Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לביצוע הגבלה מוצק צלחת מבוססי תזונתיים
Abstract
הפחתת צריכת המזון ללא רעב או תת תזונה ידוע להגדיל את תוחלת החיים ואת לעכב את התחלתה של מחלות הקשורות לגיל שונים במגוון רחב של מינים, כולל יונקים. זה גם גורם לירידה במשקל הגוף, פוריות, כמו גם רמות נמוכות של גלוקוז בדם, אינסולין, IGF-1 אצל בעלי חיים אלה. טיפול זה המכונה לעתים קרובות מגבלה תזונתיים (DR) או הגבלה קלורית (CR). Caenorhabditis elegans נמטודות התפתחה אורגניזם מודל חשוב עבור מחקר על הביולוגיה של ההזדקנות. מניפולציות הן סביבתיים וגנטיים שימשו מודל DR ו הראו כדי להאריך את תוחלת החיים ב C. elegans. עם זאת, רבים דיווחו DR מחקרים ב C. elegans נעשו על ידי הפצת חיות בתקשורת נוזלי, בעוד רוב המחקרים הגנטיים בתחום הזדקנות נעשו על אגר מוצק רגיל צלחות פטרי. כאן אנו מציגים פרוטוקול DR באמצעות תקן NGM אגר מוצק מבוססי צלחת עם חיידקים נהרג.
Protocol
1. הקמת עקומת כיול עבור להערכת ריכוזי חיידקים
סעיף זה מתאר שיטה להערכת ריכוז החיידקים עבור כל זן חיידקי מסוים (למשל OP50, HT115) אשר ישמשו כמקור מזון עבור ניסויים הגבלה תזונתיים ב C. elegans. עקומות כיול נפרדת יש להקים לכל זן חיידקים המשמשים.
- לחסן מושבה אחת של E. coli OP50 חיידקים שנקטפו פס חדש של חיידקים על אגר LB LB במרק 3 מ"ל נוזל.
- OP50 המקום והתרבות 37 ° C שייקר ולאפשר לחיידקים לגדול בין לילה.
- הכנת סידורי 2 פי דילולים של ההשעיה חיידקים מתרבות הלילה (2x, 4x, 8x, 16x, 32x).
- מדוד את ספיגת (צפיפות אופטית) של דילול זה ב 600 ננומטר על ידי ספקטרופוטומטר בשלושה עותקים.
- יתר על כן לדלל כל השעיה חיידקי 1,000,000 פי (1000 פי דילול פעמיים).
- מורחים 0.4 מ"ל של חיידקי ההשעיה של דילול באופן שווה על כל צלחת LB 100 מ"מ אגר.
- המקום צלחות LB עם OP50 ב 37 ° C חממה 18-24 שעות.
- ספירת מושבות חיידקים גדל על כל צלחת. ספירת המושבה משמשים כדי לחשב CFU (יחידת המושבה להרכיב) לכל מ"ל עבור כל דגימה.
- הקשר בין מדד OD 600 ערכים OP50 ריכוזי חיידקים ניתן הוקמה על ידי התוויית OD 600 כפונקציה של ריכוז חיידקי (CFU / mL) ואת ביצוע ניתוח רגרסיה ליניארית (איור 1).
פתרונות:
| מרק לוריא (LB), 1 ליטר: | |
| 10 גרם | Bacto-tryptone |
| 5 גרם | תמצית שמרים |
| 10 גרם | NaCl |
מוסיפים מים כדי deionized 1L.
החיטוי ולאחסן בטמפרטורת החדר.
2. הכנת מוצק צלחת מבוססי (SDR) צלחות תזונתיים הגבלה
סעיף זה מתאר את הכנת צלחות לשימוש מוצק צלחת מבוסס (SDR) ניסויים תזונתיים הגבלה. בדרך כלל, אנו רואים ריכוז חיידקים של 1 x 10 11 CFU / mL כתנאי כרצונך מודעה האכלה 1 x 10 8 CFU / mL כתנאי DR אופטימלי האכלה עבור שיטה זו. עם זאת, 4-6 ריכוזי חיידקים שונים ייתכן שיהיה צורך ליצור מערכת יחסים שלמה מינון תלויי עבור SDR ותגובות שלה.
- לחסן מושבה אחת של E. קולי OP50 חיידקים 3 מ"ל מרק נוזלי LB.
- מניחים את תרבות OP50 ב 37 ° C שייקר ולאפשר לחיידקים לגדול במשך 6-8 שעות.
- העברת התרבות OP50 כדי בבקבוק חדש המכיל 500 מ"ל מרק LB, והמקום תרבות OP50 בחזרה 37 ° C שייקר לילה.
- מדוד את OD 600 של התרבות OP50 כדי לקבוע את ריכוז החיידקים (ריכוז מחושב באמצעות עקומת כיול שנוצר חלק 1). דילולים מתאים עשוי להיות נחוץ עבור מדידה מדויקת של ספיגת.
- גלולה OP50 חיידקים על ידי צנטריפוגה ב 1500 גרם במשך 20 דקות.
- Resuspend חיידקים בריכוז של 1 x 10 12 CFU / mL.
- הכן 10 מ"ל התרבות חיידקים בשישה ריכוזים שונים: 1 x 10 12, 10 11, 10 10, 10 9, 10, 8 10 7 CFU / ml.
- פיפטה 0.2 מ"ל של התרבות חיידקים למרכז מ"מ 60 הקרושה צלחת NGM. הימנע מנגיעה את פני השטח של צלחת עם פיפטה קצה, כמו ניקס על פני השטח מאפשרים תולעים להתחפר לתוך צלחות אגר.
- המקום צלחות 37 ° C החממה במשך שעה 1.
- החל 10μL של 100mg/mL carbenicillin ו 10 μL של kanamycin 50mg/mL על כל צלחת לעצור את הצמיחה של החיידקים.
- חנות צלחות עם ריכוזים שונים של אנטיביוטיקה, הרג חיידקים על 4 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי (עד חודש). חשוב להכין ולאחסן צלחות מספיק הניסוי המתוכנן כולו לפחות 1-2 ימים קדימה. באמצעות אצווה זהה של הצלחות הניסויים כולו עדיפה.
- כדי לבדוק את הכדאיות של חיידקים, חיידקים לגרד כמה מתוך צלחות SDR ופרש אותה על צלחת ריקה NGM עם carbenicillin ו kanamycin. מניחים את צלחת 37 ° C בחממה במשך 6-8 שעות ולאחר מכן לבדוק צמיחה של חיידקים (אין צמיחה חיידקים יש לשים לב).
פתרונות
| צמיחה נמטודות מדיה (NGM), 1 ליטר: | |
| 3 גרם | NaCl |
| 2.5 גרם | Bacto-Peptone |
| 20 גרם | אגר |
| 1 מ"ל | 1 מ 4 MgSO |
| 1 מ"ל | 1 M CaCl 2 |
| 1 מ"ל | 5 מ"ג / מ"ל כולסטרול |
| 25 מ"ל | אשלגן פוספט 1M, 6.0 pH |
מיד NGM לשפוך נוזל על 60 מ"מ x 15 מ"מ בצלחות פטרי ב 10 מ"ל aliquots
3. הגדרת ניסויים SDR
עבור רוב SDR-הקשורים ללימודים, כגון ניתוח תוחלת החיים ואת פרופיל פוריות, הכנת האוכלוסייה בגיל מסונכרן של תולעים היא חיונית. עבור מחקרים אחרים, פשוט להעביר תולעים מצלחת לצלחת OP50 קבוע SDR כדי ליזום את הגבלת תזונתיים. בסעיף זה, פרוטוקול להקים ניתוח תוחלת החיים של בעלי חיים SDR מתוארת כדוגמה.
- השתמש בורר תולעת פלטינה להעביר 20-30 מבוגרים reproductively פעיל על מספר הצלחות NGM קבוע עם OP50. בהתאם למספר הביצים הדרוש הניסויים, מבוגרים יותר עשוי להיות נחוץ.
- השאירו את הצלחות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות כדי לאפשר ההטלה.
- הסר את המבוגרים מן הצלחת. צלחות יש לבדוק ויזואלית את הביצים.
- השאירו את הצלחות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס ולאפשר הצאצאים לפתח לשלב Late-L4/day 1 מבוגר. בדרך כלל זה לוקח 3 ימים תולעים N2 סוגי בר ב 20 ° C.
- העברת מספר מתאים של 1 מבוגרים יום לצלחת SDR כדי ליזום את הגבלת תזונתיים.
- לניתוח תוחלת החיים, להקים סך של 6-8 צלחות עם 10-20 תולעים לכל צלחת עבור כל תנאי SDR.
- ציון את הכדאיות של כל תולעת כל 2 ימים עד שכל התולעים מתו. זה קריטי, כי תולעים יועברו צלחות SDR טריים כל 12-48 שעות כדי למנוע קיפוח מוחלט של מזון.
4. נציג תוצאות:
שמוצג באיור 1 היא מזימה של עקומת כיול עבור נציג להערכת ריכוז OP50 ביחס OD 600. המשוואה שנוצר על ידי ניתוח רגרסיה אניה יכול לשמש עבור כל החישובים העתיד של OP50 ריכוזי חיידקים. שמוצג באיור 2 הוא דוגמה assaying את ההשפעה של טיפולים SDR כרונית על תוחלת החיים הממוצעת של זנים שונים של תולעים. הקו הכחול מייצג תגובה נורמלית מינון תלויי של wild-type תולעים SDR. הקו האדום מציין כי ההשפעה של תוחלת החיים SDR מודחק חלקית על ידי drr OE-2, בעוד daf-16 (mu86) אין כל השפעה על הארכת תוחלת החיים SDR-Induced. פירוט השיטה לביצוע ניתוח תוחלת החיים ב C. elegans מתואר בספרות 1-3 הקודמת.
באיור 1. התוצאה נציג של עקומת כיול עבור להערכת ה OP50 קולי ריכוז. OP50 ריכוז זממו כפונקציה של מדד OD 600 ערכים. ברים שגיאה = התרבות חיידקים SD לילה היה מדולל 8x 1.5x, 2x, 4x, 16x, 32x לפני מדידת ספיגת ו בדילול עוד 1,000 x פעמיים לפני המדידה CFU.
איור 2. התוצאה נציג של C. הניסוי elegans תוחלת החיים השוואת N2 סוג חיות בר (כחול) עם שתי מוטציות שונות (ירוק ואדום) בתגובה SDR (איור מתוך צ'ינג et al. 4). ברים שגיאה = SEM
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הגבלה תזונתיים (DR) ידוע להגדיל את תוחלת החיים ואת לעכב את התחלתה של מחלות הקשורות לגיל שונים במגוון רחב של מינים, כולל יונקים 5-7. מניפולציות הן סביבתיים וגנטיים שימשו מודל DR ב C. elegans, כולל תולעים culturing במדיום למחצה מוגדרים נוזל 8,9, דילול של מקור מזון חיידקים במדיום נוזלי 10-12, ושימוש מוטנטים התנהגות להאכיל בקצב איטי יותר 13. עם זאת, מחקה הגנטי של DR עשויה לייצר פנוטיפים שאינן קשורות ל DR, ואילו תולעים culturing בתווך נוזלי כרוכה בתנאים צמיחה שונים מתנאי מוצק צלחת בינוני מותאם על ידי מעבדות תולעת ביותר. פרוטוקול DR שבוצעה על צלחות מוצק רגיל יהיה שימושי ולכן פותחה על ידי מספר קבוצות 4,14,15.
בפרוטוקול המתואר כאן, חיידקים מומתים על ידי יישום שני סוגי אנטיביוטיקה שונים של צלחות כדרך לשלוט ברמת צריכת המזון. עם זאת, שיטות חלופיות כגון חשיפה UV יכול לשמש גם כדי לעכב את הצמיחה חיידקים.
כדי למנוע קיפוח מוחלט של מזון (כלומר, רעב) במהלך הניסויים SDR, תולעים צריכים להיות מועברים צלחות SDR טריים כל 12-48 שעות כאמור בשלב 3.7. תדירות העברת תלויה בריכוז המזון, מספר התולעים לכל צלחת, ואת כמות הצאצאים המיוצרים על ידי זן התולעת השתמשו בניסוי. למשל, תולעים ניתן להעביר כל 48 שעות, כאשר 20 CF512 סטרילי [fer-15 (b26); פאם-1 (hc17)] בעלי חיים הונחו על צלחות SDR המכיל 1 x 10 7 CFU / mL OP50 חיידקים. תדירות העברת צריך להיקבע על ידי בחינת לפני הניסוי, כמה זמן יכול להימשך צלחות SDR לפני זורעים חיידקים נצרך לחלוטין על ידי תולעים תחת תנאי הניסוי. בעת ביצוע ניסויים בשבועות האחרונים (ניתוח למשל תוחלת החיים) עם זן שאינו סטרילי, 50μg/ml FUDR ניתן להוסיף צלחות SDR לפני צעד 3.5 לחסל את ההטלה. אחרת, תולעים יצטרכו להיות מועברים צלחות טרי הרבה יותר קרובות, כדי למנוע דלדול מוחלט של מזון בשל צאצאיהם.
אמנם אין הגבלה על מספר מוגדר של תולעים כי ניתן למקם בכל צלחת בניסוי SDR, הצבת יותר מ -20 חיות לכל צלחת עלולים לגרום קושי הבקיע הכדאיות לניתוח תוחלת חיים לאחר הטיפול SDR. זה גם ראוי לציין כי SDR יכול להיות יזם מוקדם ככל יום 1 של הבגרות. עם זאת, תחילת SDR הזחל בשלבים המוקדמים עלול לגרום למעצר התפתחותי בנסיבות מסוימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי פרס טייס ממרכז הלם נתן (P30 AG13283) ומענק R01 (R01 AG028516) מן המכון הלאומי להזדקנות (NIA) ל-A-LH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbenicillin | Duchefa Biochemie | C0109.25 | Dissolved in water. |
| Kanamycin | Roche Group | 10106801001 | Dissolved in water. |
| Bacto-peptone | BD Biosciences | DF0118072 | |
| Bacto-tryptone | BD Biosciences | DF0123075 | |
| Bacto-yeast extract | BD Biosciences | DF0127071 | |
| Agar | BD Biosciences | DF00145170 | |
| Sterile culture tube | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| Spectrophotometer | Amersham | Gene Quant pro | Amersham is now part of GE Healthcare. |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Stemi 2000 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Accuspin FR |
References
- Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300, 1142-1145 (2003).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366, 461-464 (1993).
- Apfeld, J., Kenyon, C. Regulation of lifespan by sensory perception in Caenorhabditis elegans. Nature. 402, 804-809 (1999).
- Ching, T. T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. L. drr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Aging Cell. 9, 545-557 (2010).
- Weindruch, R., Walford, R. The Retardation of Aging and Disease by Dietary Restriction. , Thomas. (1988).
- Masoro, E. J. Subfield history: caloric restriction, slowing aging, and extending life. Sci Aging Knowledge Environ. , RE2-RE2 (2003).
- Masoro, E. J. Overview of caloric restriction and ageing. Mech Ageing Dev. 126, 913-922 (2005).
- Houthoofd, K. Axenic growth up-regulates mass-specific metabolic rate, stress resistance, and extends life span in Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol. 37, 1371-1378 (2002).
- Houthoofd, K. No reduction of metabolic rate in food restricted Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol. 37, 1359-1369 (2002).
- Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).
- Bishop, N. A., Guarente, L. Two neurons mediate diet-restriction-induced longevity in C. elegans. Nature. 447, 545-549 (2007).
- Panowski, S. H., Wolff, S., Aguilaniu, H., Durieux, J., Dillin, A. PHA-4/Foxa mediates diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Nature. 447, 550-555 (2007).
- Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13091-13096 (1998).
- Kaeberlein, T. L. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food. Aging Cell. 5, 487-494 (2006).
- Greer, E. L. An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in C. elegans. Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).
