Summary
ここでは、固体プレートベースの食事制限を行うためのプロトコルを提示
Abstract
栄養失調や飢餓のない食物摂取の減少は、寿命を向上させ、哺乳動物を含めた種の広い範囲で様々な加齢に伴う病気の発症を遅らせることが知られている。また、体重と生殖能力の低下だけでなく、血漿グルコース、インスリン、およびこれらの動物におけるIGF - 1の低いレベルになります。この治療はしばしば、食事制限（DR）やカロリー制限（CR）と呼ばれています。線虫Caenorhabditis elegansは老化の生物学を研究するための重要なモデル生物として注目されています。環境と遺伝子操作モデルDRに使用されてきたとCで寿命を延ばすことが示されている両方エレガンス 。しかし、C言語で報告されたDRの研究の多くエレガンスは、加齢分野における遺伝学的研究のほとんどはペトリ皿の標準固形寒天上で行われた一方、液体培地で動物を伝播することによって行われた。ここでは、死菌と標準固体NGM寒天ベースのプレートを使用してDRのプロトコルを提示する。
Protocol
1。細菌の濃度を推定するための検量線の確立
このセクションでは、C言語の食事制限の実験のための食料源として使用される任意の細菌株（例えば、OP50、HT115）のための細菌の濃度を推定する方法を説明しますエレガンス 。別々の検量線は、株が使用されている各細菌のために確立されるべきである。
- E.のシングルコロニーを植菌大腸菌 OP50細菌は、3 mLの液体LBブロス中のLB寒天培地上の細菌の新鮮な筋から選んだ。
- 場所OP50 37文化℃のシェーカーと細菌が一晩増殖することができます。
- 一晩培養液からの細菌懸濁液（2倍、4倍、8倍、16倍、32倍速）の連続2倍希釈液を調製する。
- 三重での分光光度計により600 nmで、各希釈液の吸光度（光学密度）を測定します。
- さらにそれぞれの細菌懸濁液100万倍（1000倍希釈倍）希釈する。
- 100mmのLB寒天プレート上に均等に各希釈液の細菌懸濁液0.4 mLを広げる。
- 18〜24時間、37℃インキュベーターでOP50のある場所LBプレートを。
- 各プレート上で生育した細菌のコロニーの数を数えます。コロニー数は、各サンプルに対してmL当たりのcfu（コロニー形成単位）の計算に使用されます。
- 測定OD 600の値とOP50細菌濃度との関係は、細菌濃度（CFU / mL）をの関数としてOD 600をプロットし、線形回帰分析（図1）を実行することによって確立することができます。
ソリューション：
| ルリアブロス（LB）、1L： | |
| 10グラム | バクトトリプトン |
| 5グラム | 酵母エキス |
| 10グラム | NaClの |
1Lに脱イオン水を追加。
オートクレーブ、室温で保管。
2。固体プレートベースの食事制限（SDR）プレートの調製
このセクションでは、固体プレートベースの食事制限（SDR）の実験で使用するためのプレートの準備について説明します。通常は、我々は、条件と1この方法のための最適なDRの給餌条件として× 10 8 CFU / mLの送りを自由に摂取として1 × 10 11 CFU / mLの細菌の濃度を考慮してください。しかし、4-6異なる細菌の濃度は、SDRとその応答のための完全な用量依存関係を確立するために必要な場合があります。
- E.のシングルコロニーを植菌3 mLの液体LBブロス中の大腸菌 OP50細菌。
- 37℃のシェーカーでOP50文化を置き、細菌が6〜8時間のために成長することができます。
- 500mLのLBブロスを含む新しいフラスコにOP50文化を転送し、℃でシェーカー一晩37に戻ってOP50文化を置きます。
- 細菌濃度（濃度は第1部で生成された検量線を用いて計算される）を決定するOP50文化のOD 600を測定する。適切な希釈液は吸光度の正確な測定のために必要になる場合があります。
- 20分1,500 gで遠心分離によってペレットOP50細菌。
- 1 × 10 12 CFU / mLの濃度にバクテリアを再懸濁します。
- 6つの異なる濃度で10 mLの細菌の培養を準備：1 × 10 12、10 11、10 10、10 9、10 8、10 7 CFU / mLの。
- 60mmの中央に細菌の培養のピペット0.2mLのは、NGMプレートを固めた。表面に打痕が寒天プレートに穴にワームを許可するように、ピペットチップとプレートの表面に触れないようにしてください。
- 1時間37℃のインキュベータ内の場所のプレート。
- 細菌の増殖を阻止するために、各プレートに100mg/mLカルベニシリン及び50mg/mLのカナマイシン10μLの10μLを適用します。
- 4の抗生物質 - 死菌の異なる濃度° C今後の使用のために（最大1ヶ月）。と店舗プレート少なくとも1〜2日後に控えて全体の計画的な実験のための十分なプレートを準備して格納することが重要です。全体の実験のための板の同じバッチを使用することが望ましい。
- 細菌の生存性を確認するには、SDRのプレートのいくつかの細菌をこすり取ってカルベニシリンおよびカナマイシンによる空のNGMプレート上に広げる。 6-8時間、37℃のインキュベーターでプレートを配置し、細菌の増殖（ない細菌の増殖が観察されないはず）を確認してください。
ソリューション
| 線虫の増殖培地（NGM）、1L： | |
| 3グラム | NaClの |
| 2.5グラム | バクトペプトン |
| 20グラム | 寒天 |
| 1 mLの | 1 M MgSO 4を |
| 1 mLの | 1 M CaCl 2を |
| 1 mLの | 5 mg / mLのコレステロール |
| 25 mLの | 1Mリン酸カリウム、pH6.0の |
すぐに10mLのアリコートで60ミリメートル× 15ミリメートルのペトリ皿に水などの液体NGMを注ぐ
3。 SDRの実験のセットアップ
このような寿命の解析と出生率のプロファイリングとして、SDRに関連する研究、のほとんどは、ワームの年齢同期人口の準備が不可欠です。他の研究では、単に食事制限を開始するために、SDRの板に定期的なOP50プレートからワームを転送する。このセクションでは、SDRの動物のために寿命の解析を設定するプロトコルを例として説明されています。
- OP50でいくつかの定期的なNGMプレート上に20〜30生殖アクティブな大人を転送するためにプラチナのワームピッカーを使用してください。実験に必要な卵の数に応じて、より多くの大人が必要になることがあります。
- 20℃でプレートを残す℃で4時間は、産卵を可能にする。
- プレートから成人を取り外します。プレートを視覚的に卵のために点検してください。
- 20℃でプレートを残し° Cと子孫がLate-L4/day大人1名のステージに発展することができます。通常、これは20℃N2野生型のワームのために3日かかる℃に
- 食事制限を開始するSDRのプレートに1日成人の適切な数を転送する。
- 寿命の分析については、各SDR条件のプレート当たり10から20までのワームで6〜8枚の合計を設定します。
- すべてのワームが死亡するまで2日ごとにそれぞれのワームの実行可能性を得点する。それは、ワームは、食品の完全な剥奪を避けるために、すべての12から48時間新鮮なSDRの板に転送することが重要です。
4。代表的な結果：
図1に示すようにOD 600との関係でOP50濃度の推定のための代表的な検量線のプロットである。ライナーの回帰分析によって生成された方程式は、OP50細菌濃度の将来のすべての計算に使用することができます。図2に示すように、別のワームの株の平均寿命に慢性SDRの治療の効果を測定することの例です。青いラインは、SDRに野生型ワームの通常の用量依存性の応答を表します。 DAF - 16（mu86）は SDR -誘導寿命の延長には何の影響もないまま、赤いラインは、SDRの寿命の効果が部分的にDRR - 2 OEによって抑制されていることを示します。 Cで寿命の解析を行うための詳細の方法虫は 1-3以前の文献に記載されている。
図1 E.の推定のための検量線の代表結果大腸菌 OP50濃度。 OP50濃度は、測定OD 600値の関数としてプロットされます。エラーバー= SD泊細菌の培養は、cfuの測定前に1,000 ×倍の吸光度測定の前に8倍、16倍、32倍、1.5倍2倍、4倍希釈し、そしてさらに希釈した。
図2：C.の代表結果虫の寿命実験では、SDRへの応答の異なる2つの変異体（緑と赤）（チンらから図4）と野生型のN2の動物（青）を比較。エラーバーは= SEM
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Discussion
食事制限（DR）が寿命を増やすおよび5-7哺乳類を含む種の広い範囲で様々な加齢に伴う病気の発症を遅らせることが知られている。両方の環境と遺伝子操作は、CのモデルDRに使用されている半定義された液体培地8,9、液体培地10-12で細菌の食物源の希釈、およびより遅い速度13で送り、その動作の変異体の使用で培養型ワームなど、 エレガンス、。液体培地で培養するワームはほとんどのワームの研究室で適合した固体培地プレートの条件とは異なる成長条件を伴うのに対し、しかし、DRの遺伝的模倣は、DRに関係のない表現型を生成することがあります。標準的な固体プレート上で実行されたDRのプロトコルが有用になるため、4,14,15、いくつかのグループによって開発されました。
ここで記述されたプロトコルでは、細菌は食物摂取のレベルを制御する方法として、プレートに二つの異なる抗生物質を適用することによって殺される。しかし、このようなUVの暴露のような代替方法は、細菌の増殖を抑制するために使用することができます。
SDRの実験の過程で食品の完全な剥奪（すなわち飢餓）を避けるために、ワームは、ステップ3.7で上記のようにすべての12から48時間新鮮なSDRの板に転送する必要があります。転送の頻度は、食品の濃度、プレート当たりワームの数、および実験で使用されているワームの株により産生さ子孫の量に依存します。例えば、ワームが48時間ごとに20無菌CF512を転送することができる[（B26）- 15 FER、FEM - 1（hc17）]動物は1 × 10 7 CFU / mLのOP50細菌が含まれているSDRのプレート上に配置された。転送の頻度は前の細菌の播種は、完全に実験条件の下でワームによって消費される前に、SDRのプレートが続く可能性がどのくらい実験、に、確認して判断されるべきである。実験を行うときは、非滅菌ひずみ、50μg/mlFUDRと最後の数週間（例えば寿命の解析）は産卵を排除する3.5ステップの前にプレートをSDRに追加される可能性があること。それ以外の場合、ワームは、はるかに頻繁に彼らの子孫のために食品の完全な枯渇を避けるために、新鮮なプレートに転送する必要があります。
SDRの実験ではプレートごとに配置できるワームの数に設定された制限はありませんが、プレートあたり20以上の動物を配置すると、SDRの治療後の寿命解析のための実行可能性をスコアリングの難しさを引き起こす可能性があります。また、SDRは、成人の1日目には早くも開始することができることは注目に値します。しかし、初期の幼虫期におけるSDRの開始は、特定の状況で発育停止を引き起こす可能性があります。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、A. - LHへネイサンショックセンター（P30 AG13283）と国立老化研究所（NIA）からR01助成金（R01 AG028516）からのパイロット賞によってサポートされていました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbenicillin | Duchefa Biochemie | C0109.25 | Dissolved in water. |
| Kanamycin | Roche Group | 10106801001 | Dissolved in water. |
| Bacto-peptone | BD Biosciences | DF0118072 | |
| Bacto-tryptone | BD Biosciences | DF0123075 | |
| Bacto-yeast extract | BD Biosciences | DF0127071 | |
| Agar | BD Biosciences | DF00145170 | |
| Sterile culture tube | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| Spectrophotometer | Amersham | Gene Quant pro | Amersham is now part of GE Healthcare. |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Stemi 2000 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Accuspin FR |
References
- Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300, 1142-1145 (2003).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366, 461-464 (1993).
- Apfeld, J., Kenyon, C. Regulation of lifespan by sensory perception in Caenorhabditis elegans. Nature. 402, 804-809 (1999).
- Ching, T. T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. L. drr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Aging Cell. 9, 545-557 (2010).
- Weindruch, R., Walford, R. The Retardation of Aging and Disease by Dietary Restriction. , Thomas. (1988).
- Masoro, E. J. Subfield history: caloric restriction, slowing aging, and extending life. Sci Aging Knowledge Environ. , RE2-RE2 (2003).
- Masoro, E. J. Overview of caloric restriction and ageing. Mech Ageing Dev. 126, 913-922 (2005).
- Houthoofd, K. Axenic growth up-regulates mass-specific metabolic rate, stress resistance, and extends life span in Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol. 37, 1371-1378 (2002).
- Houthoofd, K. No reduction of metabolic rate in food restricted Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol. 37, 1359-1369 (2002).
- Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).
- Bishop, N. A., Guarente, L. Two neurons mediate diet-restriction-induced longevity in C. elegans. Nature. 447, 545-549 (2007).
- Panowski, S. H., Wolff, S., Aguilaniu, H., Durieux, J., Dillin, A. PHA-4/Foxa mediates diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Nature. 447, 550-555 (2007).
- Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13091-13096 (1998).
- Kaeberlein, T. L. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food. Aging Cell. 5, 487-494 (2006).
- Greer, E. L. An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in C. elegans. Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).
