Summary
Se describe un protocolo para la microfabricación del dispositivo de generación de gradiente de microfluidos que puede generar gradientes espaciales y temporales bien definidos microambiente. En este enfoque, el dispositivo de microfluidos gradiente de generación se pueden utilizar para estudiar la migración celular dirigida, la embriogénesis, la cicatrización de heridas y la metástasis del cáncer.
Abstract
La fabricación y el funcionamiento de un dispositivo de generación de gradiente de microfluidos para estudiar el comportamiento celular se describe. Una plataforma de microfluidos es una herramienta que permite experimental, porque se puede manipular con precisión los flujos de fluidos, permiten experimentos de alto rendimiento, y la creación de empleos estables gradientes de concentración soluble. En comparación con los generadores convencionales de gradiente, el poli (dimetilsiloxano) (PDMS) los dispositivos de microfluidos basada puede generar gradientes de concentración estable de factores de crecimiento con perfiles bien definidos. En este caso, hemos desarrollado sencilla la generación de gradiente dispositivos de microfluidos con tres entradas separadas. Tres microcanales combinan en un microcanal para generar gradientes de concentración. La estabilidad y la forma de gradientes de factor de crecimiento fueron confirmados por fluoresceína isothyiocyanate (FITC)-dextrano con un peso molecular similar a la del factor de crecimiento epidérmico (EGF). El uso de este dispositivo de microfluidos, hemos demostrado que los fibroblastos expuestos a gradientes de concentración de EGF emigraron hacia una mayor concentración. La orientación direccional de la migración celular y la motilidad de las células que migran se evaluó cuantitativamente por análisis de la célula de seguimiento. Por lo tanto, este dispositivo de microfluidos gradiente de generación podrían ser útiles para estudiar y analizar el comportamiento de las células que migran.
Protocol
A. microfabricación del dispositivo de generación de gradiente de microfluidos
- La oblea de silicio se trata con plasma de oxígeno reactivo (5 min a 30 W, Harrick Científico, NY).
- Fotosensible negativa (SU-8 50, Microchem, MA) es spin-revestido a 1000 rpm durante 1 minuto en una oblea de silicio.
- La oblea es suave al horno a 65 ° C durante 10 minutos y posteriormente a 95 ° C durante 30 minutos en una placa calefactora.
- La oblea se expone a la luz UV (200W) durante 3 minutos a través de una máscara de transparencia con una dimensión mínima de 30 micras.
- La oblea es posterior al horno a 65 ° C durante 1 minuto y 95 ° C durante 10 min.
- Si molde maestro con 100 canales m de espesor se desarrolla utilizando SU-8 desarrollador fotosensible.
- La oblea que contienen microcanales se coloca en un plato de Petri.
- Moldes de poli (dimetilsiloxano) (PDMS) (Sylgard 184) son fabricados por la mezcla de elastómero de silicona y agente de curado (10:1).
- La mezcla de PDMS se vierte sobre el molde de la Si.
- El molde maestro Si se coloca en un desecador de vacío para eliminar las burbujas durante 10 minutos.
- PDMS se cura a 70 ° C durante 1 a 2 horas.
- Moldes de PDMS se le quitan del molde maestro Si.
B. Arreglo experimental
- Las entradas de la celda de entrada, salida y de la infusión del dispositivo de microfluidos basada en PDMS se perforan con punzones afilados.
- Un dispositivo y un portaobjetos de vidrio (2 x 3 pulgadas) de manera irreversible en condiciones de servidumbre por el plasma de oxígeno reactivo (5 min a 30 W, Harrick Científico, NY).
- Tubo de polietileno (PE 20, Becton Dickinon, MD) se inserta en las entradas de la infusión del dispositivo de microfluidos y, posteriormente, conectado a una bomba de jeringa.
- Isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano (MW = 10kD, 10 M, Sigma) y tampón (PBS, Invitrogen, CA) se infunden en el dispositivo de microfluidos para confirmar gradientes estables dentro del dispositivo de fluidos.
- Matriz extracelular (MEC) (es decir, la fibronectina) está recubierto en el interior del dispositivo de microfluidos durante 1 hora en la incubadora (37 ° C).
- Células NIH 3T3 fibroblastos se tripsinizaron y disociados.
- Las células disociadas se cargan en el dispositivo de microfluidos (800 m de ancho) en la densidad celular de 2 x 10 6 células / ml.
- 2 ml de medio y 50 ng / ml factor de crecimiento epidérmico (EGF) se infunde en un dispositivo de microfluidos para generar gradientes soluble utilizando una bomba de jeringa (0,05 l / min).
- Las células son monitoreados en tiempo real cada 5 minutos mediante el uso de un microscopio invertido (Nikon TE 2000).
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Discussion
Las células expuestas a los gradientes de concentración estable de EGF en un dispositivo de microfluidos emigraron hacia una mayor concentración. La orientación direccional de la migración celular, el índice de quimiotaxis, la motilidad de las células que migran son investigados por el análisis de la célula de seguimiento. Por lo tanto, esta plataforma de generación de gradiente de microfluidos podría ser útil para el estudio de la metástasis del cáncer, la embriogénesis, y guiado de los axones.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-FITC | Reagent | Sigma-Aldrich | FD10S | Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated-dextran (10kD) |
| hr-EGF | Invitrogen | 13247-051 | human recombinant Epidermal growth factor | |
| PDMS | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 50 | ||
| Si wafer | silicone wafer, 4 inch | |||
| Petri dishes | ||||
| Polyethylene tubing | BD Biosciences | PE 20 | ||
| PBS | Invitrogen | |||
| Fibronectin | ||||
| NIH 3T3 | cell-line | fibroblast cells | ||
| Inverted microscope | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).
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