Summary
यहाँ हम में ठोस थाली आधारित आहार प्रतिबंध प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान
Abstract
भोजन का सेवन के कुपोषण या भुखमरी के बिना कटौती करने के लिए उम्र बढ़ाने के लिए और प्रजातियों में से एक विस्तृत श्रृंखला में विभिन्न उम्र से संबंधित बीमारियों स्तनधारियों सहित, की शुरुआत में देरी के लिए जाना जाता है. यह भी शरीर के वजन और प्रजनन क्षमता में कमी, और के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्लाज्मा ग्लूकोज, इंसुलिन, और इन जानवरों में IGF-1 के निचले स्तर का कारण बनता है. इस उपचार अक्सर आहार (डा.) प्रतिबंध या गरमी प्रतिबंध (सीआर) के रूप में जाना जाता है. निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस उम्र बढ़ने के जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल जीव के रूप में उभरा है. दोनों पर्यावरण और आनुवंशिक जोड़तोड़ मॉडल डॉ. करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और सी में उम्र बढ़ाने दिखाया एलिगेंस. हालांकि, सी. में रिपोर्ट डॉ अध्ययन का कई एलिगेंस तरल मीडिया में प्रचार पशुओं, जबकि उम्र बढ़ने के क्षेत्र में आनुवंशिक अध्ययन के सबसे पेट्री प्लेट में मानक ठोस अगर पर किया गया था द्वारा किया गया. यहाँ हम एक डॉ प्रोटोकॉल का उपयोग कर मानक मारे बैक्टीरिया के साथ ठोस एन जी एम थाली अगर आधारित उपस्थित थे.
Protocol
1. बैक्टीरिया सांद्रता के आकलन के लिए एक अंशांकन वक्र की स्थापना
यह खंड किसी भी बैक्टीरिया (OP50 जैसे, HT115) तनाव है कि सी. में आहार प्रतिबंध प्रयोगों के लिए एक खाद्य स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा बैक्टीरिया एकाग्रता के आकलन के लिए एक विधि का वर्णन एलिगेंस. अलग अंशांकन घटता तनाव इस्तेमाल किया प्रत्येक बैक्टीरिया के लिए स्थापित किया जाना चाहिए.
- ई. के एक एकल कॉलोनी टीका लगाना कोलाई OP50 बैक्टीरिया लेग अगर पर एक बैक्टीरिया के ताजा 3 एमएल तरल लेग शोरबा में लकीर से उठाया.
- प्लेस 37 में OP50 संस्कृति डिग्री सेल्सियस हिलनेवाला और बैक्टीरिया रातोंरात विकसित करने की अनुमति.
- रातोंरात संस्कृति से जीवाणु निलंबन के धारावाहिक दो गुना dilutions की तैयारी (2x, 4x, 8x, 16x, 32x).
- 600 एनएम तीन प्रतियों में स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा प्रत्येक कमजोर पड़ने के absorbance (ऑप्टिकल घनत्व) उपाय.
- इसके अलावा प्रत्येक जीवाणु निलंबन १०००००० गुना (1000 गुना कमजोर पड़ने दो बार) पतला.
- प्रत्येक कमजोर पड़ने के जीवाणु एक 100 मिमी लेग अगर प्लेट पर समान रूप से निलंबन के 0.4 एमएल बिखरा हुआ है.
- 18-24 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में OP50 साथ लेग प्लेटें प्लेस.
- बैक्टीरियल प्रत्येक प्लेट पर बड़े कालोनियों की संख्या गिनो. कॉलोनी गिनती के लिए प्रत्येक नमूना के लिए एमएल प्रति cfu (उपनिवेश बनाने इकाई) की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है.
- बैक्टीरियल एकाग्रता (cfu / एमएल) के एक समारोह के रूप में 600 आयुध डिपो की साजिश रचने और एक रेखीय प्रतीपगमन विश्लेषण (चित्रा 1) प्रदर्शन करके मापा आयुध डिपो 600 मूल्यों और OP50 बैक्टीरिया सांद्रता के बीच संबंध स्थापित किया जा सकता है है.
समाधान:
| Luria (पौंड) शोरबा, 1L: | |
| 10 छ | Bacto - tryptone |
| 5 छ | खमीर निकालें |
| 10 छ | NaCl |
1L विआयनीकृत जल जोड़ें.
आटोक्लेव और कमरे के तापमान पर दुकान.
2. ठोस आधारित प्लेट आहार प्रतिबंध प्लेट (एसडीआर) की तैयारी
इस अनुभाग में ठोस प्लेट आधारित आहार प्रतिबंध प्रयोगों (एसडीआर) में उपयोग के लिए प्लेटों की तैयारी का वर्णन करता है. आम तौर पर, हम समझते हैं एक बैक्टीरिया की एकाग्रता 1 x 10 cfu 11 / एमएल विज्ञापन libitum खिला हालत और 1 के रूप में x 10 इष्टतम डॉ खिला शर्त के रूप में इस विधि के लिए 8 cfu / एमएल. हालांकि, 4-6 अलग बैक्टीरिया सांद्रता एसडीआर और अपनी प्रतिक्रियाओं के लिए एक पूर्ण खुराक पर निर्भर संबंध स्थापित करने की जरूरत हो सकता है.
- ई. के एक एकल कॉलोनी टीका लगाना 3 एमएल तरल लेग शोरबा में OP50 बैक्टीरिया कोलाई.
- 37 ° सी प्रकार के बरतन में OP50 संस्कृति प्लेस और बैक्टीरिया को 6-8 घंटे के लिए विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं.
- एक नया 500 एमएल लेग शोरबा युक्त कुप्पी OP50 संस्कृति स्थानांतरण, और OP50 संस्कृति वापस 37 में डिग्री सेल्सियस हिलनेवाला रातोंरात जगह.
- OP50 संस्कृति के 600 आयुध डिपो उपाय बैक्टीरिया एकाग्रता (एकाग्रता अंशांकन भाग 1 में उत्पन्न वक्र का उपयोग कर की गणना की जाती है) निर्धारित है. उपयुक्त dilutions absorbance के एक सटीक माप के लिए आवश्यक हो सकता है.
- 20 मिनट के लिए 1,500 g पर गोली OP50 centrifugation द्वारा बैक्टीरिया.
- 1 एक्स 10 12 cfu / एमएल के एक एकाग्रता के लिए बैक्टीरिया Resuspend.
- छह अलग सांद्रता में 10 एमएल बैक्टीरिया संस्कृति की तैयारी: 1 x 12 10 10 11 10 10 10 9, 8 10, 7 10 cfu / एमएल .
- पिपेट एक 60 मिमी के केंद्र में 0.2 एमएल बैक्टीरिया संस्कृति के एन जी एम थाली बढ़ाया. विंदुक टिप के साथ थाली की सतह को छूने से बचें, के रूप में सतह पर nicks अगर प्लेटों में बिल करने के लिए कीड़े की अनुमति.
- 1 घंटे के लिए 37 ° सी इनक्यूबेटर में प्लेस प्लेटें.
- प्रत्येक जीवाणुओं के विकास को गिरफ्तार करने की थाली के लिए 100mg/mL carbenicillin और 50mg/mL kanamycin के 10 μL 10μL लागू करें.
- स्टोर प्लेटों के साथ 4 एंटीबायोटिक मारे जीवाणुओं की विभिन्न सांद्रता डिग्री सेल्सियस भविष्य के उपयोग के लिए (एक माह). यह महत्वपूर्ण है के लिए तैयार है और दुकान कम से कम 1-2 दिन पूरे योजना बनाई प्रयोग के लिए पर्याप्त प्लेटें आगे. पूरे प्रयोगों के लिए प्लेटों के एक ही बैच का उपयोग करना बेहतर है.
- जीवाणुओं की व्यवहार्यता की पुष्टि करने के लिए, कुछ बैक्टीरिया परिमार्जन एसडीआर प्लेटों की और यह carbenicillin और kanamycin के साथ एक खाली एन जी एम थाली पर फैल. 37 ° सी इनक्यूबेटर में 6-8 घंटे के लिए थाली प्लेस और तो जीवाणुओं के विकास के लिए जाँच (कोई बैक्टीरिया विकास मनाया जाना चाहिए).
समाधान
| निमेटोड ग्रोथ (एन जी एम) मीडिया, 1L: | |
| 3 जी | NaCl |
| 2.5 छ | Bacto - Peptone |
| 20g | अग्रवाल |
| 1 एमएल | 1 एम MgSO 4 |
| 1 एमएल | 1 एम 2 CaCl |
| 1 एमएल | 5 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल |
| 25 एमएल | 1M पोटेशियम फॉस्फेट, पीएच 6.0 |
तुरंत 60 x 15 मिमी पेट्री डिश मिमी पर 10 एमएल aliquots में तरल एन जी एम डालना
3. एसडीआर प्रयोगों की स्थापना
SDR-संबंधित अध्ययन, जैसे जीवन काल विश्लेषण और प्रजनन क्षमता की रूपरेखा, एक उम्र सिंक्रनाइज़ कीड़े की जनसंख्या की तैयारी के लिए सबसे जरूरी है. अन्य अध्ययनों के लिए, बस एक नियमित रूप से OP50 थाली से कीड़े एक एसडीआर थाली करने के लिए आहार प्रतिबंध आरंभ हस्तांतरण. इस अनुभाग में, एसडीआर जानवरों के लिए एक जीवन विश्लेषण सेट प्रोटोकॉल एक उदाहरण के रूप में वर्णित है.
- एक प्लैटिनम कीड़ा पिकर का उपयोग OP50 के साथ कई नियमित रूप से एन जी एम प्लेटों पर 20-30 reproductively सक्रिय वयस्कों हस्तांतरण. प्रयोगों के लिए आवश्यक अंडे की संख्या पर निर्भर करता है, और अधिक वयस्कों की जरूरत हो सकता है.
- पर 20 प्लेटें छोड़ दो डिग्री सेल्सियस 4 घंटे के लिए अनुमति देने के लिए अंडे बिछाने.
- थाली से वयस्कों निकालें. प्लेट्स नेत्रहीन अंडे के लिए निरीक्षण किया जाना चाहिए.
- 20 में प्लेटें छोड़ो ° सी और संतान Late-L4/day एक वयस्क चरण में विकसित करने की अनुमति. आमतौर पर, 3 दिन इस N2 जंगली प्रकार के कीड़े के लिए 20 ° लेता सी.
- एसडीआर थाली पर स्थानांतरण दिन 1 वयस्कों के एक उपयुक्त संख्या आहार प्रतिबंध आरंभ.
- एक उम्र के विश्लेषण के लिए, प्रत्येक एसडीआर हालत के लिए 10-20 प्लेट प्रति कीड़े के साथ 6-8 प्लेटों के कुल सेट.
- प्रत्येक कीड़ा की व्यवहार्यता कुल हर 2 दिन जब तक सभी कीड़े मर चुके हैं. यह महत्वपूर्ण है कि कीड़े ताजा एसडीआर प्लेटों के लिए हर 12-48 घंटे हस्तांतरित किया जा के लिए भोजन की पूरी अभाव से बचने है.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1 में दिखाया गया है 600 आयुध डिपो के संबंध में OP50 एकाग्रता के आकलन के लिए एक प्रतिनिधि अंशांकन वक्र की एक साजिश है . लाइनर प्रतिगमन विश्लेषण के द्वारा उत्पन्न समीकरण OP50 बैक्टीरिया सांद्रता के भविष्य की सभी गणना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 2 में दिखाया गया है अलग कीड़ा उपभेदों के मतलब उम्र को पुरानी एसडीआर उपचार के प्रभाव को परख करने की क्रिया का एक उदाहरण है. नीली रेखा जंगली प्रकार के कीड़े एसडीआर की एक सामान्य खुराक पर निर्भर प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है. लाल रेखा यह संकेत करता है कि एसडीआर की उम्र प्रभाव oe DRR-2 के द्वारा आंशिक रूप से दबा दिया है, जबकि 16-daf (mu86) एसडीआर प्रेरित उम्र विस्तार पर कोई प्रभाव नहीं है. सी. में उम्र विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए विस्तार विधि एलिगेंस पिछले 1-3 साहित्य में वर्णित है.
चित्रा 1 ई. के आकलन के लिए एक अंशांकन वक्र के प्रतिनिधि परिणाम. कोलि एकाग्रता OP50. OP50 एकाग्रता मापा आयुध डिपो 600 मानों के एक समारोह के रूप में प्लॉट किए जाते है. त्रुटि सलाखों = एसडी ओवरनाइट जीवाणु संस्कृति 1.5x, 2x, 4x, 8x, 16x, 32x absorbance के माप से पहले पतला था, और आगे पतला +१००० एक्स दो बार cfu माप से पहले.
चित्रा 2 एक सी. के प्रतिनिधि परिणाम. एलिगेंस उम्र प्रयोग एसडीआर के जवाब में दो अलग अलग म्यूटेंट (हरे और लाल) के साथ जंगली प्रकार N2 जानवरों (नीला) (चिंग एट अल से चित्रा 4.) की तुलना . त्रुटि सलाखों = SEM
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Discussion
आहार प्रतिबंध (डॉ) करने के लिए उम्र बढ़ाने के लिए और प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला 5-7 स्तनधारियों सहित विभिन्न उम्र से संबंधित बीमारियों की शुरुआत में देरी के लिए जाना जाता है. दोनों पर्यावरण और आनुवंशिक जोड़तोड़ मॉडल डॉ. सी. में इस्तेमाल किया गया है एलिगेंस, एक अर्द्ध परिभाषित तरल 8,9 मध्यम, तरल मध्यम 10-12 में बैक्टीरिया खाद्य स्रोत के कमजोर पड़ने, और एक धीमी दर 13 पर व्यवहार फ़ीड कि म्यूटेंट के उपयोग में कीड़े संवर्धन सहित. हालांकि, डॉ की आनुवंशिक mimics phenotypes कि डॉ. करने के लिए असंबंधित हैं उत्पादन, जबकि एक तरल माध्यम में संवर्धन कीड़े विकास की स्थिति है कि ठोस मध्यम थाली सबसे कीड़ा प्रयोगशालाओं द्वारा अनुकूलित स्थितियों से अलग शामिल हो सकता है. एक डॉ मानक ठोस प्लेटों पर प्रदर्शन प्रोटोकॉल उपयोगी हो सकता है और इसलिए कई 4,14,15 समूहों द्वारा विकसित किया गया है.
में प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित है, बैक्टीरिया प्लेटों के लिए भोजन का सेवन के स्तर को नियंत्रित करने के लिए एक रास्ते के रूप में दो अलग एंटीबायोटिक्स लागू करने के द्वारा मारे गए हैं. हालांकि, यूवी जोखिम के रूप में वैकल्पिक तरीकों को भी बैक्टीरिया विकास को बाधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
एसडीआर प्रयोगों के दौरान भोजन का पूरा अभाव (यानी भुखमरी) से बचने के लिए, कीड़े ताजा एसडीआर प्लेटों के लिए हर 12-48 घंटे हस्तांतरित किया जा के रूप में 3.7 चरण में उपर्युक्त की जरूरत है. हस्तांतरण की आवृत्ति भोजन, एकाग्रता, प्लेट प्रति कीड़े की संख्या, और कीड़ा प्रयोग में इस्तेमाल किया तनाव द्वारा उत्पादित वंश की राशि पर निर्भर करता है. उदाहरण के लिए, कीड़े हर 48 20 जब बाँझ CF512 घंटे हस्तांतरित किया जा सकता है [(b26) 15 fer, fem 1 (hc17)] जानवरों एसडीआर 1 एक्स 10 / 7 cfu एमएल OP50 बैक्टीरिया युक्त प्लेटों पर रखा गया है . हस्तांतरण की आवृत्ति पहले प्रयोग, एसडीआर प्लेटें बैक्टीरियल वरीयता प्राप्त पूरी तरह से प्रयोगात्मक शर्तों के अधीन कीड़े द्वारा खपत है से पहले कितनी देर तक पिछले सकता है की जांच, द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए. प्रयोगों है कि एक गैर बाँझ तनाव के साथ पिछले कई सप्ताह (जैसे उम्र विश्लेषण), 50μg/ml FUDR एसडीआर प्लेटें जोड़ा जा सकता है पहले से 3.5 कदम अंडे बिछाने समाप्त प्रदर्शन. अन्यथा, कीड़े ताजा प्लेटों को स्थानांतरित किया जा अधिक बार उनके वंश के कारण भोजन की पूरी रिक्तीकरण से बचने के लिए होगा.
जबकि वहाँ कीड़े कि प्लेट प्रति एक एसडीआर प्रयोग में रखा जा सकता है, थाली के अनुसार 20 से अधिक पशुओं को रखने की संख्या पर कोई निर्धारित सीमा है एसडीआर उपचार के बाद एक उम्र के विश्लेषण के लिए व्यवहार्यता स्कोरिंग में कठिनाई का कारण हो सकता है. यह भी टिप्पण लायक है कि एसडीआर वयस्कता के 1 दिन के रूप में जल्दी के रूप में शुरू किया जा सकता है. हालांकि, एसडीआर की जल्दी लार्वा चरणों में दीक्षा कुछ निश्चित परिस्थितियों में विकास की गिरफ्तारी का कारण हो सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम नातान शॉक केंद्र (AG13283 p30) और एजिंग पर राष्ट्रीय संस्थान (एनआईए) से एक R01 अनुदान (AG028516 R01) से एक पायलट ए - LH पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbenicillin | Duchefa Biochemie | C0109.25 | Dissolved in water. |
| Kanamycin | Roche Group | 10106801001 | Dissolved in water. |
| Bacto-peptone | BD Biosciences | DF0118072 | |
| Bacto-tryptone | BD Biosciences | DF0123075 | |
| Bacto-yeast extract | BD Biosciences | DF0127071 | |
| Agar | BD Biosciences | DF00145170 | |
| Sterile culture tube | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| Spectrophotometer | Amersham | Gene Quant pro | Amersham is now part of GE Healthcare. |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Stemi 2000 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Accuspin FR |
References
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