Summary
Un protocole général pour l'étude de l'invasion des cellules hôtes par une bactérie pathogène, en se concentrant sur
Abstract
Ici, nous allons décrire comment nous étudions l'invasion des cellules endothéliales humaines par Staphylococcus aureus bactérie pathogène. Le protocole général peut être appliqué à l'étude de l'invasion des cellules par pratiquement toute bactérie cultivable. Les étapes au cours desquelles des aspects spécifiques de l'invasion peut être étudiée, comme le rôle de réarrangement actine ou cavéoles, sera mis en surbrillance. Les cellules hôtes sont cultivées dans des fioles et quand prêt à l'emploi sont ensemencées dans des plaques 24 puits contenant des lamelles Thermanox. En utilisant des lamelles permet l'élimination ultérieure des cellules dans les puits pour réduire les interférences à partir de protéines de sérum déposé sur les côtés du puits (à laquelle S. aureus serait joindre). Les bactéries sont cultivées à la densité requise et lavées pour éliminer toutes les protéines sécrétées (par exemple les toxines). Lamelles avec des couches confluentes de cellules endothéliales sont transférées à de nouvelles plaques de 24 puits contenant du milieu de culture frais, avant l'addition de bactéries. Les bactéries et les cellules sont ensuite incubées ensemble pour la quantité de temps requise à 5% de CO 2 à 37 ° C. Pour S. Staphylococcus ce n'est généralement entre 15-90 minutes. Lamelles Thermanox sont retirés de chaque puits et dip-lavées dans du PBS pour éliminer les bactéries seules. Si le total de bactéries associées (adhérentes et intériorisé) doivent être quantifiés, des lamelles sont ensuite placés dans un endroit bien frais contenant 0,5% de Triton X-100 dans le PBS. Pipetage doux entraîne une lyse cellulaire complète et les bactéries sont énumérés par dilution en série et étalement sur gélose. Si le nombre de bactéries qui ont envahi les cellules est nécessaire, des lamelles sont ajoutés aux puits contenant 500 pl de milieu de culture tissulaire complété par la gentamicine et l'incubation poursuivie pendant 1 h, ce qui va tuer toutes les bactéries externes. Lamelles peut ensuite être lavé, les cellules lysées et les bactéries énumérés par étalement sur gélose comme décrit ci-dessus. Si l'expérience nécessite une visualisation directe, lamelles peuvent être fixées et colorées pour la microscopie optique, la fluorescence ou confocal ou préparés pour la microscopie électronique.
Protocol
Le protocole suivant décrira l'étude de l'invasion des cellules endothéliales par S. aureus, mais peuvent théoriquement être utilisés pour étudier l'invasion cellulaire par toute bactérie cultivable. Étapes spécifiques à S. cellules endothéliales et de Staphylococcus aureus sont indiqués.
1. Préparation des bactéries
- Culture S. pour les souches de Staphylococcus 4-16 h (selon la phase de croissance requis) dans 10 ml d'infusion cerveau-coeur (BHI) à 37 ° C dans l'air avec agitation à 200 rpm. Ces conditions de croissance sont spécifiques pour S. aureus et peut-être besoin d'être adapté pour d'autres bactéries.
- Lavez les bactéries à trois reprises dans le milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM; Invitrogen) par tours suppléant de centrifugation à la température ambiante (5000 x g, 10 min), l'enlèvement du surnageant de culture et de la remise en suspension du culot bactérien dans un volume équivalent de DMEM. Mesurer la densité optique de la suspension résultant de bactéries qui peuvent ensuite être ajustés selon les besoins. Pour S. aureus, nous préparons une suspension à DO600 = 1, ce qui correspond à ~ 10 9 cfu ml -1.
2. Culture de cellules endothéliales
- Culture de la lignée cellulaire endothéliale EA.hy926 1 dans DMEM supplémenté avec du sérum de veau fœtal (FBS; 10%) et la L-glutamine (2 mM) à 37 ° C dans 5% de CO 2. Alternativement, les cellules humaines primaires regroupés endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) peuvent être achetés auprès de Lonza (Bâle, Suisse) et cultivées dans un milieu de base endothéliales supplémenté avec 2% de FBS, extrait de cerveau bovin (y compris l'héparine), facteur de croissance endothélial humain et l'hydrocortisone à 37 ° C en 5% de CO 2 selon les instructions du fabricant (Lonza). Ces conditions de croissance sont spécifiques à ces cellules et peut-être besoin d'être adapté à d'autres types de cellule hôte.
- Cultiver des cellules endothéliales dans les flacons T75 pour compléter confluence, vérifiée par l'œil.
- Préparer les plaques de 24 puits pour l'insertion des lamelles. Pinces fines (flamme stérilisés) sont nécessaires pour déplacer les lamelles, qui ont une surface opaque et un brillant. Lamelles Placer dans le puits de la plaque de 24 puits avec la surface opaque vers le haut pour permettre la fixation des cellules.
- Libérez les cellules du ballon T75 avec 3 ml de trypsine-EDTA (0,25%) et ajouter 10 ml du milieu de culture concernés.
- Ajouter 500 ul de cellules remises en suspension à des plaques 24 puits contenant des lamelles en verre Thermanox. Un flacon T75 confluente de cellules fourni suffisamment de cellules pour deux plaques de 24 puits, résultant en environ 5 × 10 5 cellules par puits (dans 500 pl de milieu).
- Incuber les plaques pendant 48 h comme décrit ci-dessus, et vérifier 100% de confluence des cellules par microscopie optique inversée.
- Trempez-wash lamelles dans du PBS et ajouter de nouvelles plaques de 24 puits contenant 490 ul DMEM contenant 10% de FBS dans chaque puits.
- Pour examiner le rôle des processus métaboliques spécifiques dans l'invasion cellulaire, les inhibiteurs peuvent être ajoutés à des cellules cultivées 1 h avant l'ajout des bactéries et des concentrations maintenue pendant le dosage. Par exemple, pour déterminer le rôle de réarrangement d'actine dans S. l'invasion des cellules endothéliales aureus, 50 uM cytochalasine D peuvent être ajoutés ou pour le rôle des cavéoles, 5 mM méthyl-β-cyclodextrine peut être ajoutée.
3. Assay Invasion
- Ajouter 10 ul de bactéries lavées (résultant en environ 2 × 10 7 cfu ml -1 S. aureus) dans chaque puits contenant une lamelle lavés avec une couche confluente de cellules endothéliales dans 490 ul DMEM contenant 10% de FBS.
- Incuber pendant 15-90 minutes à 37 ° C dans 5% de CO 2.
- Pour mesurer le nombre total de bactéries associées aux cellules (adhérentes et intériorisé), trempez-laver les lamelles à trois reprises dans du PBS et ajouter aux puits frais contenant 500 ul de 0,5% de Triton X-100 dans le PBS. Pour assurer les cellules totalement lyser et libérer toutes les bactéries internalisées, pipetter le plusieurs fois, pointant le bout de la pipette directement sur la surface de la lamelle.
- Énumérer les bactéries en étalant le liquide en suspension (ou des dilutions de cette si nécessaire) sur la surface des plaques de TSA. Depuis TX-100 lyseront nombreuses bactéries Gram-négatives, la saponine peut être utilisé à la place 2.
- Pour mesurer le nombre de bactéries internalisées, enlever le surnageant de culture de chaque puits contenant des bactéries non liée et la remplacer par 500 ul FBS DMEM/10% additionné de 200 pg ml -1 gentamicine. Nous utilisons régulièrement la gentamicine, plutôt que lysostaphine ici car il est moins cher et nous permet de basculer entre les expériences en utilisant différents types de bactéries (par exemple les staphylocoques et les lactocoques) sans avoir à modifier le protocole expérimental.
- Incuber les plaques à 37 ° C dans 5% de CO 2 pendant 60 minutes pour tuer toutes les bactéries extracellulaires.
- Lavez lamelles 3 fois en PBS,lyser et d'énumérer par étalement sur TSA comme décrit pour le dosage d'adhésion ci-dessus.
- Dans certains cas il peut être préférable de visualiser compter le nombre de bactéries en utilisant la microscopie optique. Dans ce cas, et spécifiques à S. l'invasion des cellules aureus, l'utilisation lysostaphine (10 pg ml -1) au lieu de gentamicine de détruire physiquement les bactéries extracellulaires.
- Incuber lamelles pendant 20min à 37 ° C en CO 2 dans la solution lysostaphine, puis rincez et fixer avec Cytopath (Cellpath).
- Déluge les lamelles avec du cristal violet (0,5%, p / v) pendant 5 min.
- Trempez-rincer à l'eau, sécher à l'air et monter sur des lames de verre. Le nombre de bactéries par mm 2 de confluence les cellules endothéliales peuvent être quantifiés en utilisant la microscopie optique.
4. Les résultats représentatifs:
L'expression de la fibronectine protéines de liaison (FnBPA et FnBPB) sur la surface de S. Staphylococcus confère la capacité d'envahir les cellules endothéliales. Des travaux récents ont redéfini le domaine de liaison de la fibronectine FnBPA 3. De type sauvage (WT) S. Staphylococcus 8325,4 envahit les cellules endothéliales avec une grande efficacité, tout en manquant à la fois une souche FnBPA et B (Δ FNB) ont montré des niveaux significativement réduit d'internalisation (figure 1A). La complémentation du mutant avec un plasmide codant pour la FNB a moins le domaine liant la fibronectine (pFnR0) n'a pas favorisé l'invasion (figure 1A). En revanche, la complémentation du mutant avec un plasmide codant pour la FNB ensemble un gène (pFnBA4) restaurés à des niveaux d'invasion WT (figure 1A).
Le rôle de FnBPA dans l'invasion des cellules endothéliales peut également être démontrée en utilisant les lactis expression de l'hôte hétérologue Lactococcus. Expression de plasmidique FnBPA dans L. lactis (pRM9 9) n'a pas significativement améliorer l'adhérence aux cellules endothéliales par rapport aux bactéries n'exprimant pas FnBPA (CTL) (open bars, figure 1B). En revanche, FnBPA exprimant L. lactis ont envahi les cellules endothéliales à des niveaux sensiblement plus élevés que la souche non-exprimant (bars fermés, figure 1B).
Des expériences ont été réalisées quatre fois en double et la moyenne ± écart type est présenté. * Représenter des données qui sont statistiquement significativement différent (p = <0,05) de WT ou des valeurs de CTL.
Figure 1. Invasion de EA. Hy926 cellules endothéliales par S. aureus (A) ou L. lactis (B).
Discussion
Le test que nous décrivons est basé sur le dosage de protection gentamicine, qui a été largement utilisée pour étudier l'invasion des cellules hôtes par des bactéries. Observations de l'incapacité des antibiotiques gentamicine et d'autres pour tuer les bactéries intracellulaires ont été utilisés dans les premières études sur l'invasion des cellules hôtes par les bactéries 4-8. L'utilisation de 24, 48 ou même des plaques 96 puits permet la génération de grandes quantités de données quantitatives et reproductibles dans un court laps de temps et à un coût relativement faible. Le test est également intéressante, car elle ne nécessite aucun équipement spécialisé, il peut être adapté pour fonctionner avec diverses bactéries et les cellules, et peut être utilisée pour étudier le rôle des processus cellulaires bactériennes et d'accueil dans l'invasion 9. En effet, depuis les premiers essais, le dosage de protection de gentamicine a été largement utilisé pour mesurer l'invasion de la cellule hôte par un éventail de bactéries différentes ou même des combinaisons de bactéries 10,11. Alors que les principes de base sont les mêmes, beaucoup de subtiles variations dans la méthode ont été rapportés. Dans cet article nous avons décrit notre version et indiqué où des modifications peuvent être nécessaires pour d'autres bactéries ou des cellules hôtes. Lors de la conception d'une expérience pour mesurer l'invasion de la cellule hôte en utilisant cette approche il ya un certain nombre de points importants à considérer:
La sensibilité des bactéries à la gentamicine. Cela peut sembler évident, mais il est important de s'assurer que la bactérie étudiée est sensible à la gentamicine à la concentration, la température et sur la durée du temps à être utilisé. Dans le cas d'insensibilité, il peut être possible d'utiliser d'autres antibiotiques 5. Une approche alternative peut être d'utiliser des enzymes lytiques (lysostaphine, mutanolysine, lysozyme) 12.
L'incubation et l'inoculum. Lorsque vous effectuez ce test pour la première fois, il est important d'établir le temps d'incubation optimal et inoculum bactérien à être utilisé. Par conséquent, les premières expériences devraient examiner à la fois adhésion et d'invasion dans le temps (5 min jusqu'à 6 h). Il est également important d'évaluer comment l'invasion est affectée par la multiplicité d'infection (MOI, le nombre de bactéries par cellule). En général, il est préférable d'utiliser le moins de bactéries possible car cela permettra de réduire les dommages aux cellules cultivées. Des différences importantes entre les souches peuvent être manquées si les périodes d'incubation prolongée ou inoculums importants sont utilisés 9,13.
Les dommages cellulaires. Il est important de se laver les bactéries avant leur utilisation. Toutefois, les dommages cellulaires n'est pas limitée à la production de toxines. L'invasion bactérienne, l'induction de l'apoptose et la perturbation des fonctions cellulaires normales peuvent tous causer des dommages cellulaires. Cela peut conduire à la pénétration de la gentamicine dans la cellule, tuant les bactéries internalisées et donnant l'impression que l'invasion n'a pas eu lieu 14.
Les conditions d'incubation. La température et la composition du milieu de culture peut avoir un impact significatif sur l'invasion. Par exemple, l'invasion des cellules HeLa par Streptococcus pyogenes est tributaire de la présence de fibronectine soluble, qui est généralement présente dans le sérum 15. Une autre considération est la croissance bactérienne dans le milieu de culture au cours de l'expérience.
Culture et quantification des bactéries intracellulaires. Bien TX-100 ne peut pas tuer les bactéries intracellulaires, il peut inhiber leur croissance. Comme tel, il est important de vérifier la réplication bactérienne sur un milieu solide, en présence du détergent. Où affectée, il peut être possible d'utiliser des concentrations plus faibles de la lessive ou d'utiliser une alternative comme la saponine. Un des avantages de l'épreuve de protection de gentamicine sur la coloration au cristal violet et le dosage de microscopie est qu'elle est moins laborieuse, et elle permet la détection et la différenciation des sous-populations de bactéries internalisées. Par exemple, S. aureus peut produire soit un type de colonie normale (TRN), ou la variante petite colonie (SCV) 16, qui ne serait pas distinguables par microscopie des cellules individuelles bactérienne. Un des avantages de la coloration au cristal violet et le dosage de microscopie sur le dosage de protection gentamicine est l'agglutination de cellules peuvent être comptabilisées et que les bactéries intracellulaires qui entrent dans un «viables mais non cultivables" état sera détecté 17.
Examiner le rôle des processus de la cellule hôte dans l'invasion bactérienne. De nombreuses études ont utilisé des inhibiteurs de la fonction des cellules hôtes telles que la cytochalasine D, ce qui interfère avec réarrangement d'actine. De telles études peuvent aussi inclure des anticorps qui ciblent les récepteurs de surface cellulaire et démontable siARN de gènes spécifiques 18. Il est extrêmement important de s'assurer que ces traitements n'affectent pas la viabilité ou la fixation des cellules en culture ou d'avoir des effets toxiques sur les bactéries.
Les orientations futures:
ONTENU "> Parce que ce dosage est généralement effectuée dans les plaques multi-puits culture cellulaire, il est théoriquement possible de l'adapter à une opération de criblage à haut débit, ce qui pourrait impliquer l'examen des bibliothèques du potentiel des inhibiteurs de la fonction des cellules, des anti-infectieux ou antibiotiques conçus pour cibler des bactéries intracellulaires. Alternativement, une telle approche pourrait être utilisée pour cribler des bibliothèques mutant à identifier les gènes impliqués dans l'adhésion, d'invasion ou de survie intracellulaire. Dans certains cas, il peut être souhaitable d'inclure les forces de cisaillement (flux) dans le système modèle, par exemple lors de la modélisation de l'endothélium, pour mieux imiter l'environnement in vivo. Les progrès actuels dans la conception et la fabrication de cellules d'écoulement et de microfluidique systèmes de culture cellulaire de fournir la possibilité d'employer le dosage de la protection de la gentamicine hôte-pathogène des modèles qui intègrent les forces de cisaillement.En résumé, le protocole décrit ici est basé sur des approches similaires utilisés depuis de nombreuses années. Il est largement applicable à de nombreux types de cellules cultivées et des espèces bactériennes et peut générer de grandes quantités de données rapidement et à un coût relativement peu.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par le Wellcome Trust (WT 0795880).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 31885-023 | |
| Brain heart infusion | BioChemika | 53286 | |
| F–tal bovine serum | Invitrogen | 10091-148 | |
| HUVECs | Lonza Inc. | CC-2519 | |
| Endothelial basal medium | Lonza Inc. | CC-3121 | |
| Bovine brain extract (including heparin) | Lonza Inc. | CC-4092 | |
| Human endothelial growth factor | Lonza Inc. | CC-4017C | |
| Hydrocortisone | Lonza Inc. | CC-4035C | |
| GA-1000 | Lonza Inc. | CC-4092C | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710 | |
| Lysostaphin | AMBI | LSPN-50 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TKT-210-330P | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Cytopath | TCS Biosciences | HC8595 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | C3886 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| T75 flasks | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 430641 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C2618 | |
| Methyl-B-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | 332615 |
References
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