Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Durchführung von festen Platte für die Ernährung Einschränkung in
Abstract
Reduktion der Nahrungsaufnahme, ohne Unterernährung oder Hunger ist bekannt, dass Lebensdauer zu erhöhen und das Einsetzen der verschiedenen altersbedingten Erkrankungen in einer Vielzahl von Arten, darunter Säugetiere. Es führt auch zu einer Abnahme des Körpergewichts und der Fruchtbarkeit sowie niedrigere Plasma-Glukose, Insulin und IGF-1 in dieser Tiere. Diese Behandlung wird oft als diätetische Einschränkung (DR) oder kalorische Restriktion (CR) bezeichnet. Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans wurde als ein wichtiger Modellorganismus für die Erforschung der Biologie des Alterns entwickelt. Sowohl Umwelt-und genetischen Manipulationen zu Modell DR verwendet worden und haben gezeigt, dass Lebensdauer in C verlängern elegans. Allerdings sind viele der gemeldeten DR Studien in C. elegans wurden durch die Weitergabe von Tieren in flüssigen Medien, während die meisten genetischen Studien in der alternden Feld auf der Standard-festem Agar in Petrischalen durchgeführt wurden durchgeführt. Hier präsentieren wir Ihnen eine DR-Protokoll unter Verwendung von Standard solide NGM-Agar-Basis-Platte mit abgetöteten Bakterien.
Protocol
1. Herstellen einer Eichkurve für die Bestimmung von Bakterien-Konzentrationen
Dieser Abschnitt beschreibt eine Methode zur Abschätzung der Bakterien-Konzentration für einen bestimmten Bakterienstamm (zB OP50, HT115), die als Nahrungsquelle für Diätetische Einschränkung Experimente in C verwendet werden elegans. Separate Kalibrierkurven sollten für jeden Bakterienstamm verwendet eingerichtet werden.
- Impfen einer einzelnen Kolonie von E. coli OP50 Bakterien aufgenommen von einem frischen Streifen von Bakterien auf LB-Agar in 3 ml flüssiges LB-Brühe.
- Legen Sie OP50 Kultur in 37 ° C Schüttler und lassen Bakterien wachsen über Nacht.
- Bereiten Sie serielle 2-fache Verdünnungen der Bakteriensuspension aus der Übernacht-Kultur (2x, 4x, 8x, 16x, 32x).
- Die Extinktion (optische Dichte) von jeder Verdünnung bei 600 nm mittels Spektralphotometer in dreifacher Ausfertigung.
- Weitere verdünnen jeder Bakteriensuspension 1.000.000-fache (1000-facher Verdünnung zweimal).
- Verbreiten Sie 0,4 ml Bakteriensuspension jeder Verdünnung gleichmäßig auf einem 100 mm LB-Agar-Platte.
- Legen LB-Platten mit OP50 in einem 37 ° C Inkubator für 18-24 Stunden.
- Zählen Sie die Anzahl der Bakterienkolonien auf jeder Platte gewachsen. Die Kolonie zählt werden verwendet, um KBE (Kolonie bildende Einheit) pro ml für jede Probe berechnet werden.
- Die Beziehung zwischen der gemessenen OD 600 Werte und OP50 Bakterien-Konzentrationen können durch Auftragen von OD 600 als Funktion der Konzentration der Bakterien (KBE / ml) und eine lineare Regressionsanalyse (Abbildung 1) festgestellt werden.
Solutions:
| Luria Broth (LB), 1L: | |
| 10 g | Bacto-Trypton |
| 5 g | Hefeextrakt |
| 10 g | NaCl |
Add entionisiertem Wasser auf 1L.
Autoklaven und bei Raumtemperatur lagern.
2. Herstellung von festen Platte für die Ernährung Einschränkung (SDR)-Platten
Dieser Abschnitt beschreibt die Herstellung von Platten für den Einsatz in der Fest-Platte für die Ernährung Einschränkung (SDR) Experimente. Normalerweise betrachten wir eine Bakterien-Konzentration von 1 x 10 11 KBE / mL als ad libitum-Fütterung Zustand und 1 x 10 8 KBE / ml als optimal DR Fütterung Voraussetzung für diese Methode. Allerdings können 4-6 verschiedene Bakterien-Konzentrationen benötigt, um eine vollständige Dosis-abhängige Beziehung zum SDR und ihre Antworten zu etablieren.
- Impfen einer einzelnen Kolonie von E. Coli Bakterien OP50 in 3 ml flüssiges LB-Brühe.
- Setzen Sie den OP50 Kultur in 37 ° C Schüttler und ermöglichen die Bakterien für 6-8 Stunden wachsen.
- Übertragen Sie die OP50 Kultur zu einer neuen Kolben mit 500 mL LB-Bouillon, und platzieren Sie den OP50 Kultur wieder in 37 ° C Schüttler über Nacht.
- Messen Sie die OD 600 der OP50 Kultur, um die Bakterien-Konzentration (die Konzentration wird anhand der Kalibrierkurve in Teil 1 erzeugt) zu bestimmen. Geeignete Verdünnungen können für eine genaue Messung der Absorption erforderlich sein.
- Pellet OP50 Bakterien durch Zentrifugation bei 1.500 g für 20 Minuten.
- Resuspendieren Bakterien zu einer Konzentration von 1 x 10 12 KBE / mL.
- Bereiten Sie 10 mL Bakterienkultur in sechs verschiedenen Konzentrationen: 1 x 10 12, 10 11, 10 10, 10 9, 10 8, 10 7 cfu / mL.
- Pipette 0,2 ml Bakterienkultur in der Mitte eines 60 mm verfestigt NGM Platte. Berühren Sie die Oberfläche der Platte mit Pipettenspitze, wie Kerben auf der Oberfläche erlauben Würmer bohren sich in die Agarplatten.
- Legen Platten in 37 ° C Inkubator für 1 Stunde.
- Übernehmen 10 &mgr; l von 100mg/ml Carbenicillin und 10 ul 50mg/ml Kanamycin zu jeder Platte das Wachstum der Bakterien zu verhaften.
- Shop-Platten mit unterschiedlichen Konzentrationen von Antibiotika-abgetöteten Bakterien bei 4 ° C für den zukünftigen Gebrauch (bis zu 1 Monat). Es ist wichtig für die Vorbereitung und speichern genug Platten für die gesamte geplante Experiment mindestens 1-2 Tage im Voraus. Mit der gleichen Charge von Platten für die gesamte Experimenten vorzuziehen ist.
- Um zu überprüfen, die Lebensfähigkeit der Bakterien, kratzen einige Bakterien aus der SDR-Platten und breitete sie auf einem leeren NGM-Platte mit Carbenicillin und Kanamycin. Die Platte wird in 37 ° C Inkubator für 6-8 Stunden und dann für das Wachstum der Bakterien (kein Wachstum von Bakterien zu beachten) zu überprüfen.
Lösungen
| Nematode Growth Media (NGM), 1L: | |
| 3 g | NaCl |
| 2,5 g | Bacto-Pepton |
| 20g | Agar |
| 1 mL | 1 M MgSO 4 |
| 1 mL | 1 M CaCl 2 |
| 1 mL | 5 mg / ml Cholesterin |
| 25 mL | 1 M Kaliumphosphat, pH 6,0 |
Unmittelbar pour Flüssigkeit NGM auf 60 mm x 15 mm Petrischalen in 10 ml Aliquots
3. Einrichten SDR Experimente
Für die meisten der SDR-Fächer, wie z. B. Lebensdauer Analyse und Fruchtbarkeit Profiling, Erstellung eines Alters-synchronisierte Bevölkerung von Würmern ist unerlässlich. Für andere Studien, einfach übertragen Würmer aus einer regelmäßigen OP50 Platte ein SDR Platte auf die diätetische Einschränkung zu initiieren. In diesem Abschnitt ist ein Protokoll zur Einrichtung einer Lebensdauer-Analyse für SDR Tiere als Beispiel beschrieben.
- Verwenden Sie ein Platin-Wurm-Picker auf 20-30 reproduktiv aktiven Erwachsenen auf mehrere regelmäßige NGM-Platten mit OP50 zu übertragen. Abhängig von der Anzahl der Eier für die Experimente benötigt wird, kann mehr Erwachsene benötigt werden.
- Verlassen Sie die Platten bei 20 ° C für 4 Stunden, damit der Eiablage.
- Entfernen Sie die Erwachsenen von der Platte. Die Platten sollten visuell auf Eier überprüft werden.
- Verlassen Sie die Platten bei 20 ° C und ermöglichen die Nachkommen in die Late-L4/day 1 Erwachsener Bühne zu entwickeln. Normalerweise dauert dies 3 Tage N2 wilden Arten Würmer bei 20 ° C.
- Übertragen einer geeigneten Anzahl von Tag 1 Erwachsenen auf SDR Platte auf die diätetische Einschränkung zu initiieren.
- Für eine Lebensdauer-Analyse, die Einrichtung eines insgesamt von 6-8 Platten mit 10-20 Würmer pro Platte für jeden SDR Zustand.
- Ergebnis der Lebensfähigkeit eines jeden Wurms alle 2 Tage, bis alle Würmer gestorben. Es ist wichtig, dass Würmer an die frische SDR-Platten übertragen werden jedes 12-48 Stunden in Anspruch Entzug von Nahrung zu vermeiden.
4. Repräsentative Ergebnisse:
In Abbildung 1 ist ein Diagramm einer repräsentativen Eichkurve für die Schätzung der OP50-Konzentration in Bezug auf OD 600. Die Gleichung von Liner Regressionsanalyse erzeugt wird, kann für alle zukünftigen Berechnungen der OP50 Bakterien Konzentrationen eingesetzt werden. In Abbildung 2 ist ein Beispiel zur Untersuchung der Wirkung von chronischen SDR-Behandlungen auf die mittlere Lebensdauer der verschiedenen Stämme Wurm. Die blaue Linie stellt eine normale Dosis-abhängige Reaktion von Wildtyp-Würmer SDR. Die rote Linie zeigt an, dass die Lebensdauer Wirkung von SDR teilweise von DRR-2 oe unterdrückt, während daf-16 (mu86) hat keine Auswirkung auf SDR-induzierte Laufzeitverlängerung. Detail-Methode für die Durchführung von Lebensdauer-Analyse in C. elegans ist in der bisherigen Literatur 1-3 beschrieben.
Abbildung 1. Repräsentatives Ergebnis einer Eichkurve für die Abschätzung der E. Coli OP50 Konzentration. OP50-Konzentration als Funktion der gemessenen OD 600-Werte aufgetragen. Fehlerbalken = SD Übernachtung Bakterienkultur wurde 1.5x, 2x, 4x, 8x, 16x, 32x, bevor Extinktionsmessung verdünnt und weiter verdünnt 1.000 x zweimal, bevor cfu Messung.
Abbildung 2. Repräsentatives Ergebnis einer C. elegans Lebensdauer Experiment verglichen Wildtyp N2 Tiere (blau) mit zwei verschiedenen Mutanten (grün und rot) in Reaktion auf SDR (Abbildung von Ching et al. 4). Fehlerbalken = SEM
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Discussion
Diätetische Einschränkung (DR) ist bekannt, dass Lebensdauer zu erhöhen und das Einsetzen der verschiedenen altersbedingten Erkrankungen in einer Vielzahl von Arten, darunter Säugetiere 5-7. Sowohl Umwelt-und genetischen Manipulationen zu Modell DR in C eingesetzt elegans, einschließlich Kultivierung Würmer in einem semi-definierten flüssigen Medium 8,9, Verdünnung der bakteriellen Nahrungsquelle in einem flüssigen Medium 10-12, und die Verwendung von Verhaltens-Mutanten, dass Futtermittel mit einer langsameren Rate 13. Allerdings können genetische ahmt der DR produzieren Phänotypen, die nicht mit DR sind, während Kultivierung Würmer in einem flüssigen Medium handelt Wachstumsbedingungen, die aus dem festen Medium Platte Bedingungen von den meisten Wurm Labors angepasst sind. Ein DR-Protokoll auf Standard massiven Platten durchgeführt nützlich wäre und deshalb wurde von mehreren Gruppen 4,14,15 entwickelt worden.
In das Protokoll hier beschrieben, sind die Bakterien durch die Anwendung von zwei verschiedenen Antibiotika, um die Platten als eine Möglichkeit, das Niveau der Steuerung der Nahrungsaufnahme getötet. Allerdings können alternative Methoden wie UV-Exposition auch verwendet, um das Wachstum von Bakterien hemmen.
Um zu vermeiden, komplette Entzug von Nahrung (zB Hunger) im Laufe des SDR Experimente, müssen Würmer an die frische SDR-Platten übertragen werden alle 12-48 Stunden, wie oben in Schritt 3.7 erwähnt. Die Häufigkeit der Übertragung hängt von der Lebensmittel-Konzentration, die Anzahl der Würmer pro Platte, und die Menge der Nachkommen von dem Wurm Belastung im Experiment verwendeten produziert. Zum Beispiel können Würmer alle 48 Stunden, wenn 20 sterile CF512 übertragen werden [fer-15 (b26); fem-1 (hc17)] Tiere wurden auf einem SDR-Platten mit 1 x 10 7 cfu / mL OP50 Bakterien gelegt. Die Häufigkeit der Übertragung sollte durch die Untersuchung, vor dem Experiment, wie lange der SDR-Platten vor dem gesetzten bakteriellen ist vollständig von Würmern unter experimentellen Bedingungen verbraucht letzten ermittelt werden konnte. Bei der Durchführung von Experimenten, die mehrere Wochen dauern (zB Lebensdauer-Analyse) mit einem nicht-sterile Stamm, 50μg/ml FUDR auf SDR-Platten gegeben werden kann vor bis 3,5 Schritt zur Beseitigung der Eiablage. Andernfalls wird Würmer haben, um frische Platten übertragen werden viel häufiger zu völligen Erschöpfung von Lebensmitteln wegen ihrer Nachkommen zu vermeiden.
Zwar gibt es keine festgelegten Grenze für die Anzahl von Würmern, die pro Platte in ein SDR Experiment platziert werden können, indem mehr als 20 Tieren pro Platte kann zu Schwierigkeiten beim Scoring Lebensfähigkeit für eine Lebensdauer-Analyse nach dem SDR-Behandlung. Es ist auch erwähnenswert, dass SDR so früh wie Tag 1 des Erwachsenenalters eingeleitet werden kann. Allerdings kann die Einleitung von SDR in den frühen Larvenstadien verursachen Entwicklungsstörungen Verhaftung unter bestimmten Umständen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von einem Piloten Auszeichnung des Nathan Shock Center (P30 AG13283) und R01 zu gewähren (R01 AG028516) aus dem National Institute on Aging (NIA) auf A.-LH unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbenicillin | Duchefa Biochemie | C0109.25 | Dissolved in water. |
| Kanamycin | Roche Group | 10106801001 | Dissolved in water. |
| Bacto-peptone | BD Biosciences | DF0118072 | |
| Bacto-tryptone | BD Biosciences | DF0123075 | |
| Bacto-yeast extract | BD Biosciences | DF0127071 | |
| Agar | BD Biosciences | DF00145170 | |
| Sterile culture tube | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| Spectrophotometer | Amersham | Gene Quant pro | Amersham is now part of GE Healthcare. |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Stemi 2000 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Accuspin FR |
References
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