Summary
Здесь мы приводим протокол для проведения твердой пластиной, основанных на пищевых ограничений в
Abstract
Сокращение потребления пищи без недоедания или голода как известно, увеличивает продолжительность жизни и замедления наступления различных возрастных заболеваний в широком диапазоне видов, в том числе млекопитающих. Это также приводит к снижению массы тела и плодородия, а также более низкие уровни глюкозы в плазме крови, инсулина и IGF-1 у этих животных. Это лечение часто упоминается как диетические ограничения (DR) или ограничение калорийности (CR). Элеганс нематоды Caenorhabditis стала важным организма модель для изучения биологии старения. Оба экологические и генетические манипуляции были использованы для модели DR и показали продлить продолжительность жизни C. Элеганс. Однако многие из сообщили DR исследования в С. Элеганс было сделано путем распространения животных в жидких средах, в то время как большая часть генетических исследований старения поле были сделаны на стандартных твердых агара в чашках Петри. Здесь мы приводим протокол DR с использованием стандартных твердых NGM агар основе пластины с убитых бактерий.
Protocol
1. Создание калибровочной кривой для оценки концентрации бактерий
В этом разделе описывается метод оценки концентрации бактерий для любого данного штамма бактерий (например, OP50, HT115), который будет использоваться в качестве источника пищи для экспериментов Диетические ограничения на языке C. Элеганс. Отдельные калибровочные кривые должны быть установлены для каждого штамма бактерий используется.
- Привить единственная колония E. кишечной бактерии OP50 выбрать из свежих полоса бактерий на LB агар в 3 мл жидкого бульона LB.
- Место OP50 культуры в 37 ° C шейкере и позволяют бактериям расти быстро.
- Подготовка серийного 2-кратный разведения бактериальной суспензии из ночной культуры (2x, 4x, 8x, 16x, 32x).
- Измерить абсорбцию (оптической плотности) каждого разведения при 600 нм на спектрофотометре в трех экземплярах.
- Далее разбавленный каждой бактериальной суспензии 1000000 раз (1000-кратного разбавления дважды).
- Распространение 0,4 мл бактериальной суспензии каждого разведения ровно на 100 мм пластины агара LB.
- Место LB пластины с OP50 в 37 ° C инкубаторе в течение 18-24 часов.
- Подсчитайте количество бактериальных колоний, выросших на каждой пластине. Колония насчитывает используются для расчета КОЕ (колониеобразующих единица) на мл для каждого образца.
- Соотношение полученных OD 600 ценности и OP50 бактерий концентрации могут быть созданы путем построения OD 600 в зависимости от концентрации бактерий (КОЕ / мл) и выполняя анализ линейной регрессии (рис. 1).
Решения:
| Отвар Лурия (LB), 1л: | |
| 10 г | Бакто-триптон |
| 5 г | Дрожжевой экстракт |
| 10 г | NaCl |
Добавить деионизированной воды 1л.
Автоклавы и хранить при комнатной температуре.
2. Подготовка твердой пластиной, основанных на пищевых ограничений (SDR) пластин
В этом разделе описывается подготовка пластин для использования в твердой пластиной основанных на пищевых ограничений (СДР) экспериментов. Как правило, мы считаем, бактерий концентрации 1 х 10 11 КОЕ / мл, как вволю кормления состоянии и 1 х 10 8 КОЕ / мл в качестве оптимального кормления DR условием для этого метода. Тем не менее, 4-6 различных концентраций бактерий могут быть необходимы для создания полной зависимости от дозы отношений для SDR и его ответы.
- Привить единственная колония E. Coli OP50 бактерий в 3 мл бульона LB жидкости.
- Место OP50 культуры в 37 ° C шейкере и позволяют бактериям расти в течение 6-8 часов.
- Передача OP50 культуру новых колбу, содержащую 500 мл LB бульоне, и место OP50 культуры еще в 37 ° C шейкер в одночасье.
- Измерить диаметр 600 из OP50 культуры для определения бактерий концентрации (концентрации рассчитывается по калибровочной кривой, генерируемых в часть 1). Соответствующие разведения могут быть необходимы для точного измерения оптической плотности.
- Гранул OP50 бактерий центрифугированием при 1500 г в течение 20 минут.
- Ресуспендируют бактерий к концентрации 1 х 10 12 КОЕ / мл.
- Подготовка 10 мл культуры бактерий в шести различных концентраций: 1 х 10 12, 10 11, 10 10, 10 9, 10 8, 10 7 КОЕ / мл.
- Пипетка 0,2 мл культуры бактерий в центре 60 мм затвердевших NGM пластины. Не прикасайтесь к поверхности пластины с пипетки, а ники на поверхности позволяют червей зарываются в агар пластин.
- Место плит в 37 ° C инкубаторе в течение 1 часа.
- Применяют 10 мкл из 100мг/мл карбенициллин и 10 мкл 50мг/мл канамицин для каждой пластины для ареста рост бактерий.
- Магазин пластины с различными концентрациями антибиотиков убитых бактерий при температуре 4 ° C для дальнейшего использования (до одного месяца). Важно подготовить и хранить достаточно пластин для всего планируемого эксперимента, по крайней мере 1-2 дней вперед. Используя ту же партию пластин в течение всего эксперимента является предпочтительным.
- Чтобы проверить жизнеспособность бактерий, очистить некоторые бактерии из SDR тарелки и разложил ее на пустую тарелку NGM с карбенициллин и канамицина. Место пластины в 37 ° C инкубаторе в течение 6-8 часов, а затем проверить для роста бактерий (нет роста бактерий должны быть соблюдены).
Решения
| Нематоды Рост Медиа (НГО), 1л: | |
| 3 г | NaCl |
| 2,5 г | Бакто-пептон |
| 20г | Агар |
| 1 мл | 1 М MgSO 4 |
| 1 мл | 1 М CaCl 2 |
| 1 мл | 5 мг / мл Холестерин |
| 25 мл | 1М фосфата калия, рН 6,0 |
Сразу же вылить жидкость NGM на 60 мм х 15 мм чашки Петри в 10 мл аликвоты
3. Настройка SDR экспериментов
На протяжении большей части SDR-соответствующих исследований, таких как жизнь анализ диапазона и плодородия профилирования, подготовка возрастных синхронизированы населения червей имеет важное значение. Для других исследованиях, просто перенести червей регулярные OP50 пластины пластины SDR инициировать диетических ограничений. В этом разделе, протокол о создании анализ продолжительности жизни для животных СПЗ описывается как пример.
- Использование выбора платинового червь для передачи 20-30 репродуктивно активных взрослых на несколько регулярных пластин NGM с OP50. В зависимости от числа яиц, необходимых для экспериментов, более взрослые могут быть необходимы.
- Оставьте пластин при 20 ° С в течение 4 часов, чтобы позволить откладки яиц.
- Удалить взрослых от пластинки. Плиты должны быть визуально проверены на яйца.
- Оставьте пластин при 20 ° С и позволяют потомства, чтобы развиться в Late-L4/day 1 взрослый этап. Обычно это занимает 3 дня для N2 диких червей типа при температуре 20 ° C.
- Передача подходящее число 1-й день взрослым на пластине SDR инициировать диетических ограничений.
- Для анализа продолжительности жизни, создать в общей сложности 6-8 пластин с 10-20 червей на пластине для каждого условия SDR.
- Оценка жизнеспособности каждого червя каждые 2 дня, пока все черви умерли. Очень важно, что черви быть переданы на свежий пластин SDR каждые 12-48 часов, чтобы избежать полного лишения пищи.
4. Представитель Результаты:
Показанный на рисунке 1 представлена зависимость кривой представитель калибровки для оценки OP50 концентрации по отношению к OD 600. Уравнение порожденных лайнер регрессионного анализа могут использоваться для всех будущих расчетов OP50 бактерий концентрации. Показанный на рисунке 2 является примером опробование эффект хронического лечения SDR на среднюю продолжительность жизни различных штаммов червя. Синяя линия представляет нормальную дозозависимый ответ дикого типа червей SDR. Красная линия показывает, что влияние продолжительности жизни SDR частично подавлены СРБ-2 э, в то время как DAF-16 (mu86) не оказывает влияния на SDR-индуцированной расширение жизни. Подробности метода для проведения анализа в продолжительности жизни C. Элеганс описана в предыдущей литературе 1-3.
Рисунок 1. Представителю результате калибровочной кривой для оценки Е. Coli OP50 концентрации. OP50 концентрации строится в зависимости от измеряемой величины OD 600. Планки погрешностей = SD Ночь бактериальной культуры разбавляли 1.5x, 2x, 4x, 8x, 16x, 32x до измерения абсорбции, а затем разводят 1000 х дважды, прежде чем измерение КОЕ.
Рисунок 2. Представителю результате C. Элеганс жизни эксперимент сравнения дикого типа N2 животных (синий) с двумя различными мутантами (зеленый и красный) в ответ на SDR (Рисунок из Цзин и соавт. 4). Планки погрешностей = SEM
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Диетические ограничения (DR), как известно, увеличивает продолжительность жизни и замедления наступления различных возрастных заболеваний в широком диапазоне видов, включая млекопитающих, 5-7. Оба экологические и генетические манипуляции были использованы для модели DR на C. Элеганс, в том числе культивирование червей в полу-определены жидкой среде 8,9, размывание бактериальных источников пищи в жидкую среду 10-12, а также использование поведении мутантов, которые питаются более медленными темпами, 13. Тем не менее, генетические имитирует ДР может привести к фенотипы, которые не связаны в ДР, а культивирование червей в жидкой среде, включает в себя условия роста, которые отличаются от твердой среде условия пластины адаптированы большинстве лабораторий червя. Протокол DR, проведенных на стандартных твердых пластин бы полезно, и поэтому был разработан несколько групп 4,14,15.
В протокол, описанный здесь, бактерии погибают при применении двух различных антибиотиков для пластин, как способ контроля уровня от приема пищи. Тем не менее, альтернативные методы, такие как ультрафиолетовое облучение также может быть использован для подавления роста бактерий.
Чтобы избежать полного лишение пищи (например, голод), в ходе экспериментов SDR, червей необходимо перенести на свежий пластин SDR каждые 12-48 часов, как указано выше в пункте 3.7. Частота передачи зависит от концентрации пищи, количество червей на пластину, и количество потомства червем штамм, используемый в эксперименте. Например, черви могут быть переданы через каждые 48 часов, когда 20 стерильных CF512 [фер-15 (B26), ПЭМ-1 (hc17)] животные были помещены на SDR пластины, содержащей 1 х 10 7 КОЕ / мл OP50 бактерий. Частота передачи должна определяться путем изучения, до эксперимента, как долго SDR пластин может продолжаться до посеяны бактериальных полностью потребляются червей в экспериментальных условиях. При проведении экспериментов, которые последние несколько недель (например, срок службы анализа) с нестерильных напряжения, 50μg/ml ФУДР могут быть добавлены к SDR пластины до 3,5 шаг для устранения откладки яиц. В противном случае, черви должны быть переданы на свежий пластин гораздо чаще, чтобы избежать полного истощения продовольствия из-за их потомства.
Хотя не существует определенный лимит на количество червей, которые могут быть помещены на пластины в эксперименте SDR, размещение более 20 животных на пластине может вызвать трудности в выигрыше жизнеспособность анализ продолжительности жизни после SDR лечения. Стоит также отметить, что SDR может быть начато уже в 1-й день совершеннолетия. Тем не менее, начало SDR на ранних личиночных стадиях развития, может стать причиной ареста в определенных обстоятельствах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана пилот награду от центра Натан Шок (P30 AG13283) и R01 гранта (R01 AG028516) из Национального института старения (NIA) А.-LH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbenicillin | Duchefa Biochemie | C0109.25 | Dissolved in water. |
| Kanamycin | Roche Group | 10106801001 | Dissolved in water. |
| Bacto-peptone | BD Biosciences | DF0118072 | |
| Bacto-tryptone | BD Biosciences | DF0123075 | |
| Bacto-yeast extract | BD Biosciences | DF0127071 | |
| Agar | BD Biosciences | DF00145170 | |
| Sterile culture tube | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| Spectrophotometer | Amersham | Gene Quant pro | Amersham is now part of GE Healthcare. |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Stemi 2000 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Accuspin FR |
References
- Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300, 1142-1145 (2003).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366, 461-464 (1993).
- Apfeld, J., Kenyon, C. Regulation of lifespan by sensory perception in Caenorhabditis elegans. Nature. 402, 804-809 (1999).
- Ching, T. T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. L. drr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Aging Cell. 9, 545-557 (2010).
- Weindruch, R., Walford, R. The Retardation of Aging and Disease by Dietary Restriction. , Thomas. (1988).
- Masoro, E. J. Subfield history: caloric restriction, slowing aging, and extending life. Sci Aging Knowledge Environ. , RE2-RE2 (2003).
- Masoro, E. J. Overview of caloric restriction and ageing. Mech Ageing Dev. 126, 913-922 (2005).
- Houthoofd, K. Axenic growth up-regulates mass-specific metabolic rate, stress resistance, and extends life span in Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol. 37, 1371-1378 (2002).
- Houthoofd, K. No reduction of metabolic rate in food restricted Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol. 37, 1359-1369 (2002).
- Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).
- Bishop, N. A., Guarente, L. Two neurons mediate diet-restriction-induced longevity in C. elegans. Nature. 447, 545-549 (2007).
- Panowski, S. H., Wolff, S., Aguilaniu, H., Durieux, J., Dillin, A. PHA-4/Foxa mediates diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Nature. 447, 550-555 (2007).
- Lakowski, B., Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13091-13096 (1998).
- Kaeberlein, T. L. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food. Aging Cell. 5, 487-494 (2006).
- Greer, E. L. An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in C. elegans. Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).
