Summary
에 초점을 세균성 병원체에 의해 호스트 세포의 침략의 연구를위한 일반적인 프로토콜
Abstract
여기서 우리는 세균 병원체 포도상 구균에 의해 인간 내피 세포의 침공을 연구하는 방법을 설명합니다. 일반적인 프로토콜은 거의 모든 culturable 세균에 의해 세포 침략의 연구에 적용할 수 있습니다. 같은 굴지의 다시 정리하기 또는 caveolae의 역할과 같은 침략의 특정 측면을 연구 할 수있는에있는 단계는, 강조 표시됩니다. 호스트 세포 flasks 재배하고 때 사용할 준비가 Thermanox의 coverslips를 포함 24 자 접시에 씨앗을 품고 있습니다. coverslips을 사용하면 우물에서 세포의 후속 제거 우물 (S. 구균은 첨부하는 것입니다)의 측면에 예금 혈청 단백질로부터 간섭을 줄일 수 있습니다. 박테리아가 필요한 밀도로 성장하고 분비 단백질 (예 : 독소) 제거 씻어 수 있습니다. 내피 세포의 합류 레이어 Coverslips은 세균의 추가되기 전에 새로운 문화 매체를 포함하는 새로운 24 잘 접시로 전송됩니다. 박테리아와 세포가 다음 37 5% CO 2 시간의 필요한 양을 함께 incubated 아르 ° C. S. 들어 구균이 일반적으로 15-90분 사이입니다. Thermanox의 coverslips는 각 우물에서 제거하고 무소속의 박테리아를 제거하는 PBS에서 수영 - 세탁 있습니다. 총 관련된 박테리아 (자기편과 internalized)을 계량하는 경우, coverslips 그 다음 PBS에서 X - 100 0.5 % 튼이 포함된 새로운 우물에 배치됩니다. 젠틀 pipetting는 세포 용해를 완료하고 세균을 한천 배지에 희석 직렬 및 도금에 의해 열거됩니다 리드. 세포를 침공이 박테리아의 수가이 필요한 경우, coverslips는 모든 외부 박테리아를 죽일거야 gentamicin과 부화로 보충 500 μl 조직 문화 매체를 포함하는 우물 1 H 지속에 추가됩니다. Coverslips가 다음 씻어 수 세포가 lysed하고 위에 설명된대로 박테리아 한천에 도금하여 열거. 실험 직접 시각화를 필요로 할 경우, coverslips은 고정과 스테인드, 빛 형광 또는 공촛점 현미경 또는 전자 현미경에 대비하실 수 있습니다.
Protocol
다음 프로토콜은 S.에 의해 내피 세포의 침략의 연구를 설명합니다 구균하지만은 이론적으로 모든 culturable 세균에 의해 세포 침략을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. S. 특정 단계 구균과 내피 세포가 표시됩니다.
1. 박테리아의 준비
- 문화 S. 37 10 ML 뇌 - 심장 주입 (BHI) 국물에 4-16 H (필수 성장 단계에 따라 다름) ° C 200 rpm으로 잡고 공중에 대한 구균의 변종. 이러한 성장 조건 S.에 대한 구체적인 구균 및 기타 세균에 맞게해야 할 수 있습니다.
- 실온 (5,000 X g, 10 분), DMEM의 상응하는 볼륨에있는 세균성 펠렛의 문화 뜨는 및 resuspension 제거에서 원심 분리의 다른 라운드로, 박테리아에게 Dulbecco의 수정된 이글의 중간에 세 번 (Invitrogen DMEM)을 씻으십시오. 필요에 따라 다음 조정할 수 있습니다 박테리아의 발생 정지의 광학 밀도를 측정합니다. S. 들어 구균, 우리는 ~ 10 9 cfu ML -1에 해당하는 OD 600 = 1에서 중지를 준비합니다.
2. 내피 세포 배양
- 37과 L - 글루타민 (2 ㎜) ° C 5 % CO 2를, 문화 DMEM에있는 내피 세포 라인 EA.hy926 1 태아 소 혈청 (10 % FBS)과 보완. 또는 풀링 기본 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs) Lonza (스위스 바젤)에서 구입하여 37 2% FBS, 소 뇌 추출물 (헤파린 포함), 인간 내피 성장 인자와 하이드로코티손와 보충 내피 기초 매체 교양 수 있습니다 ° C 5 % CO 2 제조 업체의 지침 (Lonza)에 따라. 이러한 성장 조건이 세포에 대한 구체적인되며 다른 숙주 세포 유형에 대한 적응해야 할 수 있습니다.
- 눈으로 확인, confluency 완료 T75 flasks의 내피 세포를 성장.
- coverslips의 삽입을위한 24 잘 접시를 준비합니다. 좋은 포셉는 (화염 소독) 1 불투명 하나 반짝 이는 표면을 가지고 coverslips를 이동 필요합니다. 셀 첨부 파일을 허용하는 이상 직면하고있는 불투명 표면 24 잘 접시의 우물에서 플레이스 coverslips.
- 3 ML 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.25 %)와 T75 플라스크에서 세포를 해방 및 관련 문화 매체의 10 ML에 추가할 수 있습니다.
- Thermanox 유리 coverslips를 포함하는 24 잘 접시에 resuspended 셀 500 μl를 추가합니다. 세포 중 하나 T75 합류 플라스크는 약 5 × 잘 발생 당 10 5 세포를 (500 μl 매체) 두 24 잘 접시에 충분한 세포를 제공했습니다.
- 위에서 설명한대로 48 H에 대한 번호판을 품어하고, 거꾸로 가벼운 현미경에 의해 confluency 100 % 세포를 확인하십시오.
- 딥 - 세척 PBS에서 coverslips을 각 잘에서 10 % FBS를 포함한 DMEM 490 μl를 포함하는 새로운 24 잘 접시에 추가할 수 있습니다.
- 셀 침공에서 특정 대사 과정의 역할을 확인하려면, 저해제는 H 전 분석 기간 동안 유지 박테리아와 농도의뿐만 아니라 교양 세포 하나에 추가할 수 있습니다. 예를 들어, 미국에서 굴지의 다시 정리하기의 역할을 결정하기 위해 내피 세포의 구균의 침공, 50 μm의 cytochalasin D가 추가될 수 있습니다, 또는 caveolae 5의 역할에 대한 MM은 메틸 - β - 사이클로 덱스트린 추가할 수 있습니다.
3. 상륙 작전 분석
- 잘 10% FBS를 포함한 DMEM 490 μl의 내피 세포의 합류 레이어로 씻은 coverslip을 포함하는 각 씻어 세균 10 μl를 (약 2 × 10 7 cfu ML -1 S. 구균의 결과)을 추가합니다.
- 37 15-90분에 대한 품어 ° C를 5% CO 2인치
- 세포 (자기편과 internalized)과 관련된 세균의 총 수를 측정하려면 coverslips에게 PBS로 세 번 찍어 - 씻어과 PBS 500 μl 0.5 % 트리톤 X - 100을 포함하는 새 우물을 추가할 수 있습니다. 세포가 완전히 모든 internalized 박테리아를 lyse하고 릴리스하기 위해, 직접 coverslip의 표면에있는 피펫의 팁을 지적, 여러 번 피펫.
- TSA 플레이트의 표면에 액체 현탁액 (또는 필요의 dilutions)을 도금하여 박테리아를 열거합니다. TX - 100는 많은 그람 음성 박테리아를 lyse 때문에, 사포닌 대신이 사용할 수 있습니다.
- internalized 박테리아의 수를 측정하려면 각 물론 포함 언바운드 박테리아의 문화 뜨는을 제거하고 200 μg ML -1 gentamicin과 보충 500 μl DMEM/10 % FBS로 바꿉니다. 우리는 일상적으로 그것이 저렴 여기에 오히려 lysostaphin보다 gentamicin을 사용하여 우리가 실험 프로토콜을 변경하지 않고 세균의 종류 (예 : Staphylococci 및 Lactococci)를 사용하여 실험을 전환할 수 있습니다.
- 37 접시를 품어 ° C 모든 세포 박테리아를 죽이는 60 분 5 % CO 2인치
- , coverslips에게 PBS로 3 회 씻어TSA에 도금하여 lyse 및 열거는 위의 부착 분석에 대해 설명했다.
- 어떤 경우에는 그것은 시각적으로 빛을 현미경을 사용하여 박테리아의 수를 계산하는 것이 바람직있을 수 있습니다. 이 경우, 그리고 특정 S.하기 구균 세포 침공은 물리적 세포외 박테리아를 파괴하는 대신 gentamicin의 lysostaphin (10 μg ML -1)을 사용합니다.
- 37 20 분 대한 coverslips을 품어 ° CO 2 C는 lysostaphin 솔루션에서 다음 씻어 Cytopath (Cellpath)로 수정.
- 5 분을위한 크리스탈 바이올렛 (0.5 %, W / V)와 coverslips을 홍수.
- 물, 공기 건조에 수영 - 씻어 유리 슬라이드에 탑재합니다. 합류 내피 세포의 mm 2 당 박테리아의 수는 빛을 현미경을 사용하여 계량하실 수 있습니다.
4. 대표 결과 :
S. 표면에 fibronectin 단백질 바인딩 표현 (FnBPA 및 FnBPB) 구균은 내피 세포를 침공하는 능력을 수여. 최근 작업은 FnBPA 3 fibronectin 바인딩 도메인을 재정의했다. 야생 유형 (WT) S. 구균 8325.4 높은 효율과 내피 세포를 침공, FnBPA 및 B (Δ fnb)를 모두 부족 부담이 크게 감소 internalisation의 수준 (그림 1A)을 보여주었다 반면. 플라스미드 인코딩 fnb과 돌연변이의 Complementation 마이너스 fibronectin 결합 도메인 (pFnR0)는 (그림 1A) 침략을 추진하지 않았다. 반대로, 플라스미드 인코딩 전체 fnb WT 수준 (그림 1A)에 침략을 회복 유전자 (pFnBA4)와 돌연변이의 complementation.
내피 세포의 침공에 FnBPA의 역할도 heterologous 표현 호스트 Lactococcus lactis를 사용하여 제품 시연 수 있습니다. L.의 플라스미드 인코딩 FnBPA 표현 lactis (pRM9 9) 크게도 FnBPA (CTL)을 (오픈 바, 그림 1B) 표현하지 박테리아에 비해 내피 세포 접착력을 강화하지 않았다. 반대로, 난 FnBPA - 표현 lactis가 아닌 표현을 변형 (폐쇄 바, 그림 1B)보다 상당히 높은 수준에서 내피 세포를 침공.
실험은 네 중복의 시간과 평균 ± 표준 편차가 제시을 수행했다. *이 WT 또는 CTL 값에서 (P는 = <0.05) 통계적으로 크게 다른 데이터를 나타냅니다.
그림 1. EA의 침략. S.에 의해 내피 세포 Hy926 구균 (A) 또는 L. lactis (B).
Discussion
우리가 설명하는 분석은 세균에 의해 호스트 세포의 침략을 연구하기 위해 널리 사용되었습니다 gentamicin 보호 분석에 따라 달라집니다. 세포내 박테리아를 죽이는 gentamicin과 다른 항생제의 무능력의 관찰은 세균 4-8으로 호스트 세포의 침공에 대한 초기 연구에 이용 하였다. 24, 48 또는 96 - 웰 플레이트의 사용 시간이 짧은 기간에 상대적으로 저렴한 비용 정량, 재현성 대용량 데이터의 생성하실 수 있습니다. 그것도 전문 장비를 필요로하지 않습니다, 그것은 다양한 박테리아와 세포와 함께 작동하도록 맞춤 수 있으며, 침공 9 박테리아와 호스트 둘 다 셀 프로세스의 역할을 연구하는 데 사용될 수 있기 때문에 분석도 매력적입니다. 사실, 최초의 실험 이후, gentamicin 보호 분석 널리 다른 세균이나 세균이 10,11의 조합도의 범위에 의해 숙주 세포의 침공을 측정하는 고용되었습니다. 핵심 원칙은 그 방법에서 같은 많은 미묘한 변화 아르 반면 것은보고되었습니다. 이 문서에서 우리는 우리의 버전을 설명하고 수정이 다른 세균이나 호스트 세포에 필요한 수 있습니다 어디에 표시합니다. 고려하는 것이 중요 포인트의 숫자가이 접근법을 이용하여 숙주 세포의 공격을 측정하는 실험을 디자인할 때 :
gentamicin에 박테리아 감도. 이것은 당연한 보일지도 모르지만,이 방법은 연구되고있는 박테리아는 농도, 온도 및 사용하는 시간이 기간 동안 gentamicin 쉽습 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 무감각의 경우, 다른 항생제에게 5 사용할 수 있습니다. 대체 접근법은 lytic 효소 (lysostaphin, mutanolysin, 라이 소 자임) 12를 사용하실 수 있습니다.
부화 및 inoculum가. 처음이 분석을 수행하면 그것은 사용할 최적의 배양 시간 및 박테리아 inoculum를 확립하는 것이 중요합니다. 따라서, 초기 실험은 시간이 지남에 따라 접착력과 침략 (최대 6 H 5 분)를 모두 검사해야합니다. 그것은 침략이 감염의 다중성에 의해 영향을 얼마나 평가하는 것도 중요하다 (뫄, 셀 당 박테리아의 숫자). 일반적으로 이것은 교양 세포에 손상을 줄일 수 가능한 박테리아의 가장 적은 번호를 사용하는 것이 최선입니다. 확장 부화 기간이나 대형 inocula는 9,13를 사용하는 경우 변종 사이의 중요한 차이점은 놓칠 수 있습니다.
세포 손상. 사용하기 전에 박테리아를 씻어하는 것이 중요합니다. 그러나, 세포 손상이 독소 생산에 국한되지 않습니다. 세균성 침략, apoptosis와 정상 세포 기능 장애의 유도는 세포 손상을 일으킬 수 있습니다. 이것은 internalized 박테리아를 죽이고 침략은 14 발생하지 않은 것으로 간주하고있다는 인상을주는, 셀에 gentamicin의 침투 될 수 있습니다.
배양 조건. 온도와 배지의 구성은 침략에 큰 영향을 줄 수 있습니다. 예를 들어, 연쇄상 구균의 pyogenes의 헬라 세포의 침공은 일반적으로 혈청 15 존재 용해 fibronectin의 존재에 의존적일 수 밖에 없습니다. 또 다른 고려 사항은 실험 과정 동안 배지에 박테리아 성장이다.
문화 세포내 박테리아의 부량. TX - 100 세포내 박테리아를 죽일 수 있지만, 그건 자신의 성장을 억제 수 있습니다. 따라서 세제의 면전에서 고체 미디어에 박테리아 복제를 확인하는 것이 중요합니다. 영향을 어디에, 그것은 세제의 낮은 농도를 사용하거나 같은 사포닌과 같은 대안을 사용할 수 있습니다. 크리스탈 보라색 얼룩 및 현미경 분석을 통해 gentamicin 보호 분석의 장점은 적은 노동 집약되어 있으며, 그것은 감지 및 internalized 박테리아의 하위 인구의 차별을 허용합니다. 예를 들어, S. 구균도 정상적인 식민지 유형 (NCT) 또는 개별 세균 세포의 현미경으로 구별할 수 없을 것입니다 작은 콜로니 변종 (SCV) 16, 생성할 수 있습니다. gentamicin 보호 분석을 통해 크리스탈 보라색 얼룩 및 현미경 분석의 장점은 셀 clumping이 17 '가능한하지만 비 culturable'상태가 감지됩니다를 입력 세포내 세균 및 그 집결 수 있습니다.
박테리아 침공의 숙주 세포 프로세스의 역할을 검토. 많은 연구와 같은 굴지의 다시 정리하기 방해 cytochalasin D, 같은 숙주 세포 기능의 억제제를 고용했습니다. 이러한 연구는 항체를 포함 수있는 대상 셀 표면의 수용체와 특정 유전자 18 siRNA의 최저. 그것은 이러한 치료는 교양 세포의 생존이나 첨부 파일을 영향을 미치거나 세균에 대한 독성 영향을 미칠하지 않도록 극히 중요합니다.
미래 방향 :
이 분석은 일반적으로 멀티 웰 세포 배양 접시에서 수행됩니다 ontent "> 때문에, 그것은 잠재적인 세포 기능 억제제의 라이브러리 심사, 안티 - infectives 또는 포함 수도 높은 처리량 심사 작업에 그것을 적응 이론적으로 가능합니다 세포내 박테리아를 대상으로 설계 항생제. 또는, 그러한 접근은 접착, 침공이나 세포 생존에 관련된 유전자를 확인하기 위해 돌연변이 라이브러리를 화면으로 사용할 수 있습니다. 어떤 경우에는 그것이 모델 시스템의 전단 세력 (흐름을) 포함하는 것이 바람직하다 수 있습니다 예를 들어 내피를 모델링 할 때, 좀 더 자세히 생체내 환경에서을 모방합니다. 플로우 셀 및 microfluidic 세포 배양 시스템의 설계 및 제조의 현재 발전 전단 세력을 통합 호스트 병원체 모델에서 gentamicin 보호 분석을 고용 가능성을 제공합니다.요약 여기에서 설명하는 프로토콜은 몇 년 동안 사용하는 유사한 접근 방식을 기반으로합니다. 그것은 널리 교양 세포와 세균 종의 다양한 종류에 적용됩니다 신속하고 비교적 적은 비용으로 대용량의 데이터를 생성할 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 웰컴 트러스트 (WT 0,795,880)에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 31885-023 | |
| Brain heart infusion | BioChemika | 53286 | |
| F–tal bovine serum | Invitrogen | 10091-148 | |
| HUVECs | Lonza Inc. | CC-2519 | |
| Endothelial basal medium | Lonza Inc. | CC-3121 | |
| Bovine brain extract (including heparin) | Lonza Inc. | CC-4092 | |
| Human endothelial growth factor | Lonza Inc. | CC-4017C | |
| Hydrocortisone | Lonza Inc. | CC-4035C | |
| GA-1000 | Lonza Inc. | CC-4092C | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710 | |
| Lysostaphin | AMBI | LSPN-50 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TKT-210-330P | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Cytopath | TCS Biosciences | HC8595 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | C3886 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| T75 flasks | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 430641 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C2618 | |
| Methyl-B-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | 332615 |
References
- Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 3734-3737 (1983).
- Makino, S., van Putten, J. P., Meyer, T. F. Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells. EMBO J. 10, 1307-1315 (1991).
- Schwarz-Linek, U., Werner, J. M., Pickford, A. R., Gurusiddappa, S., Kim, J. H., Pilka, E. S., Briggs, J. A., Gough, T. S., Höök, M., Campbell, I. D., Potts, J. R. Pathogenic bacteria attach to human fibronectin through a tandem beta-zipper. Nature. 423, 177-181 (2003).
- Magoffin, R. L., Spink, W. W. The protection of intracellular Brucella against streptomycin alone and in combination with other antibiotics. J. Lab. Clin. Med. 37, 924-930 (1951).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria. Antimicrob. Agents Chemother. 52, 1673-1679 (1973).
- Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrob. Agents Chemother. 16, 743-749 (1979).
- De Melo, M. A., Pechere, J. C. Effect of mucin on Campylobacter jejuni association and invasion on HEp-2 cells. Microb. Pathog. 5, 71-76 (1988).
- Shaw, J. H., Falkow, S. Model for invasion of human tissue culture cells by Neisseria gonorrhoeae. Infect. Immun. 56, 1625-1632 (1988).
- Edwards, A. M., Potts, J. R., Josefsson, E., Massey, R. C. Staphylococcus aureus Host Cell Invasion and Virulence in Sepsis is Facilitated by the Multiple Repeats within FnBPA. PLoS Pathog. 6 (6), e1000964-e1000964 (2010).
- Meyer, D. H., Sreenivasan, P. K., Fives-Taylor, P. M. Evidence for invasion of a human oral cell line by Actinobacillus actinomycetemcomitans. Infect. Immun. 59, 2719-2726 (1991).
- Edwards, A. M., Grossman, T. J., Rudney, J. D. Fusobacterium nucleatum transports noninvasive Streptococcus cristatus into human epithelial cells. Infect. Immun. 74, 654-662 (2006).
- Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis. Infect. Immun.. 66, 5994-5998 (1998).
- Schröder, A., Schröder, B., Roppenser, B., Linder, S., Sinha, B., Fässler, R., Aepfelbacher, M. Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells. Mol. Biol. Cell. 17, 5198-5210 (2006).
- Molinari, G., Rohde, M., Talay, S. R., Chhatwal, G. S., Beckert, S., Podbielski, A. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol. Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Cue, D., Dombek, P. E., Lam, H., Cleary, P. P. Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells. Infect. Immun. 66, 4593-4601 (1998).
- Eiff, C. von Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians. Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).
- Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells. Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).
