Summary
Aquí se presenta un protocolo para la realización de placa sólida basada en la restricción dietética en
Abstract
Reducción de la ingesta de alimentos sin desnutrición o inanición se sabe que aumenta la vida útil y retrasar la aparición de diversas enfermedades relacionadas con la edad en una amplia gama de especies, incluyendo mamíferos. También provoca una disminución en el peso corporal y la fertilidad, así como niveles más bajos de glucosa en plasma, la insulina y el IGF-1 en estos animales. Este tratamiento se refiere a menudo como la restricción dietética (DR) o la restricción calórica (CR). El nematodo Caenorhabditis elegans se ha convertido en un importante organismo modelo para estudiar la biología del envejecimiento. Manipulaciones ambientales y genéticos se han utilizado para el modelo DR y han demostrado prolongar la vida de C. elegans. Sin embargo, muchos de los estudios reportados en la República Dominicana C. elegans se realizaron mediante la propagación de los animales en un medio líquido, mientras que la mayoría de los estudios de genética en el campo del envejecimiento se realiza en el estándar de agar sólido en placas de Petri. Aquí se presenta un protocolo estándar de DR con NGM agar sólido basado en la placa con bacterias muertas.
Protocol
1. El establecimiento de una curva de calibración para la estimación de las concentraciones de bacterias
En esta sección se describe un método para la estimación de la concentración de bacterias de cualquier cepa determinada bacteria (por ejemplo, OP50, HT115) que se utilizará como fuente de alimento para los experimentos de restricción dietética en C. elegans. Las curvas de calibración independientes deben ser establecidos para cada cepa de la bacteria utilizada.
- Inocular una colonia de E. coli OP50 bacterias seleccionar de una racha fresca de bacterias en agar LB en 3 ml de caldo LB líquido.
- Lugar OP50 cultura en 37 ° C agitador y permitir que las bacterias crecen durante la noche.
- Prepare serie 2 diluciones de la suspensión bacteriana de la cultura durante la noche (2x, 4x, 8x, 16x, 32x).
- Medir la absorbancia (densidad óptica) de cada dilución a 600 nm por espectrofotometría por triplicado.
- Volver a diluir cada suspensión bacteriana 1.000.000 veces (1000 veces la dilución en dos ocasiones).
- Propagación 0,4 ml de suspensión bacteriana de cada dilución de manera uniforme sobre una placa de agar LB 100 mm.
- Colocar placas de LB con OP50 en una incubadora a 37 ° C durante 18-24 horas.
- Cuente el número de colonias de bacterias cultivadas en cada plato. El recuento de colonias se usan para calcular UFC (unidades formadoras de colonias) por ml para cada muestra.
- La relación entre la medida OD 600 valores y OP50 concentraciones de bacterias puede ser establecida por el trazado de OD 600 en función de la concentración de bacterias (ufc / ml) y se realiza un análisis de regresión lineal (Figura 1).
Soluciones:
| Caldo Luria (LB), 1 litro: | |
| 10 g | Bacto-triptona |
| 5 g | Extracto de levadura |
| 10 g | NaCl |
Añadir agua desionizada a 1L.
Autoclave y almacenar a temperatura ambiente.
2. Preparación de la placa sólida basada en la dieta de restricción de giro (DEG), las placas
En esta sección se describe la preparación de platos para su uso en base placa sólida-la dieta de restricción de giro (DEG) los experimentos. Normalmente, se considera una concentración de bacterias de 1 x 10 11 UFC / mL como la condición de la alimentación ad libitum y 1 x 10 8 UFC / mL como la condición de una alimentación óptima DR para este método. Sin embargo, las concentraciones de 4-6 diferentes bacterias pueden ser necesarios para establecer una completa relación dosis-dependiente de DEG y sus respuestas.
- Inocular una colonia de E. Coli OP50 bacterias en 3 ml de caldo LB líquido.
- Lugar de la cultura OP50 en 37 ° C agitador y permitir que las bacterias crezcan durante 6-8 horas.
- La transferencia de la cultura OP50 a un nuevo frasco contiene 500 ml de caldo de LB, y el lugar de la cultura OP50 de vuelta en 37 º C durante la noche coctelera.
- Mida el diámetro exterior de 600 de la cultura OP50 para determinar la concentración de bacterias (la concentración se calcula utilizando la curva de calibración generada en la parte 1). Diluciones adecuadas puede ser necesario para una medición precisa de la absorción.
- Pellet OP50 bacterias por centrifugación a 1.500 g durante 20 minutos.
- Volver a suspender las bacterias a una concentración de 1 x 10 12 UFC / ml.
- Preparar 10 mL cultivo de bacterias en seis diferentes concentraciones: 1 x 10 12, 10 11, 10 10, 10 9, 10 8, 10 7 ufc / ml.
- Pipetear 0,2 ml de cultivo de bacterias en el centro de una placa de 60 mm solidificado NGM. Evite tocar la superficie de la placa con la punta de la pipeta, como rasguños en la superficie permite a los gusanos se introducen en las placas de agar.
- Coloque las placas en incubadora a 37 ° C durante 1 hora.
- Aplicar 10μL de 100mg/ml carbenicilina y 10 l de kanamicina 50mg/ml a cada placa para detener el crecimiento de las bacterias.
- Tienda placas con diferentes concentraciones de los antibióticos bacterias muertas a 4 ° C para su uso futuro (hasta un mes). Es importante preparar y almacenar las placas suficiente para que el experimento planeado todo por lo menos 1-2 días por venir. Utilizando el mismo lote de placas para los experimentos de todo es preferible.
- Para verificar la viabilidad de las bacterias, sacar algunas bacterias de las placas de DEG y la extendió sobre una placa de NGM vacío con carbenicilina y kanamicina. Colocar la placa en incubadora a 37 ° C durante 6-8 horas y luego verificar el crecimiento de las bacterias (no el crecimiento de bacterias debe ser observado).
Soluciones
| Nematodo de crecimiento de los medios (NGM), 1 litro: | |
| 3 g | NaCl |
| 2,5 g | Bacto-peptona |
| 20g | Agar |
| 1 mL | 1 M MgSO 4 |
| 1 mL | 1 M de CaCl2 |
| 1 mL | 5 mg / ml de colesterol |
| 25 ml | Fosfato de Potasio 1 M, pH 6,0 |
Inmediatamente vierta líquido en NGM 60 mm x 15 mm placas de Petri en alícuotas de 10 mL
3. La creación de experimentos DEG
Para la mayoría de los estudios relacionados con el DEG, como el análisis de duración de la vida y perfiles de la fertilidad, la preparación de una edad sincronizado población de gusanos es esencial. Para otros estudios, sólo la transferencia de los gusanos de una placa normal OP50 a una placa de DEG para iniciar la restricción dietética. En esta sección, un protocolo para establecer un análisis de ciclo de vida para los animales de DEG se describe como un ejemplo.
- Utilizar un selector de gusano de platino para la transferencia de 20 a 30 adultos reproductivamente activos en varias placas NGM regular con OP50. Dependiendo de la cantidad de huevos necesarios para los experimentos, los más adultos pueden ser necesarias.
- Dejar las placas a 20 ° C durante 4 horas para permitir la puesta de huevos.
- Retire los adultos de la placa. Las placas deben ser inspeccionados visualmente para los huevos.
- Dejar las placas a 20 ° C y permitir que la progenie de convertirse en la etapa adulta Late-L4/day 1. Por lo general, este es de 3 días para que los gusanos N2 tipos silvestres a 20 ° C.
- La transferencia de un número adecuado de adultos el día 1 en la placa de DEG para iniciar la restricción dietética.
- Para un análisis de ciclo de vida, creó un total de 6-8 con placas 10-20 gusanos por placa para cada condición de DEG.
- Puntuación de la viabilidad de cada gusano cada 2 días hasta que todos los gusanos han muerto. Es fundamental que los gusanos se transfirieron a placas de DEG fresca cada 12-48 horas para evitar la privación completa de alimentos.
4. Los resultados representativos:
Se muestra en la Figura 1 es un gráfico de una curva de calibración representante para la estimación de la concentración OP50 en relación con OD 600. La ecuación generada por el análisis de línea de regresión puede utilizarse para todos los cálculos futuros de OP50 concentraciones de bacterias. Muestra en la Figura 2 es un ejemplo de la determinación del efecto de los tratamientos crónicos en DEG significa vida útil de las cepas de gusanos diferentes. La línea azul representa una normal dependiente de la dosis respuesta de tipo salvaje gusanos de DEG. La línea roja indica que el efecto de la vida útil de DEG es parcialmente suprimida por la RRD-2 oe, mientras que el daf-16 (mu86) no tiene ningún efecto sobre la SDR-inducida por prolongación de la vida. Información sobre métodos para realizar análisis de ciclo de vida de C. elegans se describe en la literatura previa 1-3.
Figura 1. Representante resultado de una curva de calibración para la estimación de la E. Coli OP50 concentración. OP50 concentración se representa como una función de medida OD 600 valores. Las barras de error = SD cultivo bacteriano noche a la mañana se diluyó 1.5x, 2x, 4x, 8x, 16x, 32x antes de la medición de absorbancia, y posteriormente diluido 1.000 x dos veces antes de la medición ufc.
Figura 2. Representante resultado de una C. elegans experimento esperanza de vida comparando los animales salvajes N2 tipo (azul) con dos diferentes mutantes (verde y rojo) en respuesta a los DEG (la figura de Ching et al. 4). Las barras de error = SEM
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Discussion
La restricción dietética (DR) se sabe que aumenta la vida útil y retrasar la aparición de diversas enfermedades relacionadas con la edad en una amplia gama de especies, incluyendo mamíferos 7.5. Manipulaciones ambientales y genéticos se han utilizado para el modelo DR en C. elegans, incluidos los gusanos de cultivo en un medio líquido semi-definido 8,9, la dilución de la fuente de alimento de bacterias en un medio líquido 10 a 12, y el uso de mutantes de comportamiento que se alimentan a un ritmo más lento 13. Sin embargo, imita genética de DR puede producir fenotipos que no tienen relación con República Dominicana, mientras que los gusanos de cultivo en un medio líquido implica condiciones de crecimiento que difieren de las condiciones de la placa de medio sólido adaptado por los laboratorios de la mayoría de los gusanos. Un protocolo estándar de DR realizadas en placas sólidas, sería útil y por lo tanto ha sido desarrollado por varios grupos de 4,14,15.
En el protocolo descrito aquí, las bacterias mueren a manos de la aplicación de dos antibióticos diferentes a las placas como una forma de controlar el nivel de ingesta de alimentos. Sin embargo, los métodos alternativos tales como la exposición UV también puede ser utilizado para inhibir el crecimiento de bacterias.
Para evitar la falta completa de alimentos (es decir, hambre), durante el curso de los experimentos de DEG, gusanos necesitan ser transferidos a las placas DEG fresca cada 12-48 horas como se mencionó anteriormente en el paso 3.7. La frecuencia de la transferencia depende de la concentración en el alimento, el número de gusanos por placa, y la cantidad de crías producidas por la cepa gusano utilizados en el experimento. Por ejemplo, las lombrices pueden ser transferidos cada 48 horas, cuando el 20 estéril CF512 [fer-15 (B26); fem-1 (hc17)] los animales fueron colocados en una placas que contienen DEG 1 x 10 7 ufc / ml OP50 bacterias. La frecuencia de la transferencia debe ser determinada por el examen, antes del experimento, el tiempo que las placas de DEG podría durar antes de que el cabeza de serie de bacterias es completamente consumido por gusanos en condiciones experimentales. Al llevar a cabo experimentos que duran varias semanas (por ejemplo, análisis de ciclo de vida) con una cepa no estériles, 50μg/ml FUDR se pueden añadir a los platos SDR antes de la etapa 3.5 para eliminar la puesta de huevos. De lo contrario, gusanos tienen que ser transferidos a nuevas placas con mucha más frecuencia para evitar el agotamiento total de los alimentos debido a su descendencia.
Si bien no hay límite en el número de gusanos que se pueden colocar por placa en un experimento de DEG, la colocación de más de 20 animales por cada placa puede causar dificultad en la puntuación de la viabilidad de un análisis de ciclo de vida después del tratamiento de DEG. También vale la pena señalar que SDR puede ser iniciado a partir del día 1 de la edad adulta. Sin embargo, el inicio de DEG en las primeras etapas larvales pueden causar un paro de desarrollo en ciertas circunstancias.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por un premio de piloto del Centro de choque Nathan (P30 AG13283) y una subvención R01 (R01 AG028516) del Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (NIA) para A.-LH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbenicillin | Duchefa Biochemie | C0109.25 | Dissolved in water. |
| Kanamycin | Roche Group | 10106801001 | Dissolved in water. |
| Bacto-peptone | BD Biosciences | DF0118072 | |
| Bacto-tryptone | BD Biosciences | DF0123075 | |
| Bacto-yeast extract | BD Biosciences | DF0127071 | |
| Agar | BD Biosciences | DF00145170 | |
| Sterile culture tube | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| Spectrophotometer | Amersham | Gene Quant pro | Amersham is now part of GE Healthcare. |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Stemi 2000 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Accuspin FR |
References
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