Summary
وصفنا بروتوكولا للالتصنيع الدقيق للجهاز لتوليد ميكروفلويديك التدرج التي يمكن أن تولد التدرجات المكاني والزماني في المكروية محددة جيدا. في هذا النهج ، يمكن استخدام الجهاز لتوليد التدرج ميكروفلويديك لدراسة موجهة الهجرة الخلية ، الجنيني ، التئام الجروح ، وورم خبيث من السرطان.
Abstract
يوصف تصنيع وتشغيل جهاز لتوليد التدرج ميكروفلويديك لدراسة السلوك الخلوية. منصة ميكروفلويديك هي أداة تمكن التجريبية ، لأنه لا يمكن التعامل مع تدفقات السوائل بدقة ، وتمكين عالية الإنتاجية التجارب ، وتوليد تدرجات تركيز مستقرة قابلة للذوبان. مقارنة مع المولدات التقليدية التدرج ، وبولي (dimethylsiloxane) (PDMS) يمكن أن يستند إلى أجهزة ميكروفلويديك توليد تدرجات تركيز عوامل النمو المستقر للمع ملامح واضحة المعالم. هنا ، وضعنا بسيطة الانحدار توليد الأجهزة ميكروفلويديك مع ثلاثة مداخل منفصلة. ثلاثة في واحدة مجتمعة microchannels متناهية لتوليد تدرجات التركيز. وأكد على استقرار وشكل عامل النمو من خلال تدرجات isothyiocyanate فلوريسئين (FITC) ، ديكستران مع الوزن الجزيئي مماثلة لعامل نمو البشرة (EGF). باستخدام هذا الجهاز ميكروفلويديك ، أثبتنا أن الخلايا الليفية تتعرض لالتدرجات تركيز EGF هاجر نحو تركيزات أعلى. قيمت كميا التوجه اتجاهي للهجرة الخلية والحركة من الخلايا المهاجرة التي تتبع خلية التحليل. وبالتالي ، قد يكون هذا الجهاز التدرج توليد ميكروفلويديك مفيدا لدراسة وتحليل سلوك الخلايا المهاجرة.
Protocol
ألف التصنيع الدقيق للجهاز لتوليد التدرج ميكروفلويديك
- يتم التعامل مع رقاقة سيليكون مع البلازما الاكسجين التفاعلية (5 دقائق في 30W ، Harrick العلمية ونيويورك).
- مقاوم الضوء السلبية (SU - 8 50 ، Microchem ، MA) هي تدور مغلف بالمطاط في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة على رقاقة سيليكون.
- رقاقة لينة المخبوزة في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وبعد ذلك في 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على موقد.
- يتعرض الرقاقة لضوء الأشعة فوق البنفسجية (200W) لمدة 3 دقائق من خلال قناع الشفافية التي تتميز بحجم لا يقل عن 30 ميكرون.
- الرقاقة هو خبز في آخر 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة وعلى 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- تم تطوير الاشتراكية سيد العفن مع قنوات 100 ميكرون سميكة باستخدام SU - 8 المطور مقاومة للضوء.
- يتم وضع رقاقة تحتوي على microchannels في صحن بتري.
- هي ملفقة بولي (dimethylsiloxane) (PDMS) (Sylgard 184) قوالب السيليكون التي الاستومر الاختلاط وكيل علاج (10:1 نسبة).
- يسكب الخليط PDMS على القالب الرئيسي سي.
- يوضع القالب الرئيسي سي على فراغ مجفف لإزالة فقاعات لمدة 10 دقيقة.
- غير مملح PDMS في 70 درجة مئوية لمدة 1 2 ساعة ~.
- مقشر وقوالب PDMS الخروج من القالب الرئيسي سي.
باء الإعداد التجريبي
- واللكم مدخل الخلية ، ومنفذا ، وغرس مداخل الجهاز PDMS المستندة ميكروفلويديك باستخدام سنابك حادة.
- مستعبدين بشكل لا رجعة فيه جهاز وشريحة زجاجية (2 × 3 بوصة) من البلازما الاكسجين التفاعلية (5 دقائق في 30W ، Harrick العلمية ونيويورك).
- يتم إدراج أنابيب البولي إيثيلين (PE 20 ، بيكتون Dickinon ، MD) في غرس مداخل الجهاز ميكروفلويديك وتوصيلها لاحقا إلى ضخ حقنة.
- فلوريسئين ثيوسيانات (FITC) ، ديكستران (MW = 10kD ، 10 ميكرومتر ، سيغما) ، وغرست العازلة (PBS ، Invitrogen ، كاليفورنيا) في الجهاز ميكروفلويديك لتأكيد التدرجات مستقرة داخل الجهاز fluidic.
- وهي مغلفة المصفوفة خارج الخلية (ECM) (أي فبرونيكتين) داخل الجهاز ميكروفلويديك لمدة 1 ساعة في حاضنة (37 درجة مئوية).
- الخلايا الليفية 3T3 المعاهد الوطنية للصحة وtrypsinized وفصلها.
- فصل الخلايا يتم تحميلها في الجهاز ميكروفلويديك (800 ميكرون واسعة) في كثافة خلية من 2 × 10 6 خلية / مل.
- وسائل الاعلام هي التي غرست 2 مل و 50 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF) في جهاز ميكروفلويديك لتوليد تدرجات ذوبان باستخدام مضخة محقنة (0.05 ميكروليتر / دقيقة).
- هي في الوقت الحقيقي رصد خلايا كل 5 دقائق باستخدام مجهر مقلوب (نيكون TE 2000).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخلايا المعرضة للتركيز التدرجات مستقرة EGF في جهاز ميكروفلويديك هاجر نحو تركيزات أعلى. وكان التحقيق في اتجاه الاتجاه الهجرة الخلية ، ومؤشر الكيميائي ، حركية الخلايا المهاجرة التي تتبع خلية التحليل. ولذلك ، يمكن لهذه المنصة التدرج توليد ميكروفلويديك مفيدا لدراسة الانبثاث السرطان ، مرحلة التطور الجنيني ، والتوجيه محور عصبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-FITC | Reagent | Sigma-Aldrich | FD10S | Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated-dextran (10kD) |
| hr-EGF | Invitrogen | 13247-051 | human recombinant Epidermal growth factor | |
| PDMS | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 50 | ||
| Si wafer | silicone wafer, 4 inch | |||
| Petri dishes | ||||
| Polyethylene tubing | BD Biosciences | PE 20 | ||
| PBS | Invitrogen | |||
| Fibronectin | ||||
| NIH 3T3 | cell-line | fibroblast cells | ||
| Inverted microscope | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).
- Lin, F., Nguyen, C. M., Wang, S. J., Saadi, W., Gross, S. P., Jeon, N. L. Effective neutrophil chemotaxis is strongly influenced by mean IL-8 concentration. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 576-581 (2004).
- Chung, B. G., Flanagan, L. A., Rhee, S. W., Schwartz, P. H., Lee, A. P., Monuki, E. S., Jeon, N. L. Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5, 401-406 (2005).
- Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomed. Microdevices. 8, 109-118 (2007).
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
