Summary
In dit rapport tonen we een systeem te isoleren en cultuur donor cellen van de muis borstklier, en orthotopically deze cellen transplantatie in ontvangende muizen om de stromale analyseren: epitheel interacties tijdens mammatumor ontwikkeling.
Abstract
De invloed van stromale cellen, waaronder fibroblasten op borstkanker progressie is goed gedocumenteerd door het gebruik van muismodellen, in het bijzonder door middel van transplantatie van stromale cellen en epitheelcellen in de uier van de muizen. Huidige transplantatie modellen vaak gepaard met het gebruik van muizen immuun te wijten aan de verschillende genetische achtergronden van stromale cellen en epitheelcellen. Extracellulaire matrices worden vaak gebruikt om de twee verschillende soorten cellen insluiten voor een consistente cel-cel interacties, maar het gebruik van Matrigel of rat staart collageen, die zijn immunogeen substraten te betrekken. Het gebrek aan functionele T-cellen van muizen immuun voorkomt accurate beoordeling van de stromale cellen op borstkanker progressie in vivo, met belangrijke gevolgen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en de werkzaamheid. Bovendien immuungecompromitteerde muizen zijn duur, moeilijk te kweken en vereisen speciale zorg voorwaarden. Om deze obstakels, hebben we een aanpak ontwikkeld om stromale cel en epitheelcellen orthotopically transplantatie in muizen uit hetzelfde genetische achtergrond voor een consistente tumorvorming veroorzaken. Dit systeem gaat oogsten normaal, carcinoom geassocieerd fibroblasten, PyVmT mammacarcinoom cellen en collageen van donor C57BL/6J muizen. De cellen worden vervolgens ingebed in collageen en getransplanteerd in de lies borstklieren van vrouwelijke C57BL/6J muizen. Transplantatie van PyVmT cellen alleen vorm voelbare tumoren 30-40 dagen na transplantatie. Endpoint analyse op 60 dagen geeft aan dat co-transplantatie met fibroblasten verbetert mammatumor groei ten opzichte van PyVmT cellen alleen getransplanteerd. Terwijl de cellen en matrix van C57BL/6J muizen werden gebruikt in deze studies, kan de isolatie van cellen en matrix en transplantatie aanpak worden toegepast op muizen met verschillende genetische achtergronden tonen veelzijdigheid. Samenvattend kan dit systeem worden gebruikt om de moleculaire interacties tussen stromale cellen en epitheliale cellen te onderzoeken, en overwint kritische beperkingen bij immuungecompromitteerde muismodellen.
Protocol
1. Isolatie en extractie van donor collageen uit C57BL/6J muizen
- Offer volwassen normale vrouwelijke C57BL/6J muizen met behulp van erkende IACUC methoden.
- Oogst de staarten en genieten in 70% ethanol gedurende 45 minuten aan weefsels steriliseren. Droog de staarten met vloeipapier, wikkel in aluminiumfolie. Bewaar de staarten in de -20 ° C totdat het nodig is.
- Leg de staarten in een steriele omgeving, zoals een laminaire stroming kap. Met een schaar, splitsing van de huid op de staart wortel en schil uit de buurt van de staart. Verwijder de 0,5 tot 1 cm van beide uiteinden van de staart en verdeel de resterende staart omhoog in drie of vier stukken. Ontleden de pezen van de staarten en scheiden de pezen in individuele vezels met behulp van een scalpel of scheermesje.
- Breng de pees vezels om een steriele container en wassen met steriel gedistilleerd water. Transfer pezen van de staart van 5-7 muizen om een 50 ml conische buis met 35 ml steriel gedeïoniseerd water met 50 eenheden / ml penicilline penicilline, 50 ug / ml streptomycine en 250 ng / ml amfotericine, en 0.034 N azijnzuur verdund uit een voorraad oplossing van azijnzuur (17 N). Plaats op rocker bij 4 ° C voor een week om het collageen te halen.
- Spin down puin in een tafelblad centrifuge bij 3000 g gedurende 15 minuten. Overdracht supernatans, ongeveer 30 ml tot twee polycarbonaat buizen aangepast voor de Beckman 50,2 Ti rotor en de spin op 35.000 g (ongeveer 17.000 rpm) gedurende 1 uur.
- Het volume van het supernatans zal moeten worden teruggebracht tot een concentratie van 1-2 mg / ml te bereiken. Breng de bovenstaande om een ultracel 50 k Amicon filtratie-eenheid en de spin in een tafelblad centrifuge bij 3000 rpm gedurende 15 bij 4 ° C. Breng het filtraat over in een steriele conische buis en op te slaan. Herhaal het centrifugeren tot het volume is gereduceerd tot 5-6 ml.
- Lees het eiwit concentratie. We maken gebruik van een standaard Bradford assay (Biorad), met behulp van BSA normen (Biorad) en onverdunde monsters. Meet een monster van uw filtraat, als een negatieve controle.
- Verdere controle voor de zuiverheid van winning door middel van het oplossen van een steekproef van gezuiverd collageen op een 6% SDS-polyacrylamide gel, 10 banen, 1,5 mm dik gel. Bereid 20 pg van het monster in 30 ul 1x SDS-PAGE laadbuffer met 63 mM Tris-HCl 10% glycerol, 2% SDS 0,0025% broomfenolblauw in 1,5 ml Eppendorf-buisjes. Bereid een gelijke hoeveelheid eiwit uit rattenstaart collageen type I als een positieve controle. Daarnaast bereiden een reeks van BSA normen op 2,5, 5, 10, 20 pg verdund in PBS en 1X laadbuffer. Kook de monsters bij 95 ° C gedurende 5 minuten.
- Laat de monsters koel en kort microfuge (maximale snelheid voor 10 seconden) om spin down condensatie.
- Laad de stalen monsters, samen met een moleculair gewicht marker. Bijvoorbeeld, belasting 5 ul van Kaleidoscope Biorad eiwit standaard. Electrophorese op 150 volt voor ongeveer 1 uur of totdat de kleurstof voor de bodem bereikt.
- Verwijder de gel en de vlek in Coomassie blauwe buffer. Bereid deze buffer door het mengen van 2 g Coomassie blauwe, 75 ml ijsazijn, 500 ml ethanol in een totaal volume van 1000 ml met gedeïoniseerd water. Ook de voorbereiding van de dezelfde hoeveelheid destain buffer met behulp van het recept maar dan zonder Coomassie Blue reagens. Bedek de gel met een voldoende volume voor Coomassie blauw en leg ze op een rocker.
- Rock zachtjes gedurende 1 uur bij RT en decanteer de vlek. Vervang de destain oplossing wanneer het donker blauw wordt. 'S nachts vast te houden de gel of totdat de individuele banden worden opgelost op de gel. Zoek twee collageen bands (moleculaire gewichten = 90 kDa en 130 kDa) en let op de sterkte van de banden tegen de normen en controles. Het imago van de gel met behulp van een gel doc systeem, als dat nodig is.
2. Isolatie en de cultuur van de donor mammacarcinoom cellen en fibroblasten uit normale PyVmT C57BL/6J muizen
- Offer dezelfde leeftijd vrouwelijke normale of PyVmT transgene muizen na 10 weken van leeftijd bij tumoren zijn evident en voelbaar in PyVmT transgene muizen met behulp van erkende IACUC methoden.
- Expose met de muis op zijn rug op een vlakke ondergrond en de ledematen te immobiliseren met behulp van tape lijm.
- Maak een omgekeerde T-incisie tussen de tepels van de thoracale en inguinale borstklier en terug te trekken van de huid flap aan de melkklieren bloot te leggen. Verwijder de borstklieren weefsels en gehakt in kleine stukjes met behulp van chirurgische schaar.
- Bereiding van 100 ml van een enzymatische vertering cocktail bevat: 200 mg trypsine, 500 mg collagenase, 4 mg DNAse, 100.000 eenheden hyaluronidase in steriele PBS en antibiotica 's nachts op ijs en vervolgens gedurende 3 uur bij 37 ° C.
- Voeg 10 ml PBS, met 10% foetaal bovine serum (FBS) toe aan elk monster en centrifuge celpellet in een tafelblad centrifuge bij 1500 rpm gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Zuig voorzichtig het supernatant en resuspendeer de celpellet 5-7 ml PBS/10% FBS. Herhaal de spin en was twee keer.
- Resuspendeer de cel pellet in 10 ml DMEM met 10% FBS met 50 eenheden / ml penicilline, 50 ug / ml streptomycine en 250 ng / ml amfotericine op 10 cm schalen bekleed met collageen type I. Om vacht platen met collageen, verdun het collageen 1 ml (met behulp van aandelen 1,5 mg / ml) in 39 ml van 0,02 N azijnzuur opgelost in steriel gedestilleerd water of PBS. Pipetteer 5 ml van collageen werkende oplossing op 10 cm platen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende een minimum voor 10 minuten. Aspiratie teveel collageen. Parafilm ongebruikte platen en bewaren bij 4 ° C voor een week.
- Wijzig de media 2 - 3 keer per week. Succesvolle vertering van weefsels zal worden gekenmerkt door de aanwezigheid van epitheliale foci, omringd door spindel gevormde fibroblastische cellen.
- Scheid de fibroblasten en epitheelcellen door selectieve tryspinization. Aspireren van de media en een keer was de cellen met PBS. Pipetteer 1 ml van 0,25% trypsin/0.54 mM EDTA op cellen en incuberen bij kamertemperatuur. Fibroblasten zijn losser hechtende dan epitheelcellen. Controleer op fibroblast detachement onder de microscoop na 2 minuten cellen moet worden zwevend in suspensie of naar boven afgerond, terwijl epitheliale haarden moet nog steeds worden aangehouden aan de oppervlakte.
- Zachtjes tik op de schotel naar de fibroblasten en voorzichtig pipet 10 ml van serum bevattend medium in de schaal los te maken om de fibroblasten te verwijderen.
- Pipet de media die fibroblasten in een 15 ml conische buis en centrifugeer zoals beschreven in stap 5). Replate deze cellen op collageen gecoate 10 cm schalen en herhaal de selectieve behandeling met trypsine proces tot fibroblasten en epitheelcellen zijn volledig gescheiden.
- Controleer op cel zuiverheid immunofluorescentiekleuring voor epitheliale merkers zoals CK14 en CK18 en fibroblast merkers zoals alfa-gladde spiercel actine (α-SMA).
3. Immunofluorescentiekleuring van de gekweekte cellen
- Plaats dekglaasjes in 6 cm schalen. Steriliseren door UV blootstelling gedurende 5 tot 10 minuten in een laminaire stroming kap.
- De vacht van de dekglaasje met 1-2 ml van de werkvoorraad collageen-oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT). Aspireren eigen risico.
- Trypsinize en plaat 200.000 epitheelcellen of fibroblasten per monster. Voeg 3-5 ml van complete media en incubeer gedurende 24 uur.
- Aspireren van de media, wassen cellen met PBS en vast te stellen in ijskoude methanol bij -20 ° C gedurende 7 minuten.
- Was de cellen met PBS tweemaal op ethanol, en de blokkade te verwijderen met 1-2 ml PBS, met 1% FBS gedurende 1 uur bij RT.
- Met behulp van een tang, verwijder de dekglaasjes en leg in een grote ondiepe bak bedekt met parafilm of andere hydrofobe oppervlak.
- Verdun de volgende primaire antilichamen 1:100 in het blokkeren van oplossing: anti-gladde spier actine (α-SMA, anti-CK14 (basale epitheliale marker), anti-CK18 (luminale epitheel marker).
- Pipetteer 100 ul van antilichamen direct op de dekglaasjes gedurende 1 uur bij RT. Incubeer een aparte dekglaasje van cellen in het blokkeren oplossing; dit voorbeeld zal dienen als het secundaire antilichaam te controleren.
- Aspireren antilichaam en pipet 1 ml PBS direct op de dekglaasje te wassen. Aspireren en herhaal 3-5 keer.
- Verdun de volgende secundaire antilichamen in het blokkeren van oplossing: anti-muis-alexa 488 op 1:100, anti-muis gebiotinyleerd op 1: 500, anti-muis-alexa-568.
- Wikkel de container met de dekglaasjes in aluminiumfolie. Pipetteer 100 ul van een passende secundaire antilichaam direct op de dekglaasjes: α-sma met anti-muis-alexa 568, CK 14 kleuring met anti-muis gebiotinyleerde en CK18 met anti-muis-alexa 488. Bedek de container om de monsters te beschermen tegen het zichtbare licht.
- Aspireren antilichaam en wassen met PBS als in stap 9). Laat de monsters in PBS, behalve voor CK14 kleuring.
- Verdunnen streptavidine geconjugeerd aan alexa 568 1:500 in PBS. Incubeer de CK14 gekleurde monsters met strepatividin-alexa 568 gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Wassen in PBS als in stap 9)
- Verdunnen DAPI 1: 500 in PBS. Zuig het PBS van de monsters en incubeer met DAPI gedurende 10 minuten RT in het donker.
- Spoel monsters met PBS. Pipetteer 100 ul Verleng anti-fade reagens op glazen objectglaasjes, draai de dekglaasje om, zodat de cellen worden geconfronteerd met het glaasje. Kantel de dekglaasje om een hoek om voorzichtig contact te maken met de montage media.
- Het imago van de monsters met behulp van een immunofluorescentie microscoop. Bewaar de monsters in het donker naar de immunofluorescentie signaal, dat duurt ongeveer 2 weken te beschermen.
4. De voorbereiding van collageen embedded cellen voor transplantatie
- Te verankeren in de cellen collageen, is het noodzakelijk om de pH van het collageen te verlagen tot polymerisatie te bereiken door het mengen van de collageen met een instelling oplossing. Bereid de instelling oplossing door het mengen van 100 ml van de Balanced 10X Earl's Salt Solution (EBSS) met 2,45 g NaHCO3, 7,5 ml van 1 M NaOH en 42,5 ml steriel gedistilleerd water. Verder steriliseren met behulp van een fles top 0,22 micron filter gekoppeld aan een steriele fles. <li> Meng het collageen (stock concentratie van 1 mg / ml) met het instellen van een oplossing bij start 4: 1-ratio. Voor een transplantaat, mix 100 ul van collageen met 25 ul van de instelling oplossing in een eppendorfbuisje. Vortex kort of pipet het monster op en neer om het monster goed te mengen.
- Voeg collageen of instelling oplossing op 5-10 ul stappen en meng goed tot de fenol rode kleurstof in het mengsel verandert in een licht roze tot oranje kleur, als gevolg van een neutrale pH. Een gele kleur geeft zure pH-waarde, terwijl donkerroze weerspiegelt basische pH. Houd het mengsel op ijs om polymerisatie te voorkomen.
- Verwijder de fibroblasten en epitheelcellen van de plaat door behandeling met trypsine. De eerste, aspireren de media en was met 5 ml PBS. Pipetteer 1 ml van 0,25% trypsin/0.54 mM EDTA in HBSS per plaat. Incubeer fibroblasten bij KT 2-5 minuten. Incubeer epitheelcellen bij 37 ° C voor 2-6 minuten. Tik zachtjes tegen de platen om de cellen los te maken. Controleer voor het detachement met behulp van een microscope.Quench de trypsine door pipetteren 9 ml compleet medium op de plaat en de overdracht van de cellen in een steriele 15 ml conische buis.
- Verwijder de 50 ul en tel de cellen door hemocytometer. Let op het totale volume van de cellen in elke buis (ongeveer 10 ml).
- Pellet de cellen bij 1500 rpm gedurende 5 min bij RT. Zuig het celpellet en resuspendeer de cellen tot een concentratie van 100.000 cells/100 ul. Bijvoorbeeld, resuspendeer 500.000 cellen in een totaal volume van 500 ul van complete media.
- Mix 250.000 stromale cellen (250 ui) en 100.000 tumorcellen (100 pi) in een aparte buis. Microfuge 10 sec 1000 rpm, verwijder supernatant door pipetteren. Voeg 50 ul van de aangepaste collageen oplossing cellen. Pipet op en neer om gelijkmatig verspreiden van de cellen. Pipetteer de 50 ui in een steriele 6 cm weefselkweek plaat aan een ronde druppel te vormen. Incubeer het transplantaat bij 37 ° C gedurende 10 minuten te polymeriseren.
- Zachtjes voeg 5 ml van de volledige media in de plaat door het kantelen van de plaat in een hoek en langzaam pipetteren de media door de ene kant van de plaat. Kantel de plaat rond totdat de media omvat het transplantaat.
- Incubeer 24 uur bij 37 ° C. Transplant onmiddellijk.
5. Orthoptische transplantatie van collageen ingebed cellen in C57BL/6J muizen
- Fabriceren een dunne glazen staaf voor de transplantatie. Verhit een glas Pasteur pipet met behulp van een bunsenbrander. Met behulp van een tang, rek het einde van de pipet uit naar 2-3 mm in dikte. Laat afkoelen, en steriliseer met 70% ethanol.
- Steriliseer de volgende chirurgische instrumenten in de autoclaaf en 70% ethanol: fijne chirurgische schaar, stomp chirurgische schaar, stomp pincet, dunne tang, wond clips, wond nietje
- Verdoven met behulp van de muis met 2-3% isofluraan met behulp van een isofluraan scavenging machine. De gemiddelde O 2 gebruikte debiet is een L / minuut via de neus.
- Leg de muis op zijn rug en de ledematen te immobiliseren met tape of andere verwijderbare lijm. Verwijder het haar met chemische haren remover, zoals Nair. Steriliseer de buik met katoen zwabberen afwisselend tussen de 70% ethanol en betadine in een target-achtige manier.
- Houd een deel van de huid door de borstklier met stompe tang met een hand. Met de andere hand, om een kop met stompe chirurgische schaar te maken naar T-incisie tussen de # 9 en # 10 tepels of # 4 en # 5 tepels van de lies melkklieren aan de melkklieren bloot te leggen.
- Maak een pocket incisie onder de lymfeklier of mamma-arterie met een kleine chirurgische voorjaar schaar.
- Haal de collageen transplantaat uit de weefselkweek schotel met behulp van een tang. Verwijder de overtollige vloeistof uit de collageen transplantaat door voorzichtig deppen op een steriele veeg en volledig de collageen transplantaat in de zak glijden met behulp van een dunne glazen staaf.
- Suture van de huid met behulp van flap # 2 darm absorbeerbare hechtingen of nietjes wond.
- Laat de muis terug in de kooi.
- Monitor de muizen twee keer per week bij een minimum, betasten voor tumoren. Offer de muizen als de tumoren oplopen tot 1 cm in diameter. Oogst weefsels voor analyse.
6. Representatieve resultaten:
Isolatie en extractie van collageen uit C57BL/6J muizen
Deze procedures werden aangepast van 1. Extractie van collageen eiwit 5-7 muis staart levert ongeveer 1-1,5 mg / ml in een 6 ml eindvolume, of 6 - 9 mg eiwit. Door coommassie vlek, bands die overeenkomen met 90 kDa en 130 kDa worden gedetecteerd in de steegjes vol met monsters uit de muis staarten, wijst op de aanwezigheid van collageen type I en pro-collageen respectievelijk (Figuur 1).
Isolatie en cultuur van mammacarcinoom cellen en fibroblasten uit normale PyVmT C57BL/6J muizen.
De procedures werden aangepast van 2. PyVmT carcinoom cellen en fibroblasten kunnen worden onderscheiden door verschillen in de cel morfologie en expressie van specifieke epitheliale en mesenchymale markers. PyVmT carcinoom cellen worden geïdentificeerd door kasseien vorm en co-express CK18, een luminale epitheel marker en CK14, een basale epitheliale marker, maar niet uitdrukken α-SMA (figuur 2). Borstklieren fibroblasten zijn groter cellen met een spindel gevormde fenotype en uitdrukkelijke hoge niveaus van α-SMA, maar spreken zich niet uit CK14 of CK 18 (figuur 2). Deze gegevens wijzen op meer dan 95% cel zuiverheid van fibroblasten en epitheelcellen met behulp van de geschetste procedures.
Orthoptische transplantatie van collageen ingebed cellen in C57BL/6J muizen
Deze procedures werden aangepast van 3, 4. Transplantatie ontvangende muizen worden opgeofferd wanneer tumoren in beide experimentele groep 1,0 cm in diameter, of ongeveer 60 dagen te bereiken. Terwijl de transplantatie van PyVmT cellen alleen resulteert in voelbare tumoren na 30 - 40 dagen, het bereiken van een gemiddelde tumor massa van 0.335 gram op 60 dagen, co-transplantatie van PyVmT carcinoom cellen met mamma-fibroblasten resulteert in een gemiddelde tumor massa van 0.630 gram, met vermelding van enhancement van tumorgroei door de fibroblasten (Figuur 3).
Figuur 1. Coomassie vlek analyse van collageen type I-extractie uit muis staarten. BSA (~ 66 kDa) wordt aangegeven door pijl. Commerciële rattenstaart collageen (20 ug eiwit), en gezuiverd muis staart collageen (20 ug eiwit) worden aangeduid met doos (~ 130 kDa, ~ 90 kDa eiwitten). Std = moleculair gewicht standaard.
Figuur 2. Immunofluorescentiekleuring van de donor PyVmT mammacarcinoom cellen en fibroblasten. Panels a en b vertegenwoordigen PyVmT mammacarcinoom cellen immunostained op antilichamen tegen CK14 en CK18. Paneel C staat voor fibroblasten gekleurd met antilichamen tegen α-sma. Getoonde afbeeldingen met DAPI overlay op een vergroting van 20x.
Figuur 3. Mammatumor ontwikkeling in C57BL/6J muizen in de aanwezigheid of afwezigheid van de fibroblasten. Borsttumoren werden geoogst uit muizen die getransplanteerd met PyVmT carcinoom cellen in de aanwezigheid of afwezigheid van mammaire fibroblasten en gewogen. Gemiddelde + standaardfout van het gemiddelde. N = 6 per groep.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De functionele bijdrage van fibroblasten in tumorprogressie is aangetoond door middel van transplantatie-modellen, waarbij carcinoom geassocieerd fibroblasten co-getransplanteerd met goedaardige mamma-epitheliale cellen resulteert in een verhoogde groei van de tumor en invasiviteit 5. Conventionele transplantatie benaderingen hebben betrokken van het gebruik van SCID muizen of naakt aan co-transplantatie stromale en epitheelcellen van verschillende genetische muis achtergronden of verschillende soorten. Immuungecompromitteerde muizen gebrek aan functionele T-cellen, welke kritische rol spelen in het bemiddelen anti-tumor immuniteit via de erkenning van de tumor specifieke antigenen en de daaropvolgende targeting van tumorcellen, het remmen van metastatische verspreiding 6. Bovendien, de recente studies hebben aangetoond dat fibroblasten zijn belangrijke regulatoren van het immuunsysteem cel werving 7, 8, wat aangeeft dat de ontwikkeling van nieuwe benaderingen van stromale studie: epitheliale cel interacties zijn nodig om beter te begrijpen van de mechanismen van borstkanker progressie. De geschetste procedures aan te tonen een betrouwbare methode om: isoleren en cultuur borstklieren epitheliale en mesenchymale cellen en orthotopically deze cellen transplantatie in immunocompetente muizen om borsttumoren te vormen. Met behulp van de beschreven procedures, hebben we geënt meer dan 40 muizen met behulp van verschillende experimentele groepen en verschillende eindpunten met meer dan een 97% succesvolle transplantatie tarief, waaruit de betrouwbaarheid van dit systeem. De effecten van mamma fibroblasten op de tumorgroei in dit systeem zijn consistent met eerder gepubliceerde studies met subrenal capsule enten van fibroblasten met mammacarcinoom cellen 9. Wij hebben gevonden weinig zorgen met het systeem in dit rapport. Als de concentratie van de resulterende bestand is te laag voor het inbedden van cellen, kan een verdere concentratie van de collageen op een lager volume of isoleren meer collageen uit extra staarten. Om te zorgen voor consistente tumorvorming, is het belangrijk om de cellen te verspreiden gelijkmatig in het collageen stekker in de collageen door pipetteren en de aanwezigheid van belletjes in de collageen stekker te voorkomen.
De lage achtergrond van tumorvorming in C57BL/6J muizen 10, 11 stelt ons in staat om te onderzoeken de functionele bijdrage van specifieke oncogenen of inactivatie van tumorsuppressoren in stromale: epitheliale interacties tijdens borstkanker progressie. Expressie van specifieke oncogenen en tumor onderdrukkers kunnen worden gewijzigd in stromale cellen of epitheelcellen door middel van stabiele expressie van siRNA's bijvoorbeeld, voorafgaand aan de transplantatie. Omdat de primaire cellen senesce met voortdurende passage, genetische manipulatie van gekweekte cellen is gemakkelijker als de cellen zijn onsterfelijk, bijvoorbeeld door middel van spontane immortalisatie of expressie van een oncogen 12, 13, 14, 15. Immortalisatie van verschillende stromale celtypes is bereikt met macrofagen en endotheelcellen 16, 17, 18. Immunofluorescentiekleuring voor specifieke stromale en epitheliale markers onthulde sterk gezuiverde populaties van fibroblasten en epitheelcellen geïsoleerd in deze studies. Echter, de identificatie van vervuilende celpopulaties vereisen het gebruik van stroom sorteren om verder te zuiveren van de gewenste cel populaties. Als alternatief voor immortalisatie en genetische manipulatie in de cultuur, hebben onderzoekers ook geïsoleerd specifieke celtypen van transgene muizen doorstroming sorteren en direct getransplanteerd deze cellen in muizen voor de studie van de verschillende weefsels, waaronder de borstklier 19, 20. Deze aanpak Deze aanpak levert fysiologisch relevante primaire cellen, maar vereist isolatie van cellen van muizen per keer. Echter, het aanbod van cellen en de zuiverheid van celpopulaties zijn afhankelijk van de overvloed van het celtype en over het aantal muizen beschikbaar. Deze uitdagingen kunnen worden overwonnen met transplantatie van tumorcellen in muizen die fluorescerende reporter, zoals actine-GFP muizen 21. In dit systeem, zou men in staat zijn om de effecten van het totale stroma op tumorprogressie te onderzoeken, maar geen onderscheid tussen de bijdrage van specifieke stromale cellen. Elk van de benaderingen wordt geleverd met specifieke voor-en nadelen, en kan worden gecombineerd met het systeem zoals beschreven in dit rapport, volgens de onderzoekers nodig heeft. Daarnaast kan het beschreven systeem worden aangepast of gewijzigd voor transplantatie in verschillende genetische achtergronden, transplantatie van verschillende stromale celtypen en de borstklieren epitheelcellen op verschillende staten van maligniteit te bepalen hoe deze verschillende variabelen invloed hebben op stromale: epitheel interacties en de daaropvolgende tumorprogressie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dierproeven:
Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de IACUC commissie van de Universiteit van Kansas Medical Center in te stellen.
Acknowledgments
Dit project werd gefinancierd door middel van door NIH / NCI verlenen nummer R00 CA127357 en de Universiteit van Kansas Cancer Center Endowment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6N mice | Harlan Laboratories | N/A | |
| MMTV-PyVmT transgenic mice | Jackson Laboratory | 002374 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3039603PR | |
| DMEM | VWR international | 10000113873 | |
| Penicillin/streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-001 | |
| amphotericin | Fisher Scientific | BP2645-20 | |
| Amicon filtration columns ultracel 50k | EMD Millipore | UFC905008 | |
| Tubes for Beckman TI rotor | Beckman Coulter Inc. | 355618 | |
| Rat tail collagen | Fisher Scientific | CB 40236 | |
| 10x EBSS | Sigma-Aldrich | E7510-100ML | |
| Trypsin 1X, 0.25% in HBSS w/o Calcium and Magnesium | Fisher Scientific | MT-25-050-CI | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A491-212 | |
| Coomasie blue | Fisher Scientific | BP101 25 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T3924-100ml | |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich | ||
| hyalronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Kaleidoscope Protein standard | Bio-Rad | 1610375 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12545-78 | |
| Glass coverslips | VWR international | 101400-042 | |
| Vimentin antibody S-20 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-7558 | |
| α-smooth muscle actin antibody | Abcam | ab5694 | |
| CK14 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-53253 | |
| CK18 antibody | Abcam | ab668 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Anti-mouse biotinylated | Vector Laboratories | BA9200 | Distributed through Fisher |
| Anti-mouse-alexa-568 | Invitrogen | A10037 | |
| Anti-mouse- alexa-488 | Invitrogen | A11001 | |
| Streptavidin- alexa-488 | Invitrogen | S11226 | |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | |
| Prolong antifade | Invitrogen | P-36930 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-12 | |
| Fine spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| # 5 fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Gut chromic suture | Fisher Scientific | NC9326254 | |
| Glass Pasteur pipet | Fisher Scientific | 22-042-815 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A406P 4 | |
| betadine | Fisher Scientific | NC9386574 | |
| Wound clips | Fisher Scientific | 12032-07 | |
| Wound staple | Fisher Scientific | 12031-07 |
References
- Hayward, S., Haughney, P. C., Rosen, M. A., Greulich, K. M., Weier, H. U., Dahiya, R., Cunha, G. R. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-131 (1998).
- Cunha, G., Hom, Y. K., Young, P., Brody, J. Methods in Mammary Gland Biology. Asch, B. B., Ip, M. M. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. (2000).
- Ethier, S. P., Ammerman, C. A., Dziubinski, M. L. Methods in Mammary Gland Biology. Asch, B. B., Ip, M. M. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. (2000).
- Medina, D., Kittrell, F. Methods in Mammary Gland Biology. Asch, B. B., Ip, M. M. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. (2000).
- Kalluri, R., Zeisberg, M.
- DeNardo, D. G., Johansson, M., Coussens, L. M. Immune cells as mediators of solid tumor metastasis. Cancer Metastasis. 27, 11-18 (2008).
- Naito, M. Macrophage differentiation and function in health and disease. Pathol Int. 58, 143-155 (2008).
- Firestein, G. S. The T cell cometh: interplay between adaptive immunity and cytokine networks in rheumatoid arthritis. J Clin Invest. 114, 471-474 (2004).
- Cheng, N., Chytil, A., Shyr, Y., Joly, A., Moses, H. L. Enhanced Hepatocyte Growth Factor Signaling by Type II Transforming Growth Factor-{beta} Receptor Knockout Fibroblasts Promotes Mammary Tumorigenesis. Cancer Res. 67, 4869-4877 (2007).
- Qiu, T. H. Global expression profiling identifies signatures of tumor virulence in MMTV-PyMT-transgenic mice: correlation to human disease. Cancer Res. 64, 5973-5981 (2004).
- Schaffhausen, B. S., Roberts, T. M. Lessons from polyoma middle T antigen on signaling and transformation: A DNA tumor virus contribution to the war on cancer. Virology. 384, 304-316 (2009).
- Cepko, C. L. Immortalization of neural cells via retrovirus-mediated oncogene transduction. Annu Rev Neurosci. 12, 47-65 (1989).
- O'Hare, M. J. Conditional immortalization of freshly isolated human mammary fibroblasts and endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 646-651 (2001).
- Shay, J. W., Wright, W. E., Werbin, H. Defining the molecular mechanisms of human cell immortalization. Biochim Biophys Acta. 1072, 1-7 (1991).
- Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis. Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).
- Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
- Shen, G. Immortalization of endothelial cells differentiated from mouse embryonic stem cells. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 218-228 (2002).
- Wang, S. J., Greer, P., Auerbach, R. Isolation and propagation of yolk-sac-derived endothelial cells from a hypervascular transgenic mouse expressing a gain-of-function fps/fes proto-oncogene. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32, 292-299 (1996).
- Tiede, B. J., Owens, L. A., Li, F., DeCoste, C., Kang, Y. A novel mouse model for non-invasive single marker tracking of mammary stem cells in vivo reveals stem cell dynamics throughout pregnancy. PLoS One. 4, e8035-e8035 (2009).
- Guzman, R. Intracarotid injection of fluorescence activated cell-sorted CD49d-positive neural stem cells improves targeted cell delivery and behavior after stroke in a mouse stroke model. Stroke. 39, 1300-1306 (2008).
- Duda, D. G. Differential transplantability of tumor-associated stromal cells. Cancer Res. 64, 5920-5924 (2004).
