Summary
Nous présentons ici un protocole pour la réalisation solide plaque de base de la restriction alimentaire au
Abstract
Réduction de la consommation d'aliments sans malnutrition ou de famine est connue pour augmenter la durée de vie et de retarder l'apparition de diverses maladies liées au vieillissement dans une large gamme d'espèces, y compris les mammifères. Elle entraîne également une diminution du poids corporel et de la fertilité, ainsi que des niveaux plus bas de glucose plasmatique, l'insuline et l'IGF-1 chez ces animaux. Ce traitement est souvent désigné comme la restriction alimentaire (DR) ou de la restriction calorique (RC). Le nématode Caenorhabditis elegans est apparu comme un organisme modèle important pour étudier la biologie du vieillissement. Manipulations environnementaux et génétiques ont été utilisées pour modéliser DR et ont montré de prolonger la durée de vie en C. elegans. Cependant, la plupart des études ont rapporté DR en C. elegans ont été réalisées en propageant des animaux dans des milieux liquides, tandis que la plupart des études génétiques dans le domaine du vieillissement ont été réalisés sur la gélose standard de solide dans des boîtes de Pétri. Nous présentons ici un protocole standard de DR à l'aide NGM solides à base de gélose plaque avec des bactéries tuées.
Protocol
1. Établir une courbe d'étalonnage pour l'estimation des concentrations de bactéries
Cette section décrit une méthode pour l'estimation de la concentration de bactéries pour toute souche donnée de bactéries (par exemple, OP50, HT115) qui sera utilisé comme source de nourriture pour les expériences de restriction alimentaire en C. elegans. Courbes d'étalonnage distincts devraient être établis pour chaque bactérie souche utilisée.
- Inoculer une seule colonie de E. coli OP50 bactéries sélectionnées dans une série fraîche de bactéries sur une gélose LB en 3 ml de bouillon LB liquide.
- Placer OP50 culture à 37 ° C shaker et permettent aux bactéries de croître durant la nuit.
- Préparer série 2 dilutions de la suspension bactérienne de la culture de la nuit (2x, 4x, 8x, 16x, 32x).
- Mesurer l'absorbance (densité optique) de chaque dilution à 600 nm par un spectrophotomètre, en trois exemplaires.
- Diluer chaque suspension bactérienne 1000000 fois (1000-dilution deux fois).
- Fais 0,4 ml de suspension bactérienne de chaque dilution de répartir uniformément sur une plaque de 100 mm LB agar.
- Placez les plaques LB avec OP50 dans un incubateur à 37 ° C pendant 18-24 heures.
- Comptez le nombre de colonies bactériennes cultivées sur chaque assiette. Le nombre de colonies sont utilisées pour calculer ufc (unité formant colonie) par ml pour chaque échantillon.
- La relation entre la DO mesurées 600 valeurs et OP50 concentrations de bactéries peuvent être établies en traçant DO 600 en fonction de la concentration bactérienne (UFC / ml) et en effectuant une analyse de régression linéaire (figure 1).
Solutions:
| Luria Broth (LB), 1L: | |
| 10 g | Bacto-tryptone |
| 5 g | Extrait de levure |
| 10 g | NaCl |
Ajouter de l'eau déminéralisée pour 1L.
Autoclave et conserver à température ambiante.
2. Préparation de la plaque solide basée sur la restriction alimentaire (DTS) plaques
Cette section décrit la préparation des plaques pour une utilisation en milieu solide plaque de base alimentaires de restriction (DTS) expériences. Normalement, on considère une concentration de bactéries de 1 x 10 11 ufc / mL que l'état du ad libitum d'alimentation et 1 x 10 8 ufc / mL que l'état DR alimentation optimale pour cette méthode. Toutefois, 4-6 différentes concentrations de bactéries peuvent être nécessaires pour établir une complète relation dose-dépendant pour les DTS et ses réponses.
- Inoculer une seule colonie de E. Coli OP50 bactéries dans 3 ml de bouillon LB liquide.
- Placer la culture dans 37 OP50 agitateur ° C et permettent aux bactéries de croître pendant 6-8 heures.
- Transfert de la culture OP50 à un nouveau flacon contenant 500 ml de bouillon LB, et placer la culture OP50 de retour à 37 ° C durant la nuit agitateur.
- Mesurer la DO 600 de la culture OP50 pour déterminer la concentration des bactéries (la concentration est calculée en utilisant la courbe de calibration générée dans la partie 1). Des dilutions appropriées peuvent être nécessaires pour une mesure précise de l'absorbance.
- Pellet OP50 bactéries par centrifugation à 1500 g pendant 20 minutes.
- Resuspendre bactérie à une concentration de 1 x 10 12 ufc / mL.
- Préparer 10 ml de culture de bactéries dans six concentrations différentes: 1 x 10 12, 10 11, 10 10, 10 9, 10 8, 10 7 ufc / mL.
- Pipeter 0,2 ml de culture de bactéries dans le centre d'une plaque de 60 mm solidifié NGM. Évitez de toucher la surface de la plaque avec la pointe de pipette, que les entailles à la surface permettent de creuser dans les vers de la gélose.
- Placer les plaques dans 37 incubateur ° C pendant 1 heure.
- Appliquer 10 pi de 100mg/mL carbénicilline et 10 uL de kanamycine 50MG/ML à chaque plaque d'arrêter la croissance de la bactérie.
- Plaques magasin avec différentes concentrations d'antibiotiques ont tué les bactéries à 4 ° C pour une utilisation future (jusqu'à un mois). Il est important de préparer et de stocker assez d'assiettes pour l'expérience entière planifié au moins 1-2 jours à venir. En utilisant le même lot de plaques pour les expériences de l'ensemble est préférable.
- Pour vérifier la viabilité de la bactérie, gratter quelques bactéries sur des plaques de DTS et l'étaler sur une plaque de NGM vide avec carbénicilline et la kanamycine. Placer la plaque dans 37 incubateur ° C pendant 6-8 heures puis vérifiez à la croissance des bactéries (pas de croissance des bactéries doit être observé).
Solutions
| Croissance nématode médias (NGM), 1L: | |
| 3 g | NaCl |
| 2,5 g | Bacto-peptone |
| 20g | Agar |
| 1 ml | 1 M MgSO 4 |
| 1 ml | 1 M de CaCl 2 |
| 1 ml | 5 mg / ml de cholestérol |
| 25 ml | Phosphate de potassium 1M, pH 6,0 |
Verser immédiatement NGM liquide sur 60 mm x 15 mm dans les boîtes de Pétri aliquotes de 10 ml
3. Mise en place d'expériences de DTS
Pour la plupart des études SDR-connexes, telles que l'analyse la longévité et la fertilité de profilage, la préparation d'un âge synchronisée de la population de vers de terre est essentielle. Pour d'autres études, il suffit de transférer les vers d'une plaque régulière OP50 à une plaque de DTS pour lancer la restriction alimentaire. Dans cette section, un protocole pour mettre en place une analyse durée de vie pour les animaux de DTS est décrit comme un exemple.
- Utilisez un sélecteur de ver de platine pour le transfert de 20 à 30 adultes reproducteurs actifs sur plusieurs plaques NGM régulier avec OP50. Selon le nombre d'œufs requis pour les expériences, plus d'adultes peut être nécessaire.
- Laisser les plaques à 20 ° C pendant 4 heures pour permettre la ponte des œufs.
- Retirez les adultes à partir de la plaque. Les plaques doivent être inspectés visuellement pour les oeufs.
- Laisser les plaques à 20 ° C et laisser la descendance de développer dans la phase Late-L4/day adulte 1. Habituellement, cela prend 3 jours pour les vers N2 types sauvages à 20 ° C.
- Transfert d'un nombre approprié de jours 1 adulte sur la plaque de DTS pour lancer la restriction alimentaire.
- Pour une analyse cycle de vie, mis en place un total de 6-8 plaques avec 10-20 ver par plaque pour chaque condition de DTS.
- Score à la viabilité de chaque ver tous les 2 jours jusqu'à ce que tous les vers sont morts. Il est essentiel que les vers soient transférés à des plaques de DTS frais tous les 12-48 heures pour éviter la privation complète d'aliments.
4. Les résultats représentatifs:
Montre la figure 1 est un tracé d'une courbe d'étalonnage représentant pour l'estimation de la concentration OP50 par rapport à OD 600. L'équation générée par analyse de régression revêtement peut être utilisé pour tous les futurs calculs des concentrations de bactéries OP50. Montre la figure 2 est un exemple de dosage de l'effet des traitements chroniques sur les DTS durée de vie moyenne de souches différentes ver. La ligne bleue représente une normale dose-dépendante de réponse de vers de type sauvage de DTS. La ligne rouge indique que l'effet durée de vie de DTS est partiellement supprimée par la RRC-2 OE, tandis que daf-16 (mu86) n'a aucun effet sur l'extension DTS-induite durée de vie. Détails de la méthode pour effectuer des analyses durée de vie en C. elegans est décrite dans la littérature antérieure 1-3.
Figure 1. Résultat représentatif d'une courbe de calibration pour l'estimation de E. Coli OP50 concentration. OP50 concentration est tracée en fonction de la mesure OD 600 valeurs. Les barres d'erreur = DD culture de nuit bactérienne a été dilué 1.5x, 2x, 4x, 8x, 16x, 32x avant la mesure d'absorbance, puis dilué 1000 x deux fois avant de mesure UFC.
Figure 2. Résultat représentatif d'un C. elegans expérience comparant la durée de vie des animaux sauvages type N2 (en bleu) avec deux mutants différents (vert et rouge) en réponse à de DTS (figure de Ching et al. 4). Les barres d'erreur = SEM
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Discussion
La restriction alimentaire (DR) est connu pour augmenter la durée de vie et de retarder l'apparition de diverses maladies liées au vieillissement dans une large gamme d'espèces, y compris les mammifères 5-7. Manipulations environnementaux et génétiques ont été utilisées pour modéliser DR en C. elegans, y compris les vers de culture dans un milieu semi-défini de liquide 8,9, la dilution de la source de nourriture des bactéries en milieu liquide 10-12, et l'utilisation de mutants de comportement qui se nourrissent à un rythme plus lent 13. Toutefois, imite génétique du DR peuvent produire des phénotypes qui sont sans rapport avec DR, alors que les vers de culture dans un milieu liquide implique des conditions de croissance qui diffèrent des conditions solides plaque de support adapté par la plupart des laboratoires ver. Un protocole standard de DR réalisée sur des plaques solides serait utile et a donc été développée par plusieurs groupes 4,14,15.
Dans le protocole décrit ici, les bactéries sont tuées par l'application de deux antibiotiques différents pour les plaques comme un moyen de contrôler le niveau d'ingestion alimentaire. Toutefois, d'autres méthodes telles que l'exposition aux UV peut aussi être utilisé pour inhiber la croissance des bactéries.
Afin d'éviter la privation complète de nourriture (la faim par exemple) au cours d'expériences de DTS, les vers ont besoin d'être transférés à des plaques de DTS frais tous les 12-48 heures mentionnées ci-dessus à l'étape 3.7. La fréquence du transfert dépend de la concentration des aliments, nombre de vers par plaque, et le montant de la progéniture produite par la souche ver utilisé dans l'expérience. Par exemple, les vers peuvent être transférées toutes les 48 heures lorsque 20 CF512 stérile [Fer-15 (B26); fem-1 (hc17)] animaux ont été placés sur une des plaques DTS contenant 1 x 10 7 ufc / mL OP50 bactéries. La fréquence du transfert devrait être déterminé en examinant, en avant l'expérience, combien de temps les plaques DTS pourrait durer avant le bactérienne ensemencée est complètement consumé par les vers dans des conditions expérimentales. Lors de la réalisation des expériences qui durent plusieurs semaines (par exemple la durée de vie d'analyse) avec une souche non-stériles, 50μg/ml FUDR peuvent être ajoutés à des plaques de DTS avant l'étape 3.5 pour éliminer la ponte. Sinon, les vers devront être transférés à des plaques fraîches beaucoup plus fréquemment pour éviter l'épuisement complet de la nourriture en raison de leur progéniture.
Bien qu'il n'y ait aucune limite sur le nombre de vers qui peuvent être placés par plaque dans une expérience de DTS, en plaçant plus de 20 animaux par plaque peut causer des difficultés dans la notation de viabilité pour une analyse vie après le traitement DTS. Il est également intéressant de noter que DTS peut être initiée dès le jour 1 de l'âge adulte. Cependant, l'initiation de DTS au premiers stades larvaires peuvent provoquer un arrêt du développement dans certaines circonstances.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une bourse de pilote de Centre de choc Nathan (P30 AG13283) et une subvention R01 (R01 AG028516) du National Institute on Aging (NIA) à A.-LH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbenicillin | Duchefa Biochemie | C0109.25 | Dissolved in water. |
| Kanamycin | Roche Group | 10106801001 | Dissolved in water. |
| Bacto-peptone | BD Biosciences | DF0118072 | |
| Bacto-tryptone | BD Biosciences | DF0123075 | |
| Bacto-yeast extract | BD Biosciences | DF0127071 | |
| Agar | BD Biosciences | DF00145170 | |
| Sterile culture tube | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| Spectrophotometer | Amersham | Gene Quant pro | Amersham is now part of GE Healthcare. |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Stemi 2000 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Accuspin FR |
References
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