Summary
Abbiamo descritto un protocollo per la microfabbricazione del gradiente apparecchio che può generare microfluidi che possono generare gradienti spaziali e temporali ben definite microambiente. In questo approccio, il gradiente di generazione dispositivo a microfluidi può essere utilizzato per studiare la migrazione delle cellule diretto, l'embriogenesi, la guarigione delle ferite, e le metastasi del cancro.
Abstract
La fabbricazione e il funzionamento di un gradiente che generano dispositivo a microfluidi per studiare il comportamento cellulare è descritto. Una piattaforma microfluidica è uno strumento che permette di sperimentazione, perché può manipolare con precisione i flussi di liquidi, consentono high-throughput esperimenti, e generare stabile gradienti di concentrazione solubile. Rispetto ai convenzionali generatori di pendenza, poli (dimetilsiloxano) (PDMS) microfluidica dispositivi basati in grado di generare gradienti di concentrazione stabile di fattori di crescita ben definiti profili. Qui, abbiamo sviluppato semplice gradiente dispositivi che generano microfluidica con tre ingressi separati. Tre microcanali combinati in un unico microcanali per generare gradienti di concentrazione. La stabilità e la forma dei gradienti di fattori di crescita sono stati confermati da isothyiocyanate fluoresceina (FITC)-destrano con un peso molecolare simile al fattore di crescita epidermico (EGF). L'utilizzo di questo dispositivo a microfluidi, abbiamo dimostrato che i fibroblasti esposti a gradienti di concentrazione di EGF migrati verso concentrazioni più elevate. L'orientamento direzionale di migrazione delle cellule e della motilità delle cellule migrano sono state quantitativamente valutate attraverso l'analisi delle cellule di tracking. Così, questo gradiente apparecchio che può generare microfluidi potrebbe essere utile per studiare e analizzare il comportamento delle cellule migrano.
Protocol
Microfabrication A. del gradiente di generazione dispositivo a microfluidi
- Il wafer di silicio viene trattato con plasma di ossigeno reattivo (5 min a 30 W, Harrick scientifico, NY).
- Photoresist negativo (SU-8 50, MicroChem, MA) è spin-rivestito a 1000 rpm per 1 minuto su un wafer di silicio.
- Il wafer è morbido al forno a 65 ° C per 10 minuti e successivamente a 95 ° C per 30 minuti su una piastra.
- Il wafer viene esposto alla luce UV (200W) per 3 minuti attraverso una maschera di trasparenza con una dimensione minima di 30 micron.
- Il wafer è post forno a 65 ° C per 1 minuto e 95 ° C per 10 min.
- Si stampo padronale con 100 canali micron di spessore è sviluppato utilizzando SU-8 sviluppatore photoresist.
- Il wafer che contiene microcanali è posto in un piatto di Petri-.
- Stampi poli (dimetilsiloxano) (PDMS) (Sylgard 184) sono fabbricati da elastomero di silicone di miscelazione e catalizzatore (10:1 ratio).
- La miscela PDMS si versa nello stampo Si maestro.
- Lo stampo maestro Si è posto su un essiccatore a vuoto per rimuovere le bolle per 10 minuti.
- PDMS è curata a 70 ° C per 1 ~ 2 ore.
- Stampi PDMS si stacca dallo stampo maestro Si.
B. Apparato Sperimentale
- Prese d'ingresso delle cellule, sbocco, e infondendo il PDMS dispositivo basato microfluidi sono punzonati utilizzando punzoni taglienti.
- Un dispositivo e un vetrino (2 × 3 pollici) sono irreversibilmente legati dal plasma di ossigeno reattivo (5 min a 30 W, Harrick scientifico, NY).
- Tubi in polietilene (PE 20, Becton Dickinon, MD) è inserito nel insenature infondendo del dispositivo a microfluidi e successivamente collegato ad una pompa a siringa.
- Isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano (MW = 10kD, 10 mM, Sigma) ed tampone (PBS, Invitrogen, CA) sono infuse nel dispositivo a microfluidi per confermare gradienti stabile all'interno del dispositivo fluidica.
- Matrice extracellulare (ECM) (cioè, fibronectina) è rivestita all'interno del dispositivo a microfluidi per 1 ora in incubatore (37 ° C).
- Fibroblasti NIH 3T3 sono trypsinized e dissociato.
- Cellule dissociate vengono caricati nel dispositivo a microfluidi (800 micron di larghezza) alla densità cellulare di 2 × 10 6 cellule / ml.
- 2 media ml e 50 ng / ml fattore di crescita epidermico (EGF) è infuso in un dispositivo a microfluidi per la generazione di gradienti solubili mediante una pompa a siringa (0,05 microlitri / min).
- Le cellule sono monitorati in tempo reale ogni 5 minuti utilizzando un microscopio invertito (Nikon TE 2000).
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Discussion
Cellule esposte a gradienti di concentrazione stabile di EGF in un dispositivo a microfluidi migrato verso concentrazioni più elevate. L'orientamento direzionale della migrazione cellulare, indice chemiotattica, la motilità delle cellule migrano sono state indagate attraverso l'analisi delle cellule di tracking. Pertanto, questo gradiente di generazione piattaforma microfluidica potrebbe essere utile per studiare le metastasi del cancro, l'embriogenesi, e la guida degli assoni.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-FITC | Reagent | Sigma-Aldrich | FD10S | Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated-dextran (10kD) |
| hr-EGF | Invitrogen | 13247-051 | human recombinant Epidermal growth factor | |
| PDMS | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 50 | ||
| Si wafer | silicone wafer, 4 inch | |||
| Petri dishes | ||||
| Polyethylene tubing | BD Biosciences | PE 20 | ||
| PBS | Invitrogen | |||
| Fibronectin | ||||
| NIH 3T3 | cell-line | fibroblast cells | ||
| Inverted microscope | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).
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