Фотообесцвечивания Анализы (FRAP и FLIP), чтобы измерить хроматина Динамика белков в живых эмбриональных стволовых клеток

Summary

Мы опишем методы, включая фотообесцвечивания флуоресценции Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP) и флуоресценции Потеря В фотообесцвечивания (FLIP) для контроля динамики хроматина белка в эмбриональных стволовых (ЭС) клеток. Хроматин динамики белков, который считается одним из средств для изучения хроматина пластичность, усиливается в плюрипотентные клетки.

Abstract

Флуоресценция Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP) и флуоресценции Потеря В фотообесцвечивания (FLIP) позволяют изучения динамики белков в живых клетках с хорошим пространственным и временным разрешением. Здесь мы опишем, как выполнять FRAP и FLIP анализов хроматина белки, в том числе H1 и HP1, в мышиных эмбриональных стволовых (ЭС) клеток. В FRAP эксперимента клетки трансфицированных, либо временно или стабильно, с белок сливается с зеленого флуоресцентного белка (GFP) или их производных (YFP, CFP, вишня и т.д.). В трансфекции, флуоресцирующие клетки, интенсивные сфокусированного лазерного луча отбеливатели относительно небольшой области интереса (ROI). Длины волны лазера выбирается в соответствии с флуоресцентный белок используется для синтеза. Лазерного света необратимо отбеливатели флуоресцентный сигнал молекул в рентабельности инвестиций и, сразу же после отбеливания, восстановления флуоресцентного сигнала в беленой площадь - опосредовано замены беленой молекул с небеленой молекул - это контролируется с помощью изображений промежуток времени. Созданный флуоресценции кривые восстановления предоставить информацию о подвижности белка. Если флуоресцентные молекулы неподвижны, не флуоресценции восстановление будет наблюдаться. В дополнительный подход, флуоресцентная Потери в фотообесцвечивания (FLIP), лазерный луч отбеливатели же месте неоднократно и интенсивность сигнала измеряется в других флуоресцирующих клеток. FLIP экспериментов поэтому мера сигнал распада, а не восстановление флуоресценции и полезны для определения белка мобильность, а также белка курсируя между сотовой отсеков. Переходные обязательным является общим свойством хроматина белков, связанных с. Хотя основной доли каждого белка хроматина связана с хроматина в любой момент времени в равновесном состоянии, обязательным является временным, и большинство хроматина белки имеют высокий оборот по хроматина, с временем пребывания в порядке секунд. Эти свойства имеют решающее значение для получения высокой пластичностью в экспрессии генома ^1. Фотообесцвечивания эксперименты поэтому особенно полезен для определения хроматина пластичность использования GFP-фьюжн версии хроматина структурных белков, особенно в ЭС клетки, где динамический обмен белков хроматина (в том числе гетерохроматин белок 1 (HP1), компоновщик гистона H1 и основные гистонов) выше, чем в дифференцированных клетках ^2,3.

Protocol

1. Покрытие ЭС клетки

Т = 0 часов
MEF покрытием

1. Пальто жить изображений 8-и μ-Слайды (ibidi, Мюнхен, Германия) с желатином или в патрон покровные стекла (Lab-Tek, Рочестер, штат Нью-Йорк) или стеклянным дном блюда культуры (Маттек; Ashland, MA). Оставьте на 5-30 минут и аспирации от свободных желатин.
2. Семенной 22000 MEFs / лунку в 250 мкл общем объеме DMEM [с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS)]. Разрешить клетки расти в культуре ткани инкубатор (37 ° С, 5% СО2).

Т = 6 часов
ЭСК покрытием

3. Аспирируйте DMEM.
4. Семенной каждого MEF покрытием хорошо с 15000 R1 клеток / лунку в 250 мкл общего объема средств массовой информации ES клетки [с добавлением 10% ESC-класса эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 1 мМ пирувата натрия, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 0,1 мМ β- меркаптоэтанол и 1000 ед / мл фактором подавления лейкоза (LIF)], чтобы получить 30% до 50% слияния следующий день.

2. Трансфекции ЭС клетки

Т = 24 часов
Переходные трансфекции

1. Замените СМИ ЭСК с 250 мкл / лунку свежий СМИ ячейки ES.
2. В 1,5-мл стерильную пробирку, добавьте 100 мкл сыворотки свободных средств массовой информации [Opti-MEM (Gibco)], а затем добавить 10 мкл Транзит-LT1 трансфекции реагента (Mirus) непосредственно в сыворотке свободных средств массовой информации. Смешать, осторожно пипеткой и инкубировать при комнатной температуре в течение 5-20 мин.
3. Добавить 1,5 мкг GFP слияния ДНК плазмиды (H1e, H1o или HP1) для разбавленных транзитного LT1 реагента. Смешать, осторожно пипеткой и инкубировать при комнатной температуре в течение 15-30 мин.
4. Добавить 13,5 мкл / лунку трансфекции смеси. Swirl 8-и μ-слайды для обеспечения равномерного рассеивания. После 24 часов заменить старые СМИ ячейки ES с 250 мкл свежей среды ячейки ES.

3. Выполнение FRAP и FLIP

Т = 48-72 часов

1. Эксперимент может быть выполнена на любом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM), но так как в нормальных FRAP / FLIP эксперимент, многие последовательных изображений приобретаются, то рекомендуется использовать вращающийся диск конфокальной микроскопии, которая позволяет приобретение скорость и гарантирует, что ни нежелательный пример отбеливания происходит после первоначального преднамеренное обесцвечивания. Здесь, мы рекомендуем использовать революции вращающийся диск конфокальной системы (www.Andor.com), с Yokogawa ХСС-X головы диск вращается. Эта система имеет двойную способность photobleach использованием специализированного модуля FRAPPA с точки сканирования системы, и быстро переключаться свет обратно собирать изображения с помощью вращающегося диска. 3 наиболее распространенных флуоресцирующих белков для фотообесцвечивания эксперименты GFP, YFP и Черри. Если GFP или YFP используются, ~ 488 нм лазер не требуется. Для вишни, используйте ~ 560 нм лазер. Во всех случаях, мы рекомендуем использовать твердотельные лазеры. Наличие автоматизированной этапе полезно, но не требуется. Так как живые клетки изображаются, важно использовать экологической палаты (мы используем одну из LIS, Швейцария), контроль кислорода, влажности, CO ₂ и температуры. FRAP осуществляется с использованием максимальной интенсивности лазерного излучения в то время как изображения осуществляется с минимальными мощность лазера требуется (обычно в районе 10%, если уровень флуоресценции достаточно).
   Соблюдайте клеток с флуоресцентным светом соответствующей длины волны и выберите ячейку выражения GFP использованием 60X объектив погружения масла. Обеспечить правильное субклеточных распределения. Иногда, когда уровни экспрессии являются слишком высокими, локализация белка может "разлива", чтобы другие отсеки, такие как ядрышко. Такие клетки не должны быть выбраны.
2. Теперь установите протокол изображений: собрать 3-5 кадров перед фотообесцвечивания, то photobleach на эухроматин или гетерохроматин (рассматриваются как конденсированные GFP очагов) и собрать 90-120 кадров после photobleach, с интервалом 250-1000 мс: H1e-GFP, 1000 мс, H1o и HP1-GFP, 250 мс (изменение интервала времени в соответствии с динамики белков, где очень динамичной белков требуется более короткий промежуток времени). Мы обычно используем 80-100% интенсивности лазерного излучения для фотообесцвечивания с лазерным импульсом 20-40 μseconds (1-2 итераций), но эти цифры могут меняться в зависимости от анализируемого белка и уровни экспрессии. Когда фотообесцвечивания не подходит, вы должны соблюдать "черная дыра" в вашем GFP флуоресценции. Черная дыра постепенно повторно заполнен флуоресценции после выздоровления. Хотя вращающийся диск может получить примерно до 60 изображений в секунду (при хорошей интенсивности флуоресценции и при увеличении на одну ячейку), мы не рекомендуем использовать системы на таких высоких скоростях из-за низкого качества изображения и потенциал увеличился фототоксичности.
3. Для FLIP эксперимент, создать другой протокол изображений: собрать 3-5 кадров перед отбеливанием, а затем начните повторять отбеливание на том же месте в то время как сбор изображений. Для H1e-GFP, отбеливатель каждые 5 сек, для H1o-GFP, отбеливатель каждые 2 секунды, а для HP1-GFP отбеливателя каждые 1 сек. Bleachг собирать фотографии неоднократно на протяжении всего эксперимента.
4. Для любой техники, повторите этот процесс на 20-30 клеток. Для статистических целей повторить эксперимент в 3 раза или более, предпочтительно в разные дни. В однородное население и правильные настройки, стандартное отклонение, как правило, низкое (<5%).
   Для обоих FRAP и FLIP, размер и форму беленой региона влияет на восстановление динамики и должно оставаться постоянным в течение эксперимента. Кроме того, когда две клетки сравниваются, идентичные протоколы должны быть использованы и клетки должны быть проанализированы последовательно в тот же день, как мощность лазера и других условий может изменяться, и могут повлиять на исход эксперимента.

4. FRAP и FLIP анализа данных

1. Во всех FRAP кадров собраны, измерять интенсивность флуоресценции в ROI (возврат инвестиций _Ь = беленой район), области фона (ROI _BG), и небеленый в ядерной области (ROI _NB) в зависимости от времени до и после отбеливания. Когда отбеленная регионе незначительно всего ядра могут быть выбраны для нормализации целей.
2. Для каждого момента времени, нормализовать данные в соответствии с формулой: (ROI _б - ROI _BG) / (ROI _NB - ROI _BG) / (pbROI _б - pbROI _BG) / (pbROI _NB - pbROI _BG), Pb означает предварительно осветленный. Для предварительной отбеливателя изображения, которые вы должны получить сумму около 1. Первое изображение после отбеливания будет указывать Bleach глубины. Вычтите значение от 1 для фактического значения Глубина Bleach. Повторите эти действия для каждой клетки и среднем 20-30 клетки от каждого эксперимента.
3. Во всех FLIP кадров собраны, измерять интенсивность флуоресценции в небеленый в ядерной области, и области фона (ROI = _пЬ небеленый области, ROI _BG = фоне). Расчет FLIP данных похожа на FRAP кривой, только анализ окупаемости инвестиций (ROI _NB) должен быть иным, чем фактические беленой региона, который не используется для расчета: (ROI _NB - ROI _BG) / (pbROI _NB - pbROI _BG) . Кроме того, можно использовать соседней камере (ROI _п = соседней клетки) для нормализации целей: (ROI _NB - ROI _BG) / (ROI _га - ROI _BG) / (pbROI _NB - pbROI _BG) / (pbROI _га - pbROI _BG ).
   После сбора данных, можно в соответствии с экспериментальными данными компьютерного моделирования. Это позволяет рассчитывать, с хорошей близости, мобильные фракции, фракции и неподвижные полувысоте. Мы не будем обсуждать математические и статистические аспекты FRAP анализ здесь и отсылаем читателя к другим превосходным публикаций ^4-9. Отбеливатель глубина ссылается на расстоянии (по оси ординат) между заранее отбеливателя (100%) сигнал и первое изображение после отбеливания; мобильные фракция относится к расстоянию (по оси ординат) между глубиной и отбеливатель восстановленный сигнал, когда кинетика выходит на плато, и неподвижные фракция относится к расстоянию (по оси ординат) между восстановления сигнала и заранее отбеливателя (100%) сигнала (см. рис 1В и 2В). Помимо этого анализа, Есть хорошие математические модели в соответствии с данными. Для одного показателя, то уравнение
   
   где Т-время является мобильная часть, 1-А является неподвижным фракции и к _{выключение} константа диссоциации, могут быть использованы в соответствии с данными, и прямую оценку от скорости связывания (к _{выключено)} может быть получены, а также для параметров, которые могут быть использованы для расчета скорости ассоциации.

5. Представитель Результаты:

Рисунок 1. А и В показывают, представитель FRAP кривые HP1 (слева), H1o (в центре) и H1e (справа) в R1 ЭС клеток. Для Рис простотой и ясностью показывает, 1A необработанные данные из одной клетки до того, нормирование и расчет. Желтая кривая соответствует беленой регион, пурпурный кривая соответствует небеленый в ядерной области (когда беленой регионе незначительно всего ядра могут быть выбраны для нормализации целей), а красная линия соответствует фоновой флуоресценции, которая минимальной в этом случае. Вертикальная стрелка представляет отбеливателя времени. Нормализованная и усредненные данные показано на рисунке 1b. Обратите внимание на медленное восстановление H1 (синий) по сравнению с HP1 (красный). Также H1e вариант (темно-синий) происходит медленнее, чем вариант H1o (светло-голубой). Подвижные и неподвижные фракций и Bleach Глубина указаны для HP1.

Рисунок 2. А и В показывают, представитель FRAP кривые сравнения эухроматин (слева) с гетерохроматин (справа) HP1 в клетках R1 ES. Как и в рисунке 1, Рисунок 2А показывает необработанные данные из одной ячейки, желтая кривая соответствует беленой регион, пурпурный кривая соответствует небеленый в ядерной области, и красная линия соответствует фоновой флуоресценции. Вертикальная стрелка представляет отбеливателя времени. Нормализованная и усредненные данные показан на рисунке 2Б. Обратите внимание на медленное восстановление гетерохроматина (темно-красный) по сравнению с эухроматин (светло-красный). Подвижные и неподвижные фракций и Bleach Глубина указаны для эухроматин.

Рисунок 3.. Типичный FLIP эксперимент H1o R1 ЭС клетки показана на рисунке 3А (сырье, не-нормированный данных) и B (нормированный и усредненные данные). В этом эксперименте фиолетовый кривой соответствует небеленый в ядерной области, зеленая линия соответствует соседнего ядра клетки и красная линия соответствует фоновой флуоресценции.

Discussion

В отличие от большинства имеющихся методов, которые включают очищенный от хроматина клеточных популяций или фиксированные клетки, FRAP экспериментов следить за изменениями в динамике хроматина белков в живых клетках. Мы обнаружили, динамика хроматина белки быть хорошим индикатором для хроматина пластичность. Однако, поскольку он требует слияния генов, представляющие интерес с GFP, добавлением флуоресцентных тег может вмешиваться в функции белка. Таким образом, до приступить FRAP, слитый белок, должны быть тщательно протестированы, чтобы убедиться, что он имеет те же свойства и функции, как ее родной коллегой. Золотой стандарт был бы в дополнение к функции эндогенных белков с GFP-синтеза в клеточной линии нокаутом. Тем не менее, линии нокаутом клетка не всегда доступны, а во многих случаях отсутствие белка не имеет четкой фенотипа. Тем не менее, можно проверять субклеточных распределения гибридный белок, его уровень экспрессии, его связывания партнеров, все по сравнению с эндогенным белком для обеспечения надлежащего частичная замена.

Проверив это, белка GFP слияние должно быть трансфицировали в ЭС клетки. Мы обнаружили, что транзит хорошо работает с ЭС клетки и достигает трансфекции эффективность более 50%. Переходные трансфекции удобно, так как позволяет приступить эксперимента непосредственно, но стабильной трансфекции часто начальника, обеспечения долгосрочной выживаемости клеток в присутствии белок слияния интересов, и в результате нижняя и однородный уровень экспрессии. Дополнительные методы маркировки белков с GFP теги включают GFP ген пометки в БАС использованием combineering ¹⁰ или GFP-захвата эндогенных генов непосредственно с GFP / YFP экзонов ^{11, 12.} Эти методы являются более предпочтительными, так как белок слияния обусловлен эндогенными промоутера, но не всегда доступны. Трансфекция БАС в ЭС клетки можно с помощью стандартных методов трансфекции. Наконец, ЭС клетки от трансгенных мышей, экспрессирующих меткой хроматина белки также могут быть использованы. Хотя более громоздкой, этот метод позволяет использование ранних клеток проход, в отличие от стабильно трансфицированных клеток, которые требуют долгосрочного культивирования для достижения чистого выбор стабильной интеграции.

Как только белок был выбран, сливается с GFP, проверены и трансфицировали в ЭС клетки, Есть несколько важных условий, которые должны быть выполнены для успешного эксперимента FRAP: во-первых, флуоресцентного сигнала, который будет беленой должны быть четко обнаруживается на любом фоне сигнала, во-вторых, фотообесцвечивания должен быть быстрым по сравнению с периодом восстановления, чтобы обеспечить достаточное временное разрешение для анализа кривой восстановления и позволяют измерять тайма восстановления. Таким образом, лазер, используемый для отбеливания должны быть достаточно мощными, чтобы позволить этому, в-третьих, мониторинг пучка должна быть низкой интенсивности, чтобы минимизировать фотообесцвечивания. Вращающийся диск конфокальной микроскопии, оснащенные фотообесцвечивания характеристиках (например, Андор Революции системы), поэтому идеально подходит для этой цели. Наконец, экологические камеры поддержания клеток в надлежащих условиях роста должен быть установлен на микроскоп, чтобы обеспечить надлежащее гомеостаз клетки.

Основным ограничением при анализе основных гистонов, что они тесно связаны с ДНК, а следовательно, в FRAP экспериментов они появляются почти неподвижны. Для достижения полного восстановления основных гистонов, FRAP кривые должны достигать нескольких часов. Поскольку стволовые клетки очень мобильны в сферах культуры, это, по сути технически невозможно выполнять многочасовые эксперименты FRAP. Чтобы избежать этого, можно выполнить до 10 мин экспериментов FRAP и экстраполировать кинетическое поведение от нескольких минут до нескольких часов. В отличие от основной гистонов, большинство ДНК связывающих белков быстро связывать и отмежеваться от хроматина, что приводит к коротким периодом полураспада в порядке секунд до нескольких минут не больше ^1. В этой статье мы изучили два ДНК связывающих белков, H1 и HP1, как динамические, так в ЭС клетки, но HP1 более динамична, чем H1 (как показано на рисунке 1). Следует отметить, что оба эти хроматина белки менее динамичным, чем в гетерохроматин эухроматин, поэтому флуоресценции восстановления после фотообесцвечивания гетерохроматина работает медленнее (как показано на рисунке 2). Медленное восстановление в гетерохроматин, вероятно, отражает более высокую концентрацию сайты связывания для H1 и HP1, а также молекулярные скученности.

Чтобы сумма, фотообесцвечивания эксперименты предоставляют средства для изучения динамики белков хроматина в живых клетках, отражающие хроматина пластичность, которая преувеличены в плюрипотентные клетки.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D5671
Gelatin	Merck & Co., Inc.	1.04078
Opti-MEM	GIBCO, by Life Technologies	31985
TransIT-LT1	Mirus Bio LLC	MIR2300
8-well μ-Slides	ibidi	80826