2519 | |
| Endothelial basal medium | Lonza Inc. | CC-3121 | |
| Bovine brain extract (including heparin) | Lonza Inc. | CC-4092 | |
| Human endothelial growth factor | Lonza Inc. | CC-4017C | |
| Hydrocortisone | Lonza Inc. | CC-4035C | |
| GA-1000 | Lonza Inc. | CC-4092C | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710 | |
| Lysostaphin | AMBI | LSPN-50 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TKT-210-330P | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Cytopath | TCS Biosciences | HC8595 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | C3886 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| T75 flasks | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 430641 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C2618 | |
| Methyl-B-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | 332615 |
References
- Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 3734-3737 (1983).
- Makino, S., van Putten, J. P., Meyer, T. F. Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells. EMBO J. 10, 1307-1315 (1991).
- Schwarz-Linek, U., Werner, J. M., Pickford, A. R., Gurusiddappa, S., Kim, J. H., Pilka, E. S., Briggs, J. A., Gough, T. S., Höök, M., Campbell, I. D., Potts, J. R. Pathogenic bacteria attach to human fibronectin through a tandem beta-zipper. Nature. 423, 177-181 (2003).
- Magoffin, R. L., Spink, W. W. The protection of intracellular Brucella against streptomycin alone and in combination with other antibiotics. J. Lab. Clin. Med. 37, 924-930 (1951).
- Mandell, G. L.
- Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrob. Agents Chemother. 16, 743-749 (1979).
- De Melo, M. A., Pechere, J. C. Effect of mucin on Campylobacter jejuni association and invasion on HEp-2 cells. Microb. Pathog. 5, 71-76 (1988).
- Shaw, J. H., Falkow, S. Model for invasion of human tissue culture cells by Neisseria gonorrhoeae. Infect. Immun. 56, 1625-1632 (1988).
- Edwards, A. M., Potts, J. R., Josefsson, E., Massey, R. C. Staphylococcus aureus Host Cell Invasion and Virulence in Sepsis is Facilitated by the Multiple Repeats within FnBPA. PLoS Pathog. 6 (6), e1000964-e1000964 (2010).
- Meyer, D. H., Sreenivasan, P. K., Fives-Taylor, P. M. Evidence for invasion of a human oral cell line by Actinobacillus actinomycetemcomitans. Infect. Immun. 59, 2719-2726 (1991).
- Edwards, A. M., Grossman, T. J., Rudney, J. D. Fusobacterium nucleatum transports noninvasive Streptococcus cristatus into human epithelial cells. Infect. Immun. 74, 654-662 (2006).
- Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis. Infect. Immun.. 66, 5994-5998 (1998).
- Schröder, A., Schröder, B., Roppenser, B., Linder, S., Sinha, B., Fässler, R., Aepfelbacher, M. Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells. Mol. Biol. Cell. 17, 5198-5210 (2006).
- Molinari, G., Rohde, M., Talay, S. R., Chhatwal, G. S., Beckert, S., Podbielski, A. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol. Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Cue, D., Dombek, P. E., Lam, H., Cleary, P. P. Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells. Infect. Immun. 66, 4593-4601 (1998).
- Eiff, C. von Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians. Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).
- Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells. Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).
