Summary
एक प्रोटोकॉल में न्यूरॉन्स में कटौती
Abstract
न्यूरॉन्स axons और dendrites, जिनमें पूर्व या बाद synaptic विशेषज्ञताओं पतला झिल्ली एक्सटेंशन के माध्यम से अन्य कोशिकाओं के साथ संवाद. यदि एक न्यूरॉन चोट या बीमारी से क्षतिग्रस्त है, यह पुनर्जन्म हो सकता है. सेल आंतरिक और बाह्य कारकों के प्रभाव एक न्यूरॉन की क्षमता को पुनर्जीवित करने के लिए और समारोह बहाल. हाल ही में, निमेटोड सी एलिगेंस एक उत्कृष्ट मॉडल जीव के रूप में उभरा है जीन की पहचान और रास्ते में है कि 1-6 न्यूरॉन्स के उत्थान के प्रभाव संकेत है. मुख्य सी. में neuronal उत्थान आरंभ एलिगेंस लेजर की मध्यस्थता काटने, या axotomy है. Axotomy के दौरान, एक fluorescently लेबल neuronal प्रक्रिया उच्च ऊर्जा दालों का उपयोग करने के लिए कटे है. प्रारंभ में, सी. में neuronal उत्थान एलिगेंस एक प्रवर्धित femtosecond 5 लेजर का उपयोग कर जांच की गई थी. हालांकि, बाद उत्थान अध्ययनों से पता चला है कि एक पारंपरिक लेजर स्पंदित करने के लिए सही vivo में न्यूरॉन्स को तोड़ने और एक समान पुनर्योजी 1,3,7 प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
हम MicroPoint स्पंदित लेजर, एक वर्तकुंजी प्रणाली है कि आसानी से उपलब्ध है और है कि व्यापक रूप से किया गया है लक्षित सेल पृथक के लिए इस्तेमाल किया प्रयोग कीड़ा में vivo लेजर axotomy में प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. हम लेजर aligning वर्णन, कीड़े बढ़ते विशिष्ट न्यूरॉन्स काटने, और बाद उत्थान का आकलन. प्रणाली के लिए एक प्रयोग के दौरान कई कीड़े में न्यूरॉन्स की बड़ी संख्या में कटौती करने की क्षमता प्रदान करता है. इस प्रकार, लेजर के रूप में इस के साथ साथ वर्णित axotomy उत्थान की प्रक्रिया की शुरुआत और विश्लेषण के लिए एक कुशल प्रणाली है.
Protocol
1. प्रणाली कोडांतरण
हमारी प्रणाली के विशिष्ट घटकों के नीचे उल्लिखित हैं. जब ठीक से इकट्ठे, तो उपयोगकर्ता एक हाथ से खुर्दबीन ध्यान केंद्रित करने में सक्षम होना चाहिए, दूसरे के साथ चरण ले जाने के (या तो माउस या जोस्टिक के साथ), पैर पेडल के साथ लेजर सक्रिय हैं, और पर एक स्पष्ट दृश्य स्क्रीन छवि.
- MicroPoint लेजर महामारी प्रतिदीप्ति एक यौगिक खुर्दबीन के बंदरगाह के लिए मुहिम शुरू की. हम एक Nikon 80i का उपयोग करें, लेकिन किसी भी अनुसंधान ग्रेड ईमानदार या उल्टे गुंजाइश काम करना चाहिए. MicroPoint प्रणाली एक कस्टम dichroic, जो fluorophore है कि आप में कटौती करना चाहते हैं कक्षों लेबल मैच चाहिए शामिल होंगे. काटना वैकल्पिक fluorophores के साथ लेबल कोशिकाओं अतिरिक्त dichroics आवश्यकता है. इसके अतिरिक्त, एक पल्स जनरेटर और पैर पेडल MicroPoint प्रणाली के साथ आते हैं.
- 100x, सर्जरी प्रदर्शन और उत्थान का आकलन करने के लिए 1.4 एनए तेल उद्देश्य से अधिक स्लाइड पर नमूना का पता लगाने के लिए आवश्यक के रूप में अतिरिक्त उद्देश्य. हम शल्य चिकित्सा के लिए एक Nikon योजना ए पी ओ कुलपति का उपयोग करते हैं, और पाते हैं कि एक 4x मोटे ध्यान केंद्रित है और नमूना ढूँढने के लिए उपयोगी है.
- Motorized जोस्टिक के साथ मंच. अत्यंत उच्च सटीकता और repeatability के साथ एक चरण अनावश्यक है, क्योंकि मंच केवल लक्षित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हम पिछले OptiScan द्वितीय (चर्चा देखें) का उपयोग करें.
- कैमरा. कैमरा ध्यान केंद्रित करने और 100x neurite उद्देश्य के साथ लेबल को लक्षित करने के लिए, जबकि कंप्यूटर मॉनीटर पर छवि visualizing करने के लिए पर्याप्त के लिए एक फ्रेम दर प्रदान की जरूरत है. हम axotomy प्रक्रिया के दौरान रोशनी प्रकाश attenuating तस्वीर विरंजन या क्षति (1.7 देखने के नीचे) से संभावित confounding प्रभाव से बचने के पसंद करते हैं. इस प्रकार, कैमरे के लिए काफी संवेदनशील है यह कम प्रकाश के स्तर को समायोजित करने की जरूरत है. हम एक हमामात्सू Orca 05G उपयोग करते हैं, और पाते हैं 16.3 हर्ट्ज पर इमेजिंग के लिए पर्याप्त है. समतुल्य कैमरों प्रतिस्थापित किया जा सकता है.
- कंप्यूटर, मॉनिटर, और इमेजिंग सॉफ्टवेयर है कि कैमरे को ड्राइव कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, हम इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग एक माउस के साथ motorized चरण में हेरफेर (चर्चा देखें).
- एयर तालिका. इस आवश्यकता के स्थान के आधार पर भिन्न हो सकता है, लेकिन सर्जरी के बाद से एक 100x उद्देश्य से किया जाता है, हम कंपन अलगाव आवश्यक हो पाते हैं.
- प्रकाश गाइड और fluorophore रोशन करने के लिए शटर तंत्र के साथ हल्की आपूर्ति. प्रकाश गाइड MicroPoint के लिए देते हैं जाएगा. शटर तंत्र स्वतंत्र रूप से लेजर की रोशनी की तीव्रता कम करने के लिए उपयोगी है. हम पिछले 200 लुमेन या एक Leica EL6000 का उपयोग करें, और axotomy के लिए कुल प्रकाश की तीव्रता का 80% अप करने के लिए attenuate.
2. लेजर सेटअप
विस्तृत करने के लिए शुरू संरेखित करें और लेजर ध्यान केंद्रित प्रोटोकॉल MicroPoint लेजर प्रणाली के साथ प्रदान की जाती है. हमें लगता है कि प्रारंभिक सेटअप प्रक्रिया पर सफलतापूर्वक पीछा किया गया है. इस ऐपिस में क्रॉसहेयर साथ लेजर aligning शामिल हैं. यहाँ हम लेजर फोकस और तीव्रता के नियमित रखरखाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.
MicroPoint पुस्तिका में नोट, स्पंदित नाइट्रोजन लेजर गंभीर मानवीय आँख को नुकसान पहुँचाए में सक्षम है. केयर लेजर बीम में देखने के लिए कभी नहीं सीधे करने के लिए लिया जाना चाहिए. एक बार स्थापित, बाधा फिल्टर सुरक्षित रूप से eyepieces के माध्यम से विकिरण ब्लॉक चाहिए.
एक जीव में न्यूरॉन्स काटना रेत के एक अनाज के आकार के चुनौतीपूर्ण हो सकता है. चूंकि लेजर द्वारा किया क्षति के क्षेत्र बहुत छोटा है, यह तीन आयामी लेजर ध्यान केंद्रित का स्थान पता करने के लिए आवश्यक है क्रम में ठीक करने के लिए नमूना लक्ष्य. लेजर ध्यान केंद्रित नजर आता स्लाइड का उपयोग कर पाया है. सबसे पहले, हम जाँच करें कि लेजर ध्यान केंद्रित करने के z स्थान इमेजिंग पथ का ध्यान से मेल खाता है. अगला, xy क्षति को ध्यान के स्थान इमेजिंग सॉफ्टवेयर में क्रॉसहेयर के साथ चिह्नित है.
Z-विमान में केंद्रित
- तटस्थ घनत्व फिल्टर ND16 (चित्रा 1 क) में पुश. हम महामारी रोशनी पथ में तटस्थ घनत्व फिल्टर का उपयोग जबकि ध्यान केंद्रित करने के लिए लेजर attenuate. के लिए भी बेहतर ध्यान केंद्रित, दोनों ND16 और ND4 फ्लोरोसेंट फिल्टर में धक्का.
- MicroPoint लेजर एक नाड़ी के लिए स्विच के साथ सेट करें 'चुनें' (चित्रा 1b), और तब उपयुक्त लंबे पास बाधा फिल्टर (चित्रा -1 सी) फिल्टर पहिया कदम बदल गया.
- मंच पर नजर आता है स्लाइड प्लेस और भीतर 4X संचारित प्रकाश का उपयोग कर उद्देश्य के साथ pinholes पर ध्यान केंद्रित.
- नजर आता है स्लाइड में विसर्जन के तेल की एक बूंद जोड़ें और 100X उद्देश्य के साथ pinholes पर refocus. ऑप्टिकल पथ स्विचन लीवर (चित्रा 1 दिन) और लेजर शटर (चित्रा 1e) के साथ कैमरा शटर खोले. यदि आवश्यक हो, प्रेषित प्रकाश की तीव्रता को कम तो pinholes के किनारों कुरकुरा रहे हैं: यह वास्तव में ध्यान केंद्रित करने में सहायता करेगा.
- प्रेस पैर पेडल. इस आईने में एक छोटा सा छेद का उत्पादन अगर लेजर ठीक से ध्यान केंद्रित किया है चाहिए.
- नजर आता है स्लाइड के विमान से थोड़ा ऊपर खुर्दबीन फोकस और लेजर फिर गोली मार. यह भी एक छोटा बनाना चाहिएपहली गोली से छेद, या सब पर कोई निशान छोड़. नजर आता है स्लाइड के नीचे ध्यान केंद्रित करके दोहराएँ.
- यदि एक छेद 2.5 में उत्पादन नहीं है, या यदि एक बड़ा छेद जब आईने की सतह के ऊपर या नीचे ध्यान केंद्रित करने के लिए उत्पादन किया है, लेजर पृथक सिर पर ध्यान अंगूठी के साथ refocus. सत्यापित करें कि छेद अभी भी ठीक है ऐपिस में क्रॉसहेयर साथ गठबंधन. लगातार उपयोग के साथ Z-विमान, ध्यान शायद ही कभी करने के लिए समायोजित की जरूरत है.
Xy विमान में केंद्रित
- ऊपर 2.3 के माध्यम से 2.1 चरणों का पालन करें और पैर पेडल प्रेस करने के लिए दर्पण स्लाइड में एक छोटा सा छेद करना.
- प्रारंभ करें 'लाइव' तत्वों 'मोल' मेनू से मोड पर कब्जा. 'उपाय' उपकरण पट्टी का चयन करें 'आरओआई संपादक', तो 'डबल क्रॉस' उपकरण का चयन करें और उन्हें नए छेद के केंद्र के साथ तालमेल क्रॉसहेयर खींचें. पर क्लिक करें और फिर 'संपादक से बाहर निकलें' आरओआई सहेजें 'और लाइव कब्जा मोड को फिर से शुरू.
- सक्रिय तत्वों में 'माउस XY' सेटिंग के लिए माउस के साथ मंच में हेरफेर.
- तटस्थ घनत्व फिल्टर (ओं) को मूल स्थान (ओं) को वापस खींचो, 10 के लिए लेजर दालों सेट, और नजर आता स्लाइड को हटा दें.
लेजर की शक्ति समायोजित
- लेजर की शक्ति कम से कम अपनी पसंद के न्यूरॉन में कटौती करने के लिए आवश्यक बिजली के लिए समायोजित किया जाना चाहिए. Attenuator प्लेट (चित्रा 1f) हिल जबकि रहने वाले कीड़े (नीचे वर्णित) को काटने के द्वारा शक्ति को समायोजित करें. यदि लेजर शक्ति बहुत अधिक है, यह परिधीय क्षति के कारण या कीड़ा में एक छेद विस्फोट होगा. यदि लेजर शक्ति बहुत कम है, यह न्यूरॉन नहीं तोड़ जाएगा. एक बार इस प्रणाली गठन किया गया है, attenuator स्थिति शायद ही कभी बदलने की जरूरत है. यदि लेजर कमजोर हो जाता है, और attenuator थाली को काटने जारी रखने के लिए ले जाया जा जरूरत है, यह एक संकेत है कि डाई सेल में डाई (चर्चा देखें) जगह की जरूरत है हो सकता है.
3. कीड़े स्थिर
- 3% M9 में पिघला हुआ agarose (KH2PO4 22mm, 42mm Na2HPO4, 85mm NaCl, 1mm MgSO4) के एक समाधान तैयार है. एक 15 एमएल बाज़ ट्यूब में पिघला हुआ agarose के 5 एमएल बग़ैर. पानी के साथ एक ट्यूब भरें. एक मॉड्यूलर हीटिंग तत्व प्लेस ट्यूबों में 55 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट प्रत्येक ट्यूब के लिए मिनी पानी स्नान बनाने के पानी के साथ हीटिंग तत्व भरें. नोट: agarose बड़ी मात्रा में अग्रिम में तैयार किया जा सकता है और बाद के प्रयोगों के लिए फिर से पिघल.
- दो स्लाइड्स के प्रत्येक और इन स्लाइड्स के बीच एक साफ स्लाइड पर लेबलिंग टेप के दो परतों रखें. Agarose की एक बूंद साफ स्लाइड और पहले इतना है कि जिसके परिणामस्वरूप agarose पैड के दो टुकड़े टेप (चित्रा 2) की मोटाई है के लिए एक और स्लाइड सीधा जगह के बीच करने के लिए एक प्लास्टिक बल्ब विंदुक का उपयोग बग़ैर. 30 सेकंड के बाद पैड से दो स्लाइड्स में से निकालें. कुल्ला और बाद में स्लाइड के साथ प्रयोग के लिए पानी से भरे बाज़ ट्यूब में प्लास्टिक पिपेट की दुकान.
- अगला, जगह पैड के बीच में 0.10 या सुक्ष्ममापी 0.05 सुक्ष्ममापी polystyrene मोतियों की 3-5 μL. 5-10 हित के न्यूरॉन्स में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कीड़े जोड़ें. यदि ब्याज की न्यूरॉन्स asymmetrically कृमि के सही या बाईं ओर पर वितरित कर रहे हैं, एक प्लैटिनम लेने का उपयोग करें कीड़े ताकि सही पक्ष का सामना करना पड़ रहा है फ्लिप. कीड़े agarose पैड की तैयारी के 10 मिनट के भीतर स्लाइड्स पर रखा जाना चाहिए.
- ध्यान कीड़े पर एक कवर पर्ची जगह है. कवर पर्ची रखने के बाद, यह agarose पैड के सापेक्ष के रूप में इस छल्ली बाधित और कीड़े को नष्ट कर देगा कदम नहीं है. खुर्दबीन मंच पर तैयार स्लाइड रखें.
4. कट न्यूरॉन्स
- ऑप्टिकल पथ स्विचन लीवर के साथ eyepieces में प्रत्यक्ष प्रकाश. 4X उद्देश्य से काटा जा कीड़ा पर ध्यान दें, कवर पर्ची पर तेल की एक बूंद जगह है, और 100X उद्देश्य के लिए स्विच. कैमरे के लिए ऑप्टिकल पथ पर लौटें.
- माउस का प्रयोग क्रॉसहेयर के केंद्र के तहत अपनी पसंद के न्यूरॉन चाल. पैर पेडल प्रेस लेजर आग और neuronal प्रक्रिया तोड़. यदि आवश्यक हो, दालों के दो सेट न्यूरॉन तोड़ इस्तेमाल किया जा सकता है. सबसे पहले, यह उपयोगी है ठीक ट्रैक जो न्यूरॉन्स व्यक्तिगत कीड़े में तोड़ दिया गया है क्रम में के बाद उत्थान का आकलन. जब सही ढंग से प्रदर्शन लेजर axotomy, आसपास त्वचा के ऊतकों या अन्य न्यूरॉन्स (चित्रा 3 देखें) के लिए महत्वपूर्ण क्षति के कारण के बिना न्यूरॉन में एक छोटा सा ब्रेक पैदा करता है. कुछ मामलों में, एक छोटे से निशान चोट की साइट के आसपास फार्म का हो सकता है.
- एक सीधा ऊपर की ओर आंदोलन में कवर पर्ची हटाने के द्वारा पुनर्प्राप्त कीड़े, सावधान किया जा रहा है कि कीड़े agarose पैड पर बने रहने. Coverslip स्लाइड बंद करो. फिर, सुई - नाक संदंश के साथ कीड़े के आसपास पैड में कटौती और हौसले वरीयता प्राप्त एन जी एम 8 OP50 युक्त थाली पर agarose की धारा जगह. पैड पर बाँझ M9 के 10 μL प्लेस मोतियों से कीड़े मुक्त और agarose हटायें.
5. उत्थान के लिए कुल न्यूरॉन्स
- Agarose पैड तैयार के रूप में 2.2 चरण में उल्लिखित है.
- 3-5 और में कीड़े प्लेसम्यू, polystyrene मनकों के एल. Coverslip लागू. स्लाइड्स क्रमिक रूप से तैयार किया जा सकता है है, या वैकल्पिक रूप से सभी कीड़े को अग्रिम और 10 सेमी संस्कृति व्यंजन, प्रत्येक agarose नम रखने के लिए एक नम Kimwipe युक्त में रखा स्लाइड्स में तैयार किया जा सकता है.
- 100X उद्देश्य का प्रयोग कटे न्यूरॉन्स की कल्पना कर सकते हैं. कई न्यूरॉन्स, एक neuronal कटौती साइट के लिए बाहर का स्टंप रहेगा. हम एक संकेत है कि वास्तव में न्यूरॉन (चित्रा 4) कटे था के रूप में इस अवशेष की उपस्थिति का उपयोग करें. इस स्टंप की उपस्थिति यह संभव एक न्यूरॉन है कि कटौती की गई है और से है कि नहीं काट दिया गया पुनर्जीवित भेद करने के लिए बनाता है. नोट: दोनों बाहर का और प्रॉक्सिमल स्टंप शुरू की जा रही कटौती के बाद वापस लेना.
- उत्थान का आकलन. मानकों की एक किस्म निर्धारित किया जा सकता है. एक सरल परख है कि घायल न्यूरॉन विकास शंकु (चित्रा 4a) का गठन किया है और पुनर्जीवित (चित्रा 4b) है या नहीं. वैकल्पिक रूप से, neurite लंबाई और पता लगाया जा सकता है तुलना में.
6. प्रतिनिधि परिणाम
एक उदाहरण के रूप में, हम γ-Aminobutyric एसिड (GABA) मोटर न्यूरॉन्स के उत्थान के लक्षण वर्णन का वर्णन. इन न्यूरॉन्स, जो ventral तंत्रिका की हड्डी में रहते हैं और circumferentially प्रक्रियाओं पृष्ठीय तंत्रिका कॉर्ड विस्तार उचित 9 हरकत के लिए आवश्यक हैं. GABA न्यूरॉन्स हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के रूप में एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग fluorophore व्यक्त की कल्पना unc -47 या unc -25 प्रमोटरों (EG1285 और CZ1200, क्रमशः उपभेदों, सी एलिगेंस जेनेटिक केंद्र से उपलब्ध है के नियंत्रण के तहत किया जा सकता है ).
माउंट L4 मंच कीड़े के रूप में वर्णित, कीड़े फ्लिप तो अपने दाएँ पक्ष पर GABA न्यूरॉन्स का सामना कर रहे हैं, और कवर पर्ची जगह. प्रत्येक कीड़ा रास्ते के मध्य में, पृष्ठीय और उदर डोरियों के बीच में पीछे commissures की 1-3 कट. Commissures काटने कि पार या अन्य commissures, के रूप में इन के साथ fasciculate बाद स्कोर मुश्किल से बचें. कीड़े पुनर्प्राप्त के रूप में वर्णित.
एक सफल axotomy के बाद 18 से 24 घंटे, कीड़े सर्जरी से बरामद किया जाएगा और सामान्य locomotory और अंडे बिछाने व्यवहार एक्ज़िबिट. कीड़े कि मृत या बीमार हैं त्यागें. रिमाउंट शेष के रूप में वर्णित है, और उत्थान का आकलन. हम आम तौर पर प्रयोगात्मक हालत के अनुसार कम से कम 30 न्यूरॉन्स कटौती का आकलन करना है. OxIs12 पशुओं में, कटे L4 GABA न्यूरॉन्स की आमतौर पर 60-70% वृद्धि शंकु संरचना, टिप और कई neurite शाखाओं के विस्तार पर एक झिल्ली के व्यापक बनाने और कटौती साइट (4a चित्रा) से माइग्रेट द्वारा evidenced शुरू होगा . कई मामलों में, विकास शंकु पृष्ठीय तंत्रिका कॉर्ड, एक आसन्न neuronal commissure, या बाहर का स्टंप के साथ जोड़ने के लिए चले गए हैं जाएगा. शेष न्यूरॉन्स की 30% या तो कोई वृद्धि नहीं है शुरू होगा, एक axotomy की साइट के लिए प्रॉक्सिमल स्टंप के गठन, या केवल छोटे filopodia (चित्रा 4b) विस्तारित होगा.
चित्रा 1. यूवी लेजर axotomy प्रणाली स्पंदित. (क) एन डी फिल्टर (ख) पल्स चयनकर्ता (ग) फिल्टर पहिया लीवर (घ) ऑप्टिकल पथ स्विचन लीवर (ई) लेजर शटर और (च) attenuator प्लेट: विशिष्ट घटक हैं.
चित्रा 2. एक agarose पैड तैयारी. इच्छित मोटाई के एक agarose पैड तैयार करने के लिए, टेप की दो परतों (हरा) दो स्लाइड्स पर रखा जाता है. एक स्लाइड पहले दो के बीच रखा गया है, और agarose की एक बूंद तो साफ स्लाइड पर जोड़ा है. अंत में, एक चौथा स्लाइड लंबरूप में पहले तीन से रखा गया है, एक पैड है कि टेप के दो टुकड़े की मोटाई में जिसके परिणामस्वरूप.
चित्रा 3. प्रतिनिधि GABA न्यूरॉन axotomies. एक ठेठ प्रयोग में, GABA न्यूरॉन commissures कृमि के पार्श्व पहलू के बीच में कटे हैं. एक कटे commissure (बाएं पैनल) के पहले और तुरंत axotomy (राइट पैनल) के बाद दिखाया गया है. सभी छवियों को एक 100X तेल के उद्देश्य से ले जाया गया.
चित्रा 4. GABA न्यूरॉन axotomies के प्रतिनिधि परिणाम है. 24 घंटे बाद axotomy कटे axons के उत्थान के लिए बने हैं. विकास शंकु (तीर) के साथ एक regenerating के अक्षतंतु में दिखाया गया है (क), जबकि एक गैर regenerating के अक्षतंतु एक प्रॉक्सिमल स्टंप (तीर) के रूप में (ख) में देखा जाता है. प्रत्येक कटौती अक्षतंतु के बाहर स्टंप प्रत्येक पैनल (arrowhead) में दिखाया गया है और एक संकेत है कि अक्षतंतु कटे किया गया है है.
Discussion
लेजर प्रणालियों की एक किस्म neurites के लिए सी में कटौती के लिए इस्तेमाल किया गया है एलिगेंस, और कई अध्ययनों 3,7,10,11 विस्तार में उनके प्रदर्शन की जांच की है. MicroPoint हमारे प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया लेजर एक वर्तकुंजी प्रणाली है कि स्थापित करने और बनाए रखने के लिए आसान है, और तिवारी नीलम लेजर प्रणाली की तुलना में शोधकर्ताओं के लिए एक कम कीमत पर उपलब्ध है. तिवारी नीलम प्रणाली की तुलना में, तथापि, MicroPoint लेजर एक बड़ा क्षेत्र है, जो कुछ अनुप्रयोगों के लिए हानिकर हो सकता है नुकसान के कारण की उम्मीद है. यदि तिवारी नीलम प्रणाली वांछित है, एक ऐसी प्रणाली के निर्माण पर एक उत्कृष्ट प्रोटोकॉल उपलब्ध है 12.
वर्तमान प्रोटोकॉल सी. में न्यूरॉन्स की एक किस्म पर प्रदर्शन किया जा सकता है है एलिगेंस, तथापि, हम ध्यान दें कि न्यूरॉन्स के विशिष्ट प्रकार के बीच पुनर्योजी क्षमताओं में मतभेद 13 की उम्मीद कर रहे हैं . इसके अतिरिक्त, विभिन्न ट्रांसजेनिक पृष्ठभूमि पुनर्योजी सफलता को प्रभावित कर सकते हैं. हालांकि regenerating GABA न्यूरॉन्स के प्रतिशत अलग ट्रांसजेनिक मार्कर उपभेदों के बीच काफी संगत है, हम 14 juIs76 में एक समग्र oxIs12 15 कीड़े बनाम उत्थान में मामूली वृद्धि का उल्लेख किया है. स्पर्श न्यूरॉन्स के मार्कर के बीच अंतर भी 2 वर्णित किया गया है.
हम anesthetics के बजाय microbeads के साथ कीड़े स्थिर पसंद के रूप में मोती तेजी से और अधिक सुसंगत 16 स्थिरीकरण में परिणाम . यह भी है फायदेमंद के रूप में हम किसी भी संभव confounding 17 संज्ञाहरण के कारण प्रभाव से मुक्त उत्थान निरीक्षण कर रहे हैं. स्थिरीकरण के लिए एक वैकल्पिक तरीका संवेदनाहारी मुक्त microfluidic उपकरणों का उपयोग है. axotomy के लिए microfluidics का उपयोग बड़े पैमाने पर 17-22 में वर्णित किया गया है.
हम पाते हैं कि लगातार उपयोग के साथ, सबसे अच्छा लेजर कार्यों जब Coumarin डाई सेल में 440 बार प्रत्येक सप्ताह MicroPoint के मैनुअल में उल्लिखित प्रक्रिया का पालन करने के लिए बदल जाता है. यदि आवश्यक हो, क्षीणन स्लाइडर शक्ति में वृद्धि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इस पुराने डाई या लेजर misalignment के एक संकेत हो सकता है. इसके अलावा, डाई सेल एक सीमित जीवनकाल है और अंततः पुनर्निर्माण हो या जगह (देखें विघ्ननिवारण) की आवश्यकता होगी.
यह मुश्किल हो क्रॉसहेयर है कि लेजर ध्यान केंद्रित निशान के तहत लक्ष्य neurite पैंतरेबाज़ी कर सकते हैं, खासकर अगर पशु अधूरे झोले के मारे हुए है. हम पाते हैं कि इस उद्देश्य के लिए एक मैनुअल मंच इष्टतम नहीं है, हालांकि यह निश्चित रूप से प्रयोग करने योग्य है. एक जोस्टिक नियंत्रित motorized मंच और अधिक सटीक है, और हम पाते हैं कि सॉफ्टवेयर है कि motorized मंच को स्थानांतरित करने के लिए माउस के साथ घसीट छवि का समर्थन करता है का उपयोग सबसे अच्छा है. Nikon तत्वों को इस सुविधा प्रदान करता है और इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, लेकिन मुक्त Micromanager पैकेज के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य इमेजिंग सॉफ्टवेयर, इसी तरह की कार्यक्षमता हो सकता है. ठीक लक्ष्यीकरण का एक अलग तरीका लेजर ध्यान केंद्रित करने के लिए पशु बजाय कदम है. एक galvanometer बीम स्टीयरिंग तंत्र के रूप में उपलब्ध है एक MicroPoint लेजर पर जोड़ने के लिए, यदि इस दृष्टिकोण पसंद है.
Neuronal उत्थान के अध्ययन के लिए अपने आवेदन के अलावा, लेजर अन्य प्रकार सेल, जैसे त्वचा, मांसपेशियों, या विशेष कोशिकाओं के रूप में ablate, या विशिष्ट neuronal synapses बाधित 23-27 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, मार्ग है कि न्यूरॉन्स के अध: पतन है कि चोट या रोग के साथ जुडा हुआ को विनियमित इस प्रणाली के साथ जांच की जा सकता है. जैसे, स्पंदित लेसरों का उपयोग करने के लिए दोनों आनुवंशिक कारकों और सेल जैविक परिवर्तन है कि neuronal उत्थान और अन्य प्रासंगिक प्रक्रियाओं की सुविधा पर प्रकाश डाला जारी रहेगा.
समस्या निवारण:
यहाँ वर्णित कुछ आम समस्याओं और उनके संबद्ध समाधान कर रहे हैं.
- लेजर ठीक से नहीं काट रहा है. यह संभावना है, क्योंकि या तो लेजर ध्यान से बाहर है (खंड 2 देखें), या डाई सेल में डाई (MicroPoint पुस्तिका देखें) जगह की जरूरत है. वैकल्पिक रूप से, डाई सेल जगह या पुनर्निर्माण की आवश्यकता हो सकती है.
- कीड़े agarose पैड पर आगे बढ़ रहे हैं. यह आम तौर पर एक संकेत है कि agarose पैड भी नम है. हम पाते हैं कि पैड के लिए लगभग 30 सेकंड के लिए छोड़ दिया से पहले कीड़े उन पर रखा जाता है इस समस्या को दरकिनार की जरूरत है. आप भी छोटे आकार microbeads (0.05 सुक्ष्ममापी) का उपयोग करने की कोशिश कर सकते हैं.
- कीड़े की वसूली मुश्किल और अक्षम है. यह गलत coverslip हटाने के द्वारा या एक सूखी agarose पैड द्वारा कारण हो सकता है है. यदि पैड भी सूखा है, तो आप देख सकते हैं कि axons एक मनके उपस्थिति विकसित. कुछ मामलों में, यह है क्योंकि कीड़े पैड पर जल्द ही पर्याप्त नहीं रखा गया, के बाद इसे बनाया गया था. वैकल्पिक रूप से, agarose समाधान के एक पुराने स्टॉक दोहराया पिघलने के बाद एक अधिक से अधिक 3% एकाग्रता हो सकता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
Hammarlund प्रयोगशाला में कार्य द्वारा वित्त पोषित है: NIH अनुदान R01 NS066082-01 और T32GM007223, Beckman फाउंडेशन, और एलिसन मेडिकल फाउंडेशन.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05 μm Polystyrene Beads | Polysciences, Inc. | 08691 | |
| 0.10 μm Polystyrene Beads | Polysciences, Inc. | 00876 | |
| Agarose GPG/LE | American Bioanalytical | 00972 | Ultra pure |
| Falcon 14 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352057 | 17 x 100 mm style, nonpyrogenic |
| Thermo Scientific Plain precleaned microscope slides | Erie Scientific | 420-004T | 3" x 1" x 1 mm |
| Cover Slips | VWR international | 48366 205 | 18 mm x 18 mm No. 1 1/2 |
| KIMTECH Science Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| BD Falcon 100 x 15mm Style Petri Dish | BD Biosciences | 351029 | |
| Tape blank 3/4w x 500L | TimeMed | T-512 | |
| Immersion oil | Nikon Instruments | Type A, nd=1.515 | |
| EG1285 or CZ1200 | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/CGC/strains/ | |
| OptiScan II | Prior Scientific | ||
| NIS-Elements Ar or Br | Nikon Instruments | ||
| MicroPoint Ablation Laser System | Photonic Scientific | ||
| Compound microscope | Nikon Instruments | Eclipse 80i | |
| Hamamatsu Camera | Hamamatsu Corp. | Model C8484-05G01 | |
| Dell Precision T3400 PC with Intel Core 2 Duo | Dell | ||
| Windows XP Professional | Microsoft | Version 2002, Series Pack 3 | |
| Dual dry bath Incubator | Fisher Scientific | Analog controls | |
| 4X Plan Fluor objective | Nikon Instruments | ||
| 100X Plan Apo VC oil objective | Nikon Instruments | ||
| Dumont #5/45 forceps | Dumont | 11251-35 | Dumoxel standard tips, can also use #7 |
| Dissecting Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | With NI-150 High Intensity Illuminator |
References
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