Summary
Ein allgemeines Protokoll für die Untersuchung der Invasion von Wirtszellen durch eine bakterielle Erreger, die sich auf
Abstract
Hier werden wir beschreiben, wie wir die Invasion von humanen Endothelzellen Studie durch bakterielle Erreger Staphylococcus aureus. Das allgemeine Protokoll kann auf das Studium der Zelle Invasion durch nahezu alle kultivierbaren Bakterien angewendet werden. Die Phasen, in denen spezifische Aspekte der Invasion untersucht werden können, wie die Rolle von Aktin Umlagerung oder Caveolae, wird hervorgehoben. Wirtszellen werden in Flaschen gezüchtet und wenn Sie bereit sind für den Einsatz werden in 24-well-Platten mit Thermanox Deckgläschen ausgesät. Mit Deckgläser ermöglicht nachträgliche Entfernung der Zellen aus den Vertiefungen zu Störungen von Serumproteinen auf die Seiten der Brunnen (auf die S. aureus würde beilegen) hinterlegt reduzieren. Bakterien sind, um die erforderliche Dichte gewachsen und gewaschen, um sezernierte Proteine (zB Toxine) zu entfernen. Deckgläser mit konfluenten Schichten von Endothelzellen, neue 24-well-Platten mit frischem Kulturmedium vor der Zugabe von Bakterien übertragen. Bakterien und Zellen werden dann gemeinsam für die benötigte Zeit in 5% CO 2 bei 37 ° C. Für S. aureus ist dies in der Regel zwischen 15-90 Minuten. Thermanox Deckgläser sind aus jeder Vertiefung entnommen und in PBS gewaschen zu tauchen, um ungebundene Bakterien zu entfernen. Wenn insgesamt assoziierten Bakterien (adhärent und verinnerlicht) zu quantifizieren sind, Deckgläser dann in ein frisches gut aufgestellt, das 0,5% Triton X-100 in PBS. Sanfte Pipettieren führt zu Zell-Lyse vollständig und Bakterien werden durch serielle Verdünnung und Ausstreichen auf Agar aufgezählt. Wenn die Anzahl der Bakterien, die die Zellen eingedrungen sind notwendig ist, sind Deckgläschen in die Vertiefungen mit 500 ul Zellkulturmedium mit Gentamicin und Inkubation ergänzt weiter für 1 h, die alle externen Bakterien abzutöten hinzugefügt. Deckgläser dann gewaschen werden kann, lysierten Zellen und Bakterien durch Ausplattieren auf Agar aufgezählt, wie oben beschrieben. Wenn das Experiment erfordert eine direkte Visualisierung können Deckgläschen fixiert und für Licht-, Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskopie gefärbt werden oder hergerichtet für die Elektronenmikroskopie.
Protocol
Das folgende Protokoll beschreibt die Studie von Endothelzellen Invasion von S. aureus kann aber theoretisch zur zellulären Invasion von jedem kultivierbaren Bakterien zu untersuchen. Stages speziell auf S. aureus und Endothelzellen werden angezeigt.
1. Vorbereitung der Bakterien
- Kultur S. aureus-Stämme für 4-16 h (je nach Wachstumsphase erforderlich) in 10 ml Brain-Heart Infusion (BHI) Brühe bei 37 ° C in Luft unter Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute. Diese Wachstumsbedingungen sind spezifisch für S. aureus und müssen unter Umständen für andere Bakterien adaptiert werden.
- Wash Bakterien dreimal in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM; Invitrogen) durch abwechselnde Runden Zentrifugation bei Raumtemperatur (5.000 x g, 10 min), Entfernung der Kulturüberstand und Resuspension der Bakterienpellet in gleichwertigem Umfang DMEM. Die optische Dichte der erhaltenen Suspension von Bakterien, die dann nach Bedarf eingestellt werden kann. Für S. aureus, bereiten wir eine Suspension bei OD 600 = 1, was auf ~ 10 9 cfu ml -1 entspricht.
2. Endothelial Cell Culture
- Und L-Glutamin (2 mM) bei 37 ° C in 5% CO 2; Kultur der endothelialen Zelllinie EA.hy926 1 in DMEM mit fetalem Rinderserum (10% FBS) ergänzt. Alternativ können gebündelt primären humanen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVECs) von Lonza (Basel, Schweiz) erworben werden und kultiviert in endotheliale basalen Medium mit 2% FBS, Rinderhirn-Extrakt (einschließlich Heparin), Human endothelial growth factor und Hydrocortison bei 37 ergänzt ° C in 5% CO 2 nach den Anweisungen des Herstellers (Lonza). Diese Wachstumsbedingungen sind spezifisch für diese Zellen und müssen unter Umständen für andere Wirtszelle Typen angepasst werden.
- Wachsen Endothelzellen in T75 Flaschen in Anspruch Konfluenz, verifiziert durch Auge.
- Bereiten Sie die 24-Well-Platten für die Einfügung der Deckgläser. Feine Pinzette (Flamme sterilisiert) werden benötigt, um die Deckgläser, die eine undurchsichtige und eine glänzende Oberfläche haben zu bewegen. Legen Sie Deckgläschen in die Vertiefungen der 24-Well-Platte mit der undurchsichtige Fläche nach oben, um Zelladhäsion ermöglichen.
- Liberate Zellen aus dem T75 Kolben mit 3 ml Trypsin-EDTA (0,25%) und fügen Sie 10 ml des jeweiligen Kulturmediums.
- Add 500 ul der resuspendierten Zellen auf 24-Well-Platten mit Thermanox Deckgläschen. Eine T75 konfluenten Flasche von Zellen zur Verfügung gestellt genügend Zellen für zwei 24-Well-Platten, was in etwa 5 × 10 5 Zellen pro Well (in 500 ul Medium).
- Die Platten für 48 h, wie oben beschrieben, und überprüfen Sie 100% Zellkonfluenz durch invertierte Lichtmikroskopie.
- Dip-wash Deckgläschen in PBS und in den neuen 24-Well-Platten mit 490 ul DMEM mit 10% FBS in jede Vertiefung.
- Um zu untersuchen, die Rolle spezifischer Stoffwechselvorgänge in der Zelle Invasion, können Inhibitoren auf die kultivierten Zellen 1 h vor der Zugabe von Bakterien und Konzentrationen während des Tests beibehalten hinzugefügt werden. Zum Beispiel, um zu bestimmen, die Rolle des Aktin-Umlagerung in S. aureus Invasion von Endothelzellen, 50 uM Cytochalasin D hinzugefügt werden, oder für die Rolle der Caveolae, 5 mM Methyl-β-Cyclodextrin hinzugefügt werden können.
3. Invasion Assay
- Add 10 ul gewaschenen Bakterien (was in etwa 2 × 10 7 cfu ml -1 S. aureus) in jede Vertiefung mit einem gewaschenen Deckgläschen mit einem konfluente Schicht von Endothelzellen in 490 ul DMEM mit 10% FBS.
- Inkubieren 15-90 Minuten bei 37 ° C in 5% CO 2.
- Zur Messung der Gesamtzahl der Bakterien mit den Zellen (adhärent und verinnerlicht) verbunden sind, Dip-waschen Deckgläser dreimal in PBS und fügen an die frische Vertiefungen mit 500 ul 0,5% Triton X-100 in PBS. Um die Zellen vollständig zu lysieren zu lassen und alle verinnerlicht Bakterien, die Pipette mehrmals und wies die Spitze der Pipette direkt auf die Oberfläche des Deckglases.
- Zählt die Bakterien durch Ausplattieren der flüssigen Suspension (oder Verdünnungen dieser wenn nötig) auf die Oberfläche des TSA-Platten. Da TX-100 viele Gram-negative Bakterien lysieren will, kann Saponin statt 2 verwendet werden.
- Zur Messung der Anzahl der internalisierten Bakterien, entfernen Sie den Kulturüberstand aus jedem Well mit ungebundenen Bakterien und ersetzen mit 500 ul DMEM/10% FBS mit 200 pg ml -1 Gentamycin ergänzt. Wir verwenden routinemäßig Gentamicin anstatt Lysostaphin hier, da es billiger ist, und erlaubt uns, zwischen den Experimenten mit verschiedenen Arten von Bakterien (zB Staphylokokken und Laktokokken), ohne die experimentelle Protokoll ändern zu wechseln.
- Die Platten bei 37 ° C in 5% CO 2 für 60 min, alle extrazellulären Bakterien abzutöten.
- Wash Deckgläschen 3 mal in PBS,lysieren und durch Ausplattieren auf TSA aufzählen, wie beschrieben für die Adhäsionsassay oben.
- In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, visuell zählen die Anzahl der Bakterien mittels Lichtmikroskopie. In diesem Fall, und spezifisch für S. aureus Zellinvasion, verwenden Lysostaphin (10 ug ml -1) anstelle von Gentamicin, physisch zu zerstören die extrazelluläre Bakterien.
- Inkubieren Deckgläser für 20min bei 37 ° C in CO 2 in die Lysostaphin-Lösung, dann spülen und fix mit Cytopath (Cellpath).
- Flood die Deckgläser mit Kristallviolett (0,5%, w / v) für 5min.
- In Wasser, Luft trocknen Dip-Spül-und Montage auf Glas-Objektträger. Die Anzahl der Bakterien pro mm 2 der konfluenten Endothelzellen quantifiziert mittels Lichtmikroskopie werden.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Expression von Fibronektin bindende Proteine (FnBPA und FnBPB) auf der Oberfläche von S. aureus verleiht die Fähigkeit, Endothelzellen einzudringen. Neuere Arbeiten haben neu die Fibronektin-bindende Domäne von FnBPA 3. Wild-Typ (WT) S. aureus 8325,4 dringt Endothelzellen mit hoher Effizienz, während eine Belastung fehlen sowohl FnBPA und B (Δ FNB) zeigten eine signifikant reduzierte Mengen an Internalisierung (Abbildung 1A). Die Komplementation der Mutante mit einem Plasmid kodiert fnb A minus der Fibronektin-bindende Domäne (pFnR0) nicht zu fördern Invasion (Abbildung 1A). Im Gegensatz dazu Komplementation der Mutante mit einem Plasmid kodiert die gesamte fnb A-Gens (pFnBA4) restauriert Invasion WT Ebenen (Abbildung 1A).
Die Rolle der FnBPA in Endothelzellen Invasion kann auch gezeigt, mit der heterologen Expression Host Lactococcus lactis werden. Expression von Plasmid-kodierten FnBPA in L. lactis (pRM9 9) nicht signifikant verbessern Adhäsion an Endothelzellen im Vergleich zu Bakterien exprimiert keine FnBPA (CTL) (offene Balken, Abbildung 1B). Im Gegensatz dazu FnBPA-exprimierenden L. lactis überfallen Endothelzellen bei deutlich höheren Niveau als die nicht-exprimierenden Stamm (geschlossene Bars, Abbildung 1B).
Die Experimente wurden viermal in zweifacher Ausfertigung und der Mittelwert ± Standardabweichung präsentiert wird durchgeführt. * Daten darstellen, die einen statistisch signifikanten Unterschied (p = <0,05) von WT-oder CTL-Werte sind.
Abbildung 1. Invasion von EA. Hy926 Endothelzellen durch S. aureus (A) oder L. lactis (B).
Discussion
Der Test wir beschreiben, ist auf der Gentamicin Protection Assay, der verwendet wurde, weit, um die Invasion von Wirtszellen durch Bakterien Studie. Beobachtungen von der Unfähigkeit der Gentamicin und andere Antibiotika, um die intrazelluläre Bakterien abtöten wurden in frühen Studien über die Invasion von Wirtszellen durch Bakterien 8.4 genutzt. Der Einsatz von 24, 48 oder sogar 96-Well-Platten ermöglicht die Erzeugung von großen Mengen an quantitative, reproduzierbare Daten in kürzester Zeit und mit relativ geringen Kosten. Der Test ist auch attraktiv, weil es keine spezielle Ausrüstung erfordert, kann zugeschnitten, um mit verschiedenen Bakterien und Zellen arbeiten, und kann verwendet werden, um die Rolle der beiden Bakterien und Wirtszelle Prozesse in Invasion 9 Untersuchung sein. In der Tat, seit der frühesten Versuche, die Gentamicin Protection Assay weithin eingesetzt, um Wirtszelle Invasion durch eine Reihe von verschiedenen Bakterien oder auch Kombinationen von Bakterien 10,11 zu messen. Während die zentralen Prinzipien sind die gleichen, viele subtile Variationen in der Methode berichtet worden. In diesem Artikel haben wir unsere Version beschrieben und angegeben, wo Änderungen notwendig sein für andere Bakterien oder Wirtszellen. Bei der Gestaltung eines Experiments zur Wirtszelle Invasion mit diesem Ansatz gibt es eine Reihe wichtiger Punkte zu beachten Maßnahme:
Bakterielle Empfindlichkeit gegenüber Gentamicin. Dies mag selbstverständlich klingen, aber es ist wichtig, um sicherzustellen, dass das Bakterium untersucht anfällig für Gentamicin ist bei der Konzentration, Temperatur und über die Zeitdauer verwendet werden. Im Falle von Unempfindlichkeit, kann es möglich sein, auch andere Antibiotika 5. Ein alternativer Ansatz sein kann, lytischen Enzymen (Lysostaphin, Mutanolysin, Lysozym) 12 verwenden.
Incubation und Inokulum. Bei der Durchführung dieses Tests zum ersten Mal ist es wichtig, den optimalen Inkubationszeiten und bakterielle Inokulum verwendet werden sollen, festzulegen. Daher sollten anfänglichen Experimenten untersuchen sowohl Adhäsion und Invasion im Laufe der Zeit (5 min bis zu 6 h). Es ist auch wichtig zu beurteilen, wie Invasion durch die Multiplizität der Infektion betroffen ist (MOI; Anzahl der Bakterien pro Zelle). Im Allgemeinen ist es am besten, die geringste Anzahl von Bakterien möglich verwenden, da dies Schäden an den kultivierten Zellen reduzieren. Wichtige Unterschiede zwischen den Stämmen vielleicht verpasst, wenn längere Inkubationszeiten oder großen Inokula 9,13 verwendet werden.
Zellschäden. Es ist wichtig, um Bakterien vor Waschen zu benutzen. Allerdings ist die zelluläre Schäden, die nicht Toxinproduktion beschränkt. Bakterielle Invasion, kann die Induktion von Apoptose und Störung der normalen Zellfunktionen alle verursachen Zellschäden. Dies kann das Eindringen von Gentamicin in der Zelle führen, die Tötung verinnerlicht Bakterien und den Eindruck zu erwecken, dass Invasion hat nicht 14 aufgetreten.
Inkubationsbedingungen. Die Temperatur und der Zusammensetzung des Kulturmediums können einen erheblichen Einfluss auf die Invasion. Zum Beispiel ist Invasion von HeLa Zellen, die durch Streptococcus pyogenes abhängig von der Anwesenheit von löslichen Fibronektin, die typischerweise im Serum 15. Ein weiterer Aspekt ist das Wachstum von Bakterien in das Kulturmedium im Verlauf des Experiments.
Kultur und Quantifizierung der intrazellulären Bakterien. Obwohl TX-100 kann nicht töten intrazelluläre Bakterien, kann es in ihrem Wachstum hemmen. Als solches ist es wichtig, bakterielle Replikation auf festen Medien zu überprüfen in der Gegenwart des Waschmittels. Wo betroffen sind, kann es möglich sein, niedrigere Konzentrationen des Detergens zu nutzen oder auf eine Alternative wie Saponin verwenden. Ein Vorteil des Gentamicin Protection Assay über die Kristallviolettfärbung und Mikroskopie Assay ist, dass es weniger arbeitsintensiv ist, und es erlaubt den Nachweis und die Differenzierung von Sub-Populationen von Bakterien verinnerlicht. Zum Beispiel, S. aureus kann entweder eine normale Kolonie Typ (NCT) oder die kleine Kolonie Variante (SCV) 16, das wäre nicht unterscheidbar durch Mikroskopie von einzelnen Bakterienzellen. Ein Vorteil des Kristallviolettfärbung und Mikroskopie Assay über die Gentamicin Protection Assay wird die Zelle Verklumpung für und dass intrazelluläre Bakterien, die ein "lebensfähiges, aber nicht kultivierbaren" Zustand erkannt wird 17 eintreten können berücksichtigt werden.
Die Untersuchung der Rolle der Wirtszelle Prozesse in bakteriellen Invasion. Viele Studien haben Inhibitoren der Wirtszelle Funktion wie Cytochalasin D, die mit Aktin Umlagerung stört beschäftigt. Solche Studien können auch Antikörper, die auf Zelloberflächenrezeptoren und siRNA Knockdown von spezifischen Genen 18. Es ist äußerst wichtig, um sicherzustellen, dass diese Behandlungen keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit oder Anbau von kultivierten Zellen oder toxische Wirkungen auf Bakterien.
Zukünftige Richtungen:
NHALT "> Da dieser Test in der Regel ist in Multi-Well-Zellkultur-Platten durchgeführt wird, ist es theoretisch möglich, es zu einem High-Throughput-Screening-Betrieb, was die Prüfung von Banken potentieller Zell-Funktion Inhibitoren, Antiinfektiva und beinhalten möglicherweise anpassen Antibiotika entwickelt, um intrazelluläre Bakterien Ziel. Alternativ könnte ein solcher Ansatz verwendet, um Mutantenbibliotheken Bildschirm, um Gene in Adhäsion, Invasion oder intrazellulären Überleben beteiligt zu identifizieren. In manchen Fällen kann es wünschenswert sein, Scherkräfte (flow) in das Modell einzubeziehen, zum Beispiel bei der Modellierung des Endothels, um mehr genau imitieren die in vivo-Umgebung. Aktuelle Fortschritte in der Entwicklung und Herstellung von Messzellen und Mikrofluidik Zellkultur-Systeme bieten die Möglichkeit des Einsatzes der Gentamicin Protection Assay in Wirt-Pathogen-Modelle, die Scherkräfte zu integrieren.Zusammenfassend ist die hier beschriebene Protokoll auf ähnliche Ansätze über viele Jahre hinweg verwendet wird. Es ist weithin für viele Arten von kultivierten Zellen und bakteriellen Spezies und kann große Datenmengen schnell und bei relativ geringen Kosten zu generieren.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Wellcome Trust (WT 0795880) gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 31885-023 | |
| Brain heart infusion | BioChemika | 53286 | |
| F–tal bovine serum | Invitrogen | 10091-148 | |
| HUVECs | Lonza Inc. | CC-2519 | |
| Endothelial basal medium | Lonza Inc. | CC-3121 | |
| Bovine brain extract (including heparin) | Lonza Inc. | CC-4092 | |
| Human endothelial growth factor | Lonza Inc. | CC-4017C | |
| Hydrocortisone | Lonza Inc. | CC-4035C | |
| GA-1000 | Lonza Inc. | CC-4092C | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710 | |
| Lysostaphin | AMBI | LSPN-50 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TKT-210-330P | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Cytopath | TCS Biosciences | HC8595 | |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | C3886 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| T75 flasks | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 430641 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C2618 | |
| Methyl-B-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | 332615 |
References
- Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 3734-3737 (1983).
- Makino, S., van Putten, J. P., Meyer, T. F. Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells. EMBO J. 10, 1307-1315 (1991).
- Schwarz-Linek, U., Werner, J. M., Pickford, A. R., Gurusiddappa, S., Kim, J. H., Pilka, E. S., Briggs, J. A., Gough, T. S., Höök, M., Campbell, I. D., Potts, J. R. Pathogenic bacteria attach to human fibronectin through a tandem beta-zipper. Nature. 423, 177-181 (2003).
- Magoffin, R. L., Spink, W. W. The protection of intracellular Brucella against streptomycin alone and in combination with other antibiotics. J. Lab. Clin. Med. 37, 924-930 (1951).
- Mandell, G. L.
- Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrob. Agents Chemother. 16, 743-749 (1979).
- De Melo, M. A., Pechere, J. C. Effect of mucin on Campylobacter jejuni association and invasion on HEp-2 cells. Microb. Pathog. 5, 71-76 (1988).
- Shaw, J. H., Falkow, S. Model for invasion of human tissue culture cells by Neisseria gonorrhoeae. Infect. Immun. 56, 1625-1632 (1988).
- Edwards, A. M., Potts, J. R., Josefsson, E., Massey, R. C. Staphylococcus aureus Host Cell Invasion and Virulence in Sepsis is Facilitated by the Multiple Repeats within FnBPA. PLoS Pathog. 6 (6), e1000964-e1000964 (2010).
- Meyer, D. H., Sreenivasan, P. K., Fives-Taylor, P. M. Evidence for invasion of a human oral cell line by Actinobacillus actinomycetemcomitans. Infect. Immun. 59, 2719-2726 (1991).
- Edwards, A. M., Grossman, T. J., Rudney, J. D. Fusobacterium nucleatum transports noninvasive Streptococcus cristatus into human epithelial cells. Infect. Immun. 74, 654-662 (2006).
- Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis. Infect. Immun.. 66, 5994-5998 (1998).
- Schröder, A., Schröder, B., Roppenser, B., Linder, S., Sinha, B., Fässler, R., Aepfelbacher, M. Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells. Mol. Biol. Cell. 17, 5198-5210 (2006).
- Molinari, G., Rohde, M., Talay, S. R., Chhatwal, G. S., Beckert, S., Podbielski, A. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol. Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Cue, D., Dombek, P. E., Lam, H., Cleary, P. P. Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells. Infect. Immun. 66, 4593-4601 (1998).
- Eiff, C. von Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians. Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).
- Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells. Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).
