Summary
Burada plaka tabanlı katı diyet kısıtlaması yapmak için bir protokol mevcut
Abstract
Yetersiz beslenme veya açlık olmadan gıda alımının azaltılması, ömrünü uzatır ve memeliler dahil olmak üzere çeşitli türlerin geniş bir yelpazede, yaşa bağlı hastalıkları, başlangıcından gecikme bilinir. Aynı zamanda vücut ağırlığı ve doğurganlık azalması yanı sıra, plazma glukozu, insülin ve IGF-1, bu hayvanlarda düşük seviyelerde neden olur. Bu tedavi genellikle diyet kısıtlaması (DR) ya da kalori kısıtlaması (CR) olarak adlandırılır. Nematod Caenorhabditis elegans yaşlanma biyoloji eğitimi için önemli bir model organizma olarak ortaya çıkmıştır. Her ikisi de çevresel ve genetik manipülasyonlar modeli DR kullanılmış olan ve C. ömrünü uzatmaya göstermiştir elegans. Ancak, C. içinde bildirilen DR çalışmaları birçok elegans yaşlanma alanında genetik çalışmaların çoğu standart katı agar petri tabak yapıldı, sıvı ortamda hayvanların propaganda yapıldı. Burada öldürülmüş bakteri içeren standart katı NGM agar tabanlı plaka kullanarak DR protokol sunuyoruz.
Protocol
1. Bakteri konsantrasyonlarının tahmini için bir kalibrasyon eğrisinin oluşturulması
Bu bölümde, C. Diyet kısıtlama deneyler için bir besin kaynağı olarak kullanılır, herhangi bir bakteri suşu (örneğin OP50, HT115) bakteri konsantrasyonu tahmini için bir yöntem açıklanır . elegans. Ayrı kalibrasyon eğrileri bakteri suşu kullanılan her tesis edilmelidir.
- E. tek bir koloni İnokülasyon coli OP50 bakteri, 3 ml sıvı LB suyu LB agar bakteri taze bir çizgi aldı .
- 37 Yeri OP50 kültür ° C çalkalayıcı ve bakteri gecede büyümek için izin verir.
- (2x, 4x, 8x, 16x, 32x) gece kültüründen bakteri süspansiyon seri 2 kat dilüsyonları hazırlayın.
- Her seyreltme (optik yoğunluk) absorbansı 600 nm'de spektrofotometre tarafından üç nüsha olarak ölçün.
- Ayrıca her bakteriyel süspansiyon 1.000.000 kat (iki kez 1000 kat seyreltme) sulandırmak.
- 100 mm LB agar plaka üzerine eşit olarak her seyreltme bakteriyel süspansiyon 0.4 mL yayıldı.
- 18-24 saat boyunca 37 ° C inkübatör OP50 LB tabak yerleştirin.
- Her plaka üzerinde yetişen bakteri kolonilerinin sayısını sayın. Koloni sayımları, her bir örnek için mL başına cfu (koloni oluşturan birim) hesaplamak için kullanılır.
- Bakteriyel konsantrasyonu (kob / ml) bir fonksiyonu olarak OD 600 komplo ve lineer regresyon analizi (Şekil 1) performans ölçülen OD 600 değerleri ve OP50 bakteri konsantrasyonları arasındaki ilişki kurulabilir.
Çözümler:
| Luria Broth (LB), 1L: | |
| 10 g | Bacto-Tripton |
| 5 g | Maya Ekstraktı |
| 10 g | NaCl |
1L deiyonize su ekleyin.
Otoklav ve oda sıcaklığında saklayın.
2. Katı plaka tabanlı diyet kısıtlaması (SDR) plakalarının hazırlanması
Bu bölüm katı plaka dayalı diyet kısıtlaması (SDR) deneylerde kullanılmak için plakalar hazırlanması açıklamaktadır. Normalde, düşünün bir bakteri konsantrasyonu 1 x 10 11 kob / ml ad libitum besleme durumu ve 1 x bu yöntem için en uygun DR beslenme koşulu olarak 10 8 kob / ml. Ancak, 4-6 farklı bakteri konsantrasyonları SDR ve yanıtları için tam bir doz-bağımlı bir ilişki kurmak için gerekli olabilir.
- E. tek bir koloni İnokülasyon 3 ml sıvı LB suyu Coli OP50 bakteri.
- 37 ° C shaker'da OP50 kültür koyun ve 6-8 saat bakteriler büyümek için izin.
- 500 ml LB suyu içeren yeni bir balona OP50 kültür aktarım ve 37 ° C çalkalayıcı gecede geri OP50 kültürünü yerleştirmek.
- Bakteri konsantrasyonu (konsantrasyonu Bölüm 1 oluşturulan kalibrasyon eğrisi kullanılarak hesaplanmıştır) belirlemek için OP50 kültürü OD 600 ölçün. Uygun dilüsyonları absorbans doğru bir ölçüm için gerekli olabilir.
- 20 dakika 1500 g santrifüj Pelet OP50 bakteri.
- 1 x 10 12 kob / ml 'lik bir konsantrasyon bakteriler tekrar
- Altı farklı konsantrasyonlarda 10 ml bakteri kültürü hazırlayın: 1 x 10 12 10 11 10 10 10 9 10 8 10 7 kob / ml.
- Pipet 0,2 ml 60 mm merkezi haline bakteri kültürü NGM plaka pekiştirdi. Yüzeyde nickler agar plakları içine yuva solucanlar izin, pipet ile plaka yüzeyine dokunmaktan kaçının.
- 1 saat süreyle 37 ° C'lik inkübatöre yerleştirin plakalar.
- Bakterilerin büyüme tutuklamak için her plaka 100mg/mL carbenicillin ve 50mg/mL kanamisin 10 mcL 10μL uygulayın.
- Mağaza plakaları 4 farklı konsantrasyonlarda antibiyotik öldürülmüş bakteri ° C ileride kullanmak için (bir ay kadar). Tüm planlanan deney için önümüzdeki en az 1-2 gün yetecek kadar tabak hazırlamak ve saklamak için çok önemlidir. Aynı parti tüm deneyler için plakaların kullanılması tercih edilir.
- Bakterilerin canlılığını doğrulamak için, SDR plakaları bazı bakteri kazımak ve carbenicillin ve kanamisin boş bir NGM plaka üzerine yayıldı. 6-8 saat 37 ° C inkübatör plaka koyun ve daha sonra bakteri büyümesi için (hiç bakteri büyüme dikkat edilmelidir) kontrol edin.
Çözümler
| Nematodu Büyüme Medya (NGM), 1L: | |
| 3 g | NaCl |
| 2.5 g | Bacto-Peptonlu |
| 20g | Agar |
| 1 ml | 1 M MgSO 4 |
| 1 ml | 1 M CaCl 2 |
| 1 ml | 5 mg / ml Kolesterol |
| 25 ml | 1M potasyum fosfat, pH 6.0 |
10 ml alikotları hemen 60 mm x 15 mm petri kutularının üzerine sıvı NGM dökün
3. SDR deneyler ayarlama
Ömrü analizi ve doğurganlık profili, solucanlar yaş senkronize nüfus hazırlanması gibi SDR-ile ilgili çalışmalar, çoğu için çok önemlidir. Diğer çalışmalar için diyet kısıtlaması başlatmak için sadece bir SDR plaka düzenli bir OP50 plaka solucanlar aktarmak. Bu bölümde, SDR hayvanlar için bir ömür analizi kurmak için bir protokol, bir örnek olarak açıklanmıştır.
- OP50 birkaç düzenli NGM plakalar üzerine 20-30 üreme aktif yetişkin aktarmak için bir platin solucan toplayıcı kullanın. Deneyler için gerekli yumurta sayısına bağlı olarak, daha fazla yetişkin gerekli olabilir.
- 20 ° C'de 4 saat boyunca yumurtlama izin plakaları bırakın.
- Plaka yetişkin çıkarın. Tabaklar yumurta için görsel olarak kontrol edilmelidir.
- 20 plakaları bırakın ° C ve döl Late-L4/day 1 yetişkin aşamaya geliştirmeye olanak sağlar. Genellikle, bu 20 N2 vahşi türleri solucanlar için 3 gün sürer ° C
- Diyet kısıtlaması başlatmak için uygun bir gün 1 yetişkin SDR tabağa aktarın.
- Ömrü analizi için, plaka başına 10-20 solucanlar, her SDR durum için 6-8 plakalarının toplam kurdu.
- Tüm solucanların ölmüş kadar her 2 günde bir her solucanın canlılığı Puan. Solucanlar gıda yoksunluğu önlemek için her 12-48 saat taze SDR plakaları transfer olması kritik önem taşımaktadır.
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 1'de gösterildiği OD 600 ile ilgili OP50 konsantrasyon tahmini için temsili bir kalibrasyon eğrisi bir komplo. Liner regresyon analizi tarafından oluşturulan denklem OP50 bakteri konsantrasyonları gelecekteki tüm hesaplamalar için kullanılabilir. Şekil 2'de gösterildiği gibi farklı solucan suşlarının ortalama ömrü kronik SDR tedavilerin etkisi assaying bir örnektir. Mavi çizgi SDR yabani tip solucanlar normal bir doza bağımlı bir yanıt temsil eder. Daf-16 (mu86) SDR-indüklenen ömrünü uzatma üzerinde hiçbir etkisi sahipken kırmızı çizgi, SDR ömrü etkisi kısmen DRR-2 oe tarafından bastırılmış olduğunu gösterir. C. ömrü analiz gerçekleştirmek için Detay yöntemi elegans önceki edebiyat 1-3 açıklanmıştır.
Şekil 1 E. tahmini için bir kalibrasyon eğrisi Temsilcisi sonuç Coli OP50 konsantrasyon. OP50 konsantrasyonu ölçülen OD 600 değerlerinin bir fonksiyonu olarak çizilmiştir. Hata çubukları = 2x, 1.5x, 4x, 8x, 16x, 32x SD Gecelik bakteriyel kültür absorbans ölçümü önce sulandırılmış ve daha seyreltilmiş 1.000 x iki kez kob ölçümden önce oldu.
Şekil 2 C Temsilcisi sonucu elegans ömrü deneyi (Ching ve ark Şekil 4) SDR yanıt vahşi tip N2 hayvanlar (mavi) iki farklı mutantlar (yeşil ve kırmızı) ile karşılaştırarak. Hata çubukları = SEM
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diyet kısıtlaması (DR) ömrünü uzatır ve türlerin 5-7 memeliler dahil olmak üzere geniş bir yelpazede, çeşitli yaşa bağlı hastalıkların başlamasını geciktirmek için bilinir. Hem çevresel ve genetik manipülasyonlar C modeli DR kullanılmıştır elegans kültür solucanlar da dahil olmak üzere tanımlanmış yarı sıvı bir ortamda 8,9, 10-12 sıvı bir ortamda bakteri besin kaynağı seyreltme ve daha yavaş bir hızda 13 yaşında davranış mutantlar o linki kullanabilirsiniz. Ancak, genetik taklit DR, sıvı bir ortamda kültür solucanlar en solucan laboratuarlar tarafından uyarlanmış katı levha koşulları farklı büyüme koşulları içerir oysa DR ilgisiz fenotipleri neden olabilir. DR protokolü standart katı plakaları üzerinde yapılan bir faydalı olacağını ve bu nedenle 4,14,15 çeşitli gruplar tarafından geliştirilmiştir.
Protokol Burada anlatılan, bakteriler gıda alımının kontrol etmek için bir yol olarak plakalar için iki farklı antibiyotik uygulanarak öldürülür. Ancak, UV ışınlarına maruz kalma gibi alternatif yöntemler de bakteri üremesini inhibe etmek için kullanılır.
SDR deneyler sırasında gıda tam bir yoksunluk (yani açlık) önlemek için, solucanlar adım 3.7 'de yukarıda da belirtildiği gibi her 12-48 saat taze SDR plakaları transfer edilmesi gerekir. Transfer frekans, gıda konsantrasyon, plaka başına solucanlar sayısı ve deneyde kullanılan solucan suşu tarafından üretilen yavrular miktarına bağlıdır. Örneğin, solucanlar, her 48 saatte 20 steril CF512 transfer olabilir [(B26)-15 ferin; fem-1 (hc17)] hayvanlar 1 x 10 7 kob / ml OP50 bakteriler içeren bir SDR plakalar yerleştirildi . Transfer frekans önce SDR plakalar bakteriyel numaralı seribaşı tamamen deneysel koşullar altında solucanlar tarafından tüketilen önce ne kadar uzun sürebileceğini deney, incelenmesi, tespit edilmelidir. Steril olmayan bir suşu ile son birkaç hafta (örneğin, ömrü analizi), 50μg/ml FUDR yumurtlama ortadan kaldırmak için 3.5 adım önce SDR plakaları eklendi olabilir bu deneyler yaparken. Aksi takdirde, solucanlar, çok daha sık kendi çoluk nedeniyle gıda tükenmesi önlemek için taze plakaları aktarılacak olacaktır.
SDR tedaviyi takiben bir ömrü analizi için canlılığı puanlama güçlüğü, 20'den fazla hayvan plaka başına yerleştirerek, bir SDR deneyde plaka başına konabilir solucanlar sayısı üzerinde herhangi bir sınırı var iken neden olabilir. O SDR yetişkinliğin 1 gün erken olarak başlatılan olabilir de fazlalaştı. Ancak bazı durumlarda, erken larva aşamasında SDR başlatılması gelişimsel tutuklama neden olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, A.-LH Nathan Şok Merkezi (P30 AG13283) ve Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (NIA) R01 hibe (R01 AG028516) bir pilot ödül tarafından desteklenen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbenicillin | Duchefa Biochemie | C0109.25 | Dissolved in water. |
| Kanamycin | Roche Group | 10106801001 | Dissolved in water. |
| Bacto-peptone | BD Biosciences | DF0118072 | |
| Bacto-tryptone | BD Biosciences | DF0123075 | |
| Bacto-yeast extract | BD Biosciences | DF0127071 | |
| Agar | BD Biosciences | DF00145170 | |
| Sterile culture tube | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| Spectrophotometer | Amersham | Gene Quant pro | Amersham is now part of GE Healthcare. |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Stemi 2000 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Accuspin FR |
References
- Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300, 1142-1145 (2003).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366, 461-464 (1993).
- Apfeld, J., Kenyon, C. Regulation of lifespan by sensory perception in Caenorhabditis elegans. Nature. 402, 804-809 (1999).
- Ching, T. T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. L. drr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Aging Cell. 9, 545-557 (2010).
- Weindruch, R., Walford, R. The Retardation of Aging and Disease by Dietary Restriction. , Thomas. (1988).
- Masoro, E. J. Subfield history: caloric restriction, slowing aging, and extending life. Sci Aging Knowledge Environ. , RE2-RE2 (2003).
- Masoro, E. J. Overview of caloric restriction and ageing. Mech Ageing Dev. 126, 913-922 (2005).
- Houthoofd, K. Axenic growth up-regulates mass-specific metabolic rate, stress resistance, and extends life span in Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol. 37, 1371-1378 (2002).
- Houthoofd, K. No reduction of metabolic rate in food restricted Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol. 37, 1359-1369 (2002).
- Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).
- Bishop, N. A., Guarente, L. Two neurons mediate diet-restriction-induced longevity in C. elegans. Nature. 447, 545-549 (2007).
- Panowski, S. H., Wolff, S., Aguilaniu, H., Durieux, J., Dillin, A. PHA-4/Foxa mediates diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Nature. 447, 550-555 (2007).
- Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13091-13096 (1998).
- Kaeberlein, T. L. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food. Aging Cell. 5, 487-494 (2006).
- Greer, E. L. An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in C. elegans. Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).
