Summary
Qui vi presentiamo un protocollo per l'esecuzione di solido piatto a base di restrizioni alimentari,
Abstract
Riduzione del consumo di cibo, senza fame o malnutrizione è conosciuto per aumentare la durata della vita e ritardare l'insorgenza di varie malattie legate a una vasta gamma di specie, tra i mammiferi. Essa provoca anche una diminuzione del peso corporeo e fertilità, così come bassi livelli di glicemia, insulina e IGF-1 in questi animali. Questo trattamento è spesso definito come restrizione dietetica (CD) o restrizione calorica (CR). Il nematode Caenorhabditis elegans è emerso come un organismo importante modello per lo studio della biologia dell'invecchiamento. Entrambe le manipolazioni ambientali e genetici sono stati utilizzati per modellare DR e hanno dimostrato di prolungare la durata della vita in C. elegans. Tuttavia, molti degli studi DR riportato in C. elegans sono stati fatti da animali di propagazione in mezzi liquidi, mentre la maggior parte degli studi genetici nel campo dell'invecchiamento sono stati fatti su l'agar standard di solido in piastre di Petri. Qui vi presentiamo un protocollo DR utilizzando le normali solido NGM agar a base di piastra con batteri uccisi.
Protocol
1. Stabilire una curva di calibrazione per la stima delle concentrazioni di batteri
Questa sezione descrive un metodo per la stima della concentrazione di batteri per ogni ceppo dato batteri (ad esempio, OP50, HT115) che verrà utilizzato come fonte di cibo per esperimenti di restrizione dietetica in C. elegans. Curve di calibrazione separati dovrebbero essere stabiliti per ciascun batteri ceppo usato.
- Inoculare una singola colonia di E. coli OP50 batteri selezionati da una vena fresca di batteri su agar LB in 3 ml di brodo LB liquido.
- Luogo OP50 cultura in 37 ° C shaker e permettere ai batteri di crescere durante la notte.
- Preparare seriale 2-diluizioni della sospensione batterica dalla cultura durante la notte (2x, 4x, 8x, 16x, 32x).
- Misurare l'assorbanza (densità ottica) di ogni diluizione a 600 nm con spettrofotometro in triplice copia.
- Diluire ulteriormente ogni sospensione batterica 1.000.000 volte (1000-diluizione due volte).
- Diffusione 0,4 ml di sospensione di batteri di ogni diluizione in modo uniforme su una piastra di agar LB 100 mm.
- Posizionare le piastre LB con OP50 in un incubatore a 37 ° C per 18-24 ore.
- Contare il numero di colonie batteriche coltivate su ogni piatto. La conta delle colonie vengono utilizzati per calcolare ufc (unità formanti colonia) per ml per ogni campione.
- Il rapporto tra i valori misurati OD 600 e OP50 concentrazioni di batteri può essere stabilita tracciando OD 600 in funzione della concentrazione batterica (ufc / ml) e l'esecuzione di un'analisi di regressione lineare (Figura 1).
Soluzioni:
| Luria Broth (LB), 1L: | |
| 10 g | Bacto-triptone |
| 5 g | Estratto di Lievito |
| 10 g | NaCl |
Aggiungere acqua deionizzata a 1L.
Autoclave e conservare a temperatura ambiente.
2. Preparazione del solido piatto a base di restrizione dietetica (SDR) piastre
Questa sezione descrive la preparazione di piatti per l'uso in solido piatto a base di restrizione dietetica (SDR) esperimenti. Normalmente, si considera una concentrazione di batteri di 1 x 10 11 ufc / ml come condizione l'alimentazione ad libitum e 1 x 10 8 ufc / ml come condizione ottimale di alimentazione DR per questo metodo. Tuttavia, 4-6 differenti concentrazioni dei batteri può essere necessario per stabilire una completa relazione dose-dipendente per SDR e le sue risposte.
- Inoculare una singola colonia di E. Coli OP50 batteri in 3 ml di brodo LB liquido.
- Posizionare il OP50 cultura in 37 ° C shaker e permettere ai batteri di crescere per 6-8 ore.
- Trasferire il OP50 cultura in un pallone nuovo contenente 500 ml di brodo LB, e posizionare il OP50 cultura indietro nel 37 ° C durante la notte shaker.
- Misurare il diametro esterno 600 della cultura OP50 per determinare la concentrazione di batteri (la concentrazione è calcolata utilizzando la curva di calibrazione generata in parte 1). Diluizioni appropriate possono essere necessari per una misurazione accurata di assorbanza.
- Pellet OP50 batteri mediante centrifugazione a 1.500 g per 20 minuti.
- Risospendere batteri a una concentrazione di 1 x 10 12 ufc / ml.
- Preparare 10 mL di coltura batterica in sei diverse concentrazioni: 1 x 10 12, 10 11, 10 10, 10 9, 10 8, 10 7 ufc / ml.
- Pipettare 0,2 ml di coltura batterica al centro di una piastra da 60 mm solidificato NGM. Evitare di toccare la superficie della piastra con puntale, le scalfitture sulla superficie permettono di scavare vermi nei piatti di agar.
- Piastre posto nella 37 ° C incubatore per 1 ora.
- Applicare 10μL di 100mg/ml carbenicillina e 10 ml di kanamicina 50mg/ml ad ogni piatto di arrestare la crescita dei batteri.
- Conservare le piastre con diverse concentrazioni di antibiotico-batteri uccisi a 4 ° C per un uso futuro (fino a un mese). E 'importante preparare e conservare le piastre a sufficienza per l'intero esperimento programmato almeno 1-2 giorni a venire. Utilizzando lo stesso lotto di piastre per gli esperimenti intero è preferibile.
- Per verificare la vitalità dei batteri, raschiare alcuni batteri fuori delle piastre SDR e stenderlo su un piatto vuoto con NGM carbenicillina e kanamicina. Posizionare la piastra a 37 ° C incubatore per 6-8 ore e poi controllare per la crescita dei batteri (nessuna crescita dei batteri devono essere osservati).
Soluzioni
| Nematode crescita Media (NGM), 1L: | |
| 3 g | NaCl |
| 2,5 g | Bacto-peptone |
| 20g | Agar |
| 1 ml | 1 M MgSO 4 |
| 1 ml | 1 M CaCl 2 |
| 1 ml | 5 mg / ml colesterolo |
| 25 mL | Potassio fosfato 1M, pH 6.0 |
Immediatamente versare NGM liquido sul 60 mm x 15 millimetri capsule di Petri in 10 aliquote mL
3. La creazione di esperimenti DSP
Per la maggior parte delle SDR-studi collegati, come l'analisi durata della vita e profilatura fertilità, la preparazione di un età sincronizzato popolazione di vermi è essenziale. Per altri studi, è sufficiente trasferire i vermi da un regolare OP50 piastra per un piatto di SDR di avviare la restrizione dietetica. In questa sezione, un protocollo per impostare un'analisi vita per gli animali SDR è descritto come un esempio.
- Utilizzare un selettore a vite senza fine di platino per trasferire 20-30 adulti sessualmente attivi su diverse piastre NGM regolari con OP50. A seconda del numero di uova necessarie per gli esperimenti, più adulti possono essere necessari.
- Lasciare le piastre a 20 ° C per 4 ore per consentire la deposizione delle uova.
- Rimuovere gli adulti dal piatto. Piastre deve essere ispezionato visivamente per le uova.
- Lasciare le piastre a 20 ° C e permettono la progenie di sviluppare nella fase 1 adulto Late-L4/day. Di solito, questo richiede 3 giorni per N2 worm selvatici tipi a 20 ° C.
- Trasferire un numero adeguato di giorno 1 adulti sulla piastra SDR di avviare la restrizione dietetica.
- Per un'analisi durata della vita, istituito per un totale di 6-8 piatti con 10-20 vermi per piastra per ogni condizione di SDR.
- Punteggio la vitalità di ogni verme ogni 2 giorni fino a quando tutti i vermi sono morti. E 'fondamentale che i vermi essere trasferiti a piastre SDR fresco ogni 12-48 ore per evitare la completa privazione di cibo.
4. Rappresentante dei risultati:
Mostrato nella Figura 1 è un grafico di una curva di calibrazione rappresentante per la stima della concentrazione OP50 in relazione al diametro esterno 600. L'equazione generato attraverso l'analisi di regressione rivestimento può essere utilizzato per tutti i futuri calcoli di OP50 concentrazioni di batteri. Illustrato nella figura 2 è un esempio di saggiare l'effetto dei trattamenti DSP cronica durata media di ceppi di vite diverse. La linea blu rappresenta una normale risposta dose-dipendente di tipo selvaggio worm di SDR. La linea rossa indica che l'effetto durata di DSP è parzialmente soppressa dal DRR-2 oe, mentre daf-16 (mu86) non ha effetto su SDR-indotta prolunga la durata della vita. Metodo di dettaglio per l'esecuzione di analisi durata in C. elegans è descritto in letteratura 1-3 precedenti.
Figura 1. Rappresentante risultato di una curva di calibrazione per la stima di E. Coli OP50 concentrazione. OP50 concentrazione è tracciata in funzione del diametro esterno 600 valori misurati. Le barre di errore = SD cultura Pernottamento batterica è stato diluito 1.5x, 2x, 4x, 8x, 16x, 32x prima misurazione dell'assorbanza, e ulteriormente diluito 1.000 x due volte prima di misurazione cfu.
Figura 2. Risultato di un rappresentante C. elegans esperimento di vita a confronto animali selvatici tipo N2 (blu) con due diversi mutanti (verde e rosso) in risposta a DSP (Figura da Ching et al. 4). Barre di errore = SEM
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Discussion
Restrizione dietetica (DR) è noto per aumentare la durata della vita e ritardare l'insorgenza di varie malattie legate a una vasta gamma di specie, tra cui i mammiferi 5-7. Entrambe le manipolazioni ambientali e genetici sono stati utilizzati per modellare DR in C. elegans, tra cui vermi coltura in un semi-definita liquido 8,9, diluizione della fonte di cibo batterica in terreno liquido 10-12, e l'uso di mutanti comportamenti che alimentano ad un ritmo più lento 13. Tuttavia, imita genetica della DR possono produrre fenotipi che sono estranei a DR, mentre i vermi coltura in un mezzo liquido comporta condizioni di crescita che si differenziano dalle condizioni solida piastra medio adattato da laboratori più verme. Un protocollo DR eseguite su lastre standard solido sarebbe utile e, pertanto, è stato sviluppato da diversi gruppi 4,14,15.
Nel protocollo qui descritto, i batteri vengono uccisi mediante l'applicazione di due antibiotici diversi per i piatti come un modo per controllare il livello di assunzione di cibo. Tuttavia, i metodi alternativi, come l'esposizione ai raggi UV può essere utilizzato anche per inibire la crescita dei batteri.
Per evitare di completa privazione di cibo (fame cioè) nel corso di esperimenti di DSP, i vermi devono essere trasferiti alle piastre SDR fresco ogni 12-48 ore come sopra indicato al punto 3.7. La frequenza del trasferimento dipende dalla concentrazione degli alimenti, il numero di worm per piastra, e la quantità della prole prodotta dal ceppo verme utilizzato nell'esperimento. Per esempio, i worm possono essere trasferiti ogni 48 ore in cui 20 CF512 sterile [fer-15 (B26); fem-1 (hc17)] animali sono stati collocati su un piastre SDR contenente 1 x 10 7 ufc / ml OP50 batteri. La frequenza del trasferimento deve essere determinato esaminando, prima dell'esperimento, per quanto tempo le piastre SDR potrebbe durare prima che la testa di serie batterica è completamente consumato da vermi in condizioni sperimentali. Durante l'esecuzione di esperimenti che durano diverse settimane (ad esempio analisi durata) con un ceppo non sterile, 50μg/ml FUDR possono essere aggiunti alle piastre SDR prima di passo 3.5 per eliminare la deposizione delle uova. Altrimenti, worm dovranno essere trasferiti in piastre fresca molto più frequentemente per evitare l'esaurimento completo di cibo a causa della loro prole.
Mentre non vi è alcun limite al numero di worm che possono essere posizionate per piastra in un esperimento SDR, mettendo più di 20 capi per piastra può causare difficoltà nel notare fattibilità per un'analisi durata di vita dopo il trattamento DSP. E 'anche interessante notare che SDR può essere iniziato già nel 1 ° giorno di vita adulta. Tuttavia l'inizio della SDR in primi stadi larvali possono causare arresto dello sviluppo in determinate circostanze.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da un premio pilota dal Centro Shock Nathan (P30 AG13283) e una borsa di R01 (R01 AG028516) dal National Institute on Aging (NIA) di A.-LH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbenicillin | Duchefa Biochemie | C0109.25 | Dissolved in water. |
| Kanamycin | Roche Group | 10106801001 | Dissolved in water. |
| Bacto-peptone | BD Biosciences | DF0118072 | |
| Bacto-tryptone | BD Biosciences | DF0123075 | |
| Bacto-yeast extract | BD Biosciences | DF0127071 | |
| Agar | BD Biosciences | DF00145170 | |
| Sterile culture tube | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| Spectrophotometer | Amersham | Gene Quant pro | Amersham is now part of GE Healthcare. |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Stemi 2000 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Accuspin FR |
References
- Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300, 1142-1145 (2003).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366, 461-464 (1993).
- Apfeld, J., Kenyon, C. Regulation of lifespan by sensory perception in Caenorhabditis elegans. Nature. 402, 804-809 (1999).
- Ching, T. T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. L. drr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Aging Cell. 9, 545-557 (2010).
- Weindruch, R., Walford, R. The Retardation of Aging and Disease by Dietary Restriction. , Thomas. (1988).
- Masoro, E. J. Subfield history: caloric restriction, slowing aging, and extending life. Sci Aging Knowledge Environ. , RE2-RE2 (2003).
- Masoro, E. J. Overview of caloric restriction and ageing. Mech Ageing Dev. 126, 913-922 (2005).
- Houthoofd, K. Axenic growth up-regulates mass-specific metabolic rate, stress resistance, and extends life span in Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol. 37, 1371-1378 (2002).
- Houthoofd, K. No reduction of metabolic rate in food restricted Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol. 37, 1359-1369 (2002).
- Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).
- Bishop, N. A., Guarente, L. Two neurons mediate diet-restriction-induced longevity in C. elegans. Nature. 447, 545-549 (2007).
- Panowski, S. H., Wolff, S., Aguilaniu, H., Durieux, J., Dillin, A. PHA-4/Foxa mediates diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Nature. 447, 550-555 (2007).
- Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13091-13096 (1998).
- Kaeberlein, T. L. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food. Aging Cell. 5, 487-494 (2006).
- Greer, E. L. An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in C. elegans. Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).
