Summary
In questo rapporto, si dimostra un sistema per isolare la cultura e le cellule del donatore dalla ghiandola mammaria del mouse, e ortotopicamente trapianto di queste cellule in topi riceventi per analizzare stromali: interazioni epiteliali durante lo sviluppo del tumore mammario.
Abstract
L'influenza delle cellule stromali, inclusi i fibroblasti sulla progressione del tumore mammario è stato ben documentato attraverso l'utilizzo di modelli murini, in particolare attraverso il trapianto di cellule stromali e le cellule epiteliali della ghiandola mammaria di topo. Modelli trapianto attuali che prevedono l'utilizzo di topi immunocompromessi a causa della diversa provenienza genetica delle cellule stromali e cellule epiteliali. Matrici extracellulari sono spesso utilizzati per incorporare i due tipi di cellule diverse per coerenza interazioni cellula-cellula, ma implicano l'uso di Matrigel o collagene coda di ratto, che sono substrati immunogenico. La mancanza di funzionalità delle cellule T di topi immunocompromessi impedisce una valutazione accurata delle cellule stromali sulla progressione del tumore della mammella in vivo, con importanti implicazioni sullo sviluppo di farmaci e l'efficacia. Inoltre, i topi immunocompromessi sono costosi, difficili da allevare e richiedono condizioni di particolare attenzione. Per superare questi ostacoli, abbiamo sviluppato un approccio alla ortotopicamente trapianto di cellule stromali e le cellule epiteliali in topi dallo sfondo stesso genetico di indurre la formazione costante del tumore. Questo sistema prevede la raccolta normale, carcinoma fibroblasti associati, PyVmT cellule di carcinoma mammario e del collagene da donatore topi C57BL/6J. Le cellule sono poi integrati nel collagene e trapiantati nelle ghiandole inguinali mammaria di topo femmina C57BL/6J. Il trapianto di cellule PyVmT solo formare tumori palpabile 30-40 giorni dopo il trapianto. Analisi degli endpoint a 60 giorni indicano che la co-trapianto con fibroblasti favorisce la crescita del tumore mammario rispetto alle cellule trapiantate PyVmT solo. Mentre le cellule e la matrice di topi C57BL/6J sono stati utilizzati in questi studi, l'isolamento delle cellule e la matrice e l'approccio trapianto può essere applicato nei confronti topi provenienti da diversi background genetico dimostrando versatilità. In sintesi, questo sistema può essere utilizzato per studiare le interazioni molecolari tra cellule stromali e le cellule epiteliali, e supera i limiti critici in modelli di topi immunocompromessi.
Protocol
1. L'isolamento e l'estrazione del collagene donatore di topi C57BL/6J
- Sacrificio matura normali topi di sesso femminile C57BL/6J utilizzando metodi approvati IACUC.
- Raccolta le code e immergersi in etanolo al 70% per 45 minuti per sterilizzare i tessuti. Asciugare le code con carta velina, avvolgerlo in un foglio di alluminio. Conservare le code a -20 ° C fino al momento dell'uso.
- Mettere le code in un ambiente sterile come una cappa a flusso laminare. Utilizzando le forbici, dividere la pelle alla radice della coda e staccarsi dalla coda. Rimuovere 0,5 a 1 cm da entrambe le estremità della coda e dividere la coda rimanenti in tre o quattro pezzi. Sezionare i tendini dalle code e separare i tendini in singole fibre utilizzando una lama di bisturi o un rasoio.
- Trasferire le fibre del tendine di un contenitore sterile e lavare con acqua distillata sterile. Tendini trasferimento dalla coda dei topi 5-7 per un tubo 50 ml contenente 35 ml sterile acqua deionizzata contenenti 50 unità / ml di penicillina penicillina, 50 mg / ml di streptomicina e 250 ng / ml di amfotericina, e 0,034 N acido acetico diluito una soluzione stock di acido acetico glaciale (17 N). Luogo il rocker a 4 ° C per una settimana per estrarre il collagene.
- Spin down detriti in una centrifuga da tavolo a 3000 g per 15 minuti. Trasferire il surnatante, circa 30 ml a due tubi in policarbonato adattato per il rotore 50,2 Beckman Ti e girare a 35.000 g (circa 17000 rpm) per 1 ora.
- Il volume del surnatante dovrà essere ridotto a raggiungere una concentrazione di 1-2 mg / ml. Trasferire il surnatante in un ultracel 50 unità di filtrazione k Amicon e spin in una centrifuga da tavolo a 3000 rpm per 15 a 4 ° C. Trasferire il filtrato in una provetta sterile conica e salvare. Ripetere la centrifugazione fino a quando il volume è ridotto a 5-6 ml.
- Leggi la concentrazione di proteine. Usiamo un test standard di Bradford (Biorad), utilizzando standard di BSA (Biorad) e campioni non diluiti. Misurare un campione dal filtrato, come controllo negativo.
- Ulteriore controllo per la purezza di estrazione, risolvendo un campione di collagene purificato su gel di poliacrilammide al 6% SDS, 10 corsie, spessore 1,5 gel mm. Preparare 20 mg di campione in 30 microlitri 1x SDS-PAGE tampone di caricamento glicerolo contenente 63 mM Tris HCl 10%, 2% SDS blu 0,0025% bromofenolo in 1,5 ml provette Eppendorf. Preparare una quantità equivalente di proteine da collagene di tipo coda di topo io come controllo positivo. Inoltre, preparare una serie di standard BSA a 2,5, 5, 10, 20 mg diluito in PBS e tampone di caricamento 1X. Bollire i campioni a 95 ° C per 5 minuti.
- Lasciate raffreddare i campioni e brevemente microcentrifuga (velocità massima per 10 secondi) di rallentare condensa.
- Caricare i campioni campioni insieme ad un marcatore di peso molecolare. Per esempio, carico 5 ml di standard di proteine Biorad Caleidoscopio. Elettroforesi a 150 volt per circa 1 ora o fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo.
- Rimuovere il gel e macchia nel buffer Coomassie blu. Preparare questo buffer mescolando 2 g di Coomassie blu, 75 ml di acido acetico glaciale, 500 ml di etanolo in un volume totale di 1000 ml contenente acqua deionizzata. Anche preparare la stessa quantità di tampone Decolorare utilizzando la ricetta, tranne senza reagente Coomassie blu. Coprire il gel con un volume sufficiente per Coomassie blu e posto su una sedia a dondolo.
- Roccia dolcemente per 1 ora a temperatura ambiente e decantare la macchia. Sostituire la soluzione Decolorare quando diventa blu scuro. Trattenere il gel durante la notte o fino a quando le singole bande sono risolte sul gel. Individuare due fasce di collagene (peso molecolare = 90 kDa e 130 kDa) e nota la forza delle bande contro le norme ei controlli. L'immagine del gel mediante un sistema di gel doc, se necessario.
2. Isolamento e la coltura delle cellule di carcinoma mammario donatore e da fibroblasti normali e topi PyVmT C57BL/6J
- Età sacrificio corrispondente femminile topi normali o transgenici PyVmT dopo 10 settimane di età quando i tumori sono evidenti e tangibili in PyVmT topi transgenici con metodi approvati IACUC.
- Esporre il mouse sulla sua schiena su una superficie piana e immobilizzare gli arti con nastro adesivo.
- Effettuare una incisione a T rovesciata tra i capezzoli della ghiandola mammaria toracica e inguinale e tirare il lembo cutaneo torna ad esporre le ghiandole mammarie. Rimuovere i tessuti mammari e tritare in piccoli pezzi con le forbici chirurgiche.
- Preparare 100 ml di un cocktail digestione enzimatica contenente: 200 mg tripsina, collagenasi 500 mg, 4 mg DNAsi, 100.000 unità ialuronidasi in PBS sterile e antibiotici durante la notte sul ghiaccio e poi per 3 ore a 37 ° C.
- Aggiungere 10 ml di PBS contenente 10% di siero fetale bovino (FBS) per ogni campione e centrifuga pellet di cellule in una centrifuga da tavolo a 1500 rpm per 5 minuti a 4 ° C.
- Aspirare delicatamente il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 5-7 ml di FBS% PBS/10. Ripetere lo spin e lavare due volte.
- Risospendere il pellet cellulare in 10 ml di DMEM contenente 10% FBS contenente 50 unità / ml di penicillina, 50 mg / ml di streptomicina e 250 ng / ml di amfotericina in 10 piatti centimetri rivestito con collagene di tipo I. Per piastre cappotto con il collagene, diluire il 1 ml di collagene (utilizzando magazzino 1,5 mg / ml) in 39 ml di 0,02 N acido acetico diluito in acqua distillata sterile o PBS. Pipettare 5 ml di soluzione di collagene di lavoro su 10 piatti cm. Incubare a temperatura ambiente per un minimo di 10 minuti. Aspirare collagene in eccesso. Piastre Parafilm inutilizzati e conservare a 4 ° C per una settimana.
- Cambiare il supporto 2 - 3 volte a settimana. Digestione successo dei tessuti sarà caratterizzata dalla presenza di focolai epiteliali circondate da cellule a forma di fuso fibroblastica.
- Separare i fibroblasti e cellule epiteliali da tryspinization selettiva. Aspirare i media e lavare le cellule con PBS una volta. Pipettare 1 ml di 0,25% trypsin/0.54 mM EDTA su cellule e incubare a temperatura ambiente. I fibroblasti sono più liberamente aderenti rispetto alle cellule epiteliali. Verificare la presenza di distacco fibroblasti al microscopio dopo 2 minuti, le cellule devono galleggiare in sospensione o arrotondato, mentre focolai epiteliale dovrebbe essere ancora aderito alla superficie.
- Toccare leggermente il piatto per allentare i fibroblasti e delicatamente pipetta 10 ml di siero supporto contenente nel piatto per rimuovere i fibroblasti.
- Pipettare il supporto contenente fibroblasti in un tubo da 15 ml e centrifugare come descritto al punto 5). Replate queste cellule sul collagene rivestito 10 piatti cm e ripetere il processo selettivo tripsinizzazione fino fibroblasti e cellule epiteliali sono completamente separati.
- Verificare la purezza delle cellule di immunofluorescenza per i marcatori epiteliali come CK14 e CK18 e marcatori dei fibroblasti, come actina alfa del muscolo liscio (α-SMA).
3. Immunofluorescenza di cellule in coltura
- Luogo coprioggetto di vetro in 6 piatti cm. Sterilizzare dall'esposizione ai raggi UV per 5 o 10 minuti in una cappa a flusso laminare.
- Rivestire il coprioggetto con 1-2 ml di soluzione madre di lavoro collagene per 10 minuti a temperatura ambiente (RT). Aspirare in eccesso.
- Trypsinize e la piastra di 200.000 cellule epiteliali e fibroblasti per campione. Aggiungere 3-5 ml di mezzi di comunicazione completa e incubare per 24 ore.
- Aspirare i media, lavare le cellule con PBS e fissare in metanolo ghiaccio freddo a -20 ° C per 7 minuti.
- Lavare le cellule con PBS due volte per eliminare l'etanolo, e bloccare con 1-2 ml di PBS contenente l'1% FBS per 1 ora a temperatura ambiente.
- Utilizzando pinze, rimuovere i coprioggetti e posto in un grande contenitore poco profondo coperto con parafilm o superficie idrofoba altri.
- Diluire i seguenti anticorpi primari 1:100 in soluzione bloccante: anti-actina del muscolo liscio (α-SMA, anti-CK14 (basale marcatore epiteliale), anti-CK18 (luminale marcatore epiteliale).
- Pipettare 100 l di anticorpi direttamente sul coprioggetto per 1 ora a temperatura ambiente. Incubare un coprioggetto separata di cellule in soluzione di blocco; questo campione servirà come controllo anticorpo secondario.
- Aspirare anticorpo e pipetta 1 ml di PBS direttamente sul vetrino da lavare. Aspirare e ripetere 3-5 volte.
- Diluire i seguenti anticorpi secondari in soluzione bloccante: anti-topo-alexa 488 a 1:100, anti-topo biotinilato a 1: 500, anti-topo-Alexa-568.
- Avvolgete il contenitore con il coprioggetto in foglio di alluminio. Pipettare 100 l di appropriati anticorpi secondari direttamente sul coprioggetto: α-SMA con anti-topo-Alexa 568, CK 14 colorazione con anti-topo biotinilato e CK18 con anti-topo-alexa 488. Coprire il contenitore per proteggere i campioni dalla luce visibile.
- Aspirare anticorpi e lavare con PBS come al punto 9). Lasciare i campioni in PBS, fatta eccezione per CK14 colorazione.
- Diluire streptavidina coniugata con Alexa 568 1:500 in PBS. Incubare la CK14 campioni colorati con strepatividin-alexa 568 per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Lavare in PBS come al punto 9)
- Diluire DAPI 1: 500 in PBS. Aspirare il PBS dai campioni e incubare con DAPI per 10 minuti RT al buio.
- Lavare i campioni con PBS. Pipettare 100 l di prolungare anti-sbiadimento reattivo sul vetrino, girare il coprioggetto sopra in modo che le cellule si trovano ad affrontare il vetrino. Inclinare il coprioggetto a un solo angolo per fare delicatamente contatto con i media di montaggio.
- Immagine i campioni utilizzando un microscopio immunofluorescenza. Conservare i campioni al buio per proteggere il segnale di immunofluorescenza, che durerà circa 2 settimane.
4. Preparazione delle cellule collagene embedded per l'innesto
- Per incorporare le cellule del collagene, è necessario abbassare il pH del collagene per ottenere polimerizzazione mescolando il collagene con una soluzione di impostazione. Preparare la soluzione impostazione mescolando 100 ml di soluzione salina bilanciata Earl di 10X (EBSS) con 2,45 g di NaHCO3, 7,5 ml di NaOH 1 M e 42,5 ml di acqua distillata sterile. Ulteriori sterilizzare con un top bottiglia 0,22 unità filtro micron attaccato ad una bottiglia sterile. <li> Mescolare il collagene (azione concentrazione di 1 mg / ml) con impostazione soluzione a partire 4: 1 rapporto. Per un trapianto, mescolare 100 ml di collagene con 25 ml di impostazione soluzione in una provetta Eppendorf. Vortex brevemente o pipettare il campione su e giù per mescolare il campione accuratamente.
- Aggiungi collagene o soluzione impostazione in incrementi di 5-10 microlitri e mescolare bene fino a quando il colorante rosso fenolo nella colorazione passa ad un rosa chiaro al colore arancione, riflettendo un pH neutro. Un colore giallo indica pH acido, mentre rosa scuro riflette pH basico. Mantenere la miscela in ghiaccio per prevenire la polimerizzazione.
- Rimuovere i fibroblasti e cellule epiteliali dalla piastra da tripsinizzazione. In primo luogo, aspirare i media e lavare con 5 ml di PBS. Pipettare 1 ml di 0,25% trypsin/0.54 mM EDTA in HBSS per piastra. Fibroblasti incubare a temperatura ambiente per 2-5 minuti. Incubare cellule epiteliali a 37 ° C per 2-6 minuti. Toccare le piastre leggermente per allentare le cellule. Verificare la presenza di distacco con una microscope.Quench la tripsina pipettando 9 ml di terreno completo sul piatto e trasferire le cellule ad una sterile tubo 15 ml.
- Togliere 50 ul e contare le cellule emocitometro. Si noti il volume totale di cellule in ogni tubo (circa 10 ml).
- Agglomerare le cellule a 1500 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il pellet e risospendere le cellule ad una concentrazione di 100.000 cells/100 microlitri. Per esempio, 500.000 risospendere le cellule in un volume totale di 500 ml di mezzi di comunicazione completo.
- Mix 250.000 cellule stromali (250 microlitri) e 100.000 cellule tumorali (100 l) in un tubo separato. Microcentrifuga 10 sec rpm 1000, rimuovere il surnatante pipettando. Aggiungere 50 microlitri della soluzione del collagene regolato cellule. Pipettare su e giù per disperdere le cellule in modo uniforme. Pipettare i 50 microlitri di una piastra di coltura sterile 6 centimetri di tessuto per formare una goccia circolare. Incubare l'innesto a 37 ° C per 10 minuti per polimerizzare.
- Delicatamente aggiungere 5 ml di supporti completo nella piastra inclinando la piastra in un angolo e lentamente pipettaggio i media da un lato del piatto. Inclinare il piatto circa fino a quando i media copre l'innesto.
- Incubare per 24 ore a 37 ° C. Trapianto immediatamente.
5. Ortottica trapianto di cellule collagene incorporate nei topi C57BL/6J
- Realizzare una canna sottile di vetro per la chirurgia dei trapianti. Scaldare una pipetta Pasteur di vetro con un becco Bunsen. Utilizzando pinze, tratto alla fine della pipetta fuori a 2-3 mm di spessore. Lasciate raffreddare, e sterilizzare in etanolo al 70%.
- Sterilizzare i seguenti strumenti chirurgici in autoclave e il 70% di etanolo: fine forbici chirurgiche, smussato forbici chirurgiche, pinze smussato, pinze sottili, clip, ad avvolgimento di base
- Anestetizzare mouse utilizzando con 2-3% isoflurano usando una macchina isoflurano scavenging. La media O 2 velocità di flusso utilizzato è di 1 L / minuto attraverso il cono di naso.
- Posare il mouse sul dorso e immobilizzare gli arti con nastro o altro adesivo rimovibile. Rimuovere i capelli con Epilatore chimici come Nair. Sterilizzare l'addome con tampone di cotone in alternativa tra il 70% di etanolo e betadine in un obiettivo-come la moda.
- Tenere una parte della pelle da parte della ghiandola mammaria con pinza smussato con una mano. Con l'altra mano, usando smussato forbici chirurgiche di fare una testa in giù T-incisione tra il # 9 e # 10 capezzoli o # 4 e # 5 capezzoli delle ghiandole mammarie inguinale per esporre le ghiandole mammarie.
- Fare un'incisione sotto la tasca dei linfonodi o arteria mammaria con piccole forbici chirurgiche primavera.
- Rimuovere l'innesto di collagene dal piatto coltura di tessuti utilizzando pinze. Rimuovere il liquido in eccesso dal trapianto collagene tamponando delicatamente su una sterile pulire e far scorrere l'innesto di collagene completamente nella tasca con una bacchetta di vetro sottile.
- Sutura del lembo cutaneo utilizzando # 2 suture assorbibili nell'intestino o graffette ferita.
- Lasciate il mouse recuperare nella gabbia.
- Monitorare i topi due volte alla settimana come minimo, la palpazione per i tumori. Sacrificare i topi quando il tumore raggiunge 1 cm di diametro. Harvest tessuti per l'analisi.
6. Rappresentante dei risultati:
L'isolamento e l'estrazione del collagene dai topi C57BL/6J
Queste procedure sono state adattate da 1. Estrazione di proteine da collagene coda del mouse 5-7 produce circa 1-1,5 mg / ml in un volume finale di 6 ml o 6 - 9 mg di proteina. Da coommassie macchia, bande corrispondenti a 90 kDa e 130 kDa vengono rilevati nelle corsie caricato con campioni estratti da code di topo, che indica la presenza di collagene di tipo I e pro-collagene, rispettivamente (Figura 1).
Isolamento e la coltura delle cellule di carcinoma mammario e fibroblasti di topi normali e PyVmT C57BL/6J.
Le procedure sono state adattate da 2. Cellule di carcinoma PyVmT e fibroblasti possono essere distinti da differenze nella morfologia delle cellule e l'espressione di specifici epiteliali e mesenchimali marKERS. Cellule di carcinoma PyVmT sono identificati per forma di ciottoli e co-express CK18, un marcatore del lume epiteliale e CK14, un marker basale epiteliale, ma non esprimono α-SMA (Figura 2). Fibroblasti mammari sono più grandi cellule con un fenotipo a forma di fuso ed esprimono alti livelli di α-SMA, ma non esprimono o CK14 CK 18 (Figura 2). Questi dati indicano oltre il 95% per la purezza delle cellule fibroblasti e cellule epiteliali utilizzando le procedure descritte.
Ortottica trapianto di cellule collagene incorporate nei topi C57BL/6J
Queste procedure sono state adattate da 3, 4. Trapianto di topi riceventi sono sacrificata quando i tumori in entrambi i gruppi sperimentali raggiungere 1,0 centimetri di diametro, o circa 60 giorni. Mentre il trapianto di cellule PyVmT solo risultati nei tumori palpabile dopo 30 - 40 giorni, raggiungendo una massa tumorale media di 0,335 grammi a 60 giorni, co-trapianto di cellule di carcinoma mammario PyVmT con risultati fibroblasti in una massa tumorale media di 0,630 grammi, indicando la valorizzazione della crescita tumorale da parte dei fibroblasti (Figura 3).
Figura 1. Analisi Coomassie macchia di collagene di tipo I estrazione da code di topo. BSA (~ 66 kDa) è indicata da una freccia. Commerciale collagene coda di topo (20 mg di proteine), e collagene purificato coda di topo (20 mg di proteine) sono indicati da box (~ 130 kDa, ~ 90 kDa proteine). Std = standard di peso molecolare.
Figura 2. Immunofluorescenza donatore di cellule di carcinoma mammario PyVmT e fibroblasti. Pannelli a e b rappresentano PyVmT cellule di carcinoma mammario immunostained per gli anticorpi anti CK14 e CK18. Pannello c rappresenta fibroblasti colorate con anticorpi α-SMA. Le immagini con DAPI sovrapposizione di ingrandimento 20x.
Figura 3. Lo sviluppo dei tumori mammari nei topi C57BL/6J in presenza o assenza di fibroblasti. Tumori mammari sono state raccolte dai topi trapiantati con cellule di carcinoma PyVmT in presenza o in assenza di fibroblasti mammari e pesato. Media + errore standard della media. N = 6 per gruppo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il contributo funzionale dei fibroblasti nella progressione tumorale è stata dimostrata attraverso modelli di trapianto, in cui il carcinoma fibroblasti associati co-trapiantati con mammarie benigne risultati cellule epiteliali in una maggiore crescita del tumore e l'invasività 5. Approcci di trapianto convenzionale hanno comportato l'utilizzo di topi SCID o nudi di co-trapianto di cellule stromali ed epiteliali provenienti da diversi background genetico del mouse o specie diverse. Topi immunocompromessi mancanza funzionale delle cellule T, che svolgono un ruolo fondamentale nel mediare l'immunità anti-tumorale attraverso il riconoscimento di antigeni specifici del tumore e la successiva targeting delle cellule tumorali, inibendo la diffusione metastatica 6. Inoltre, studi recenti hanno dimostrato che i fibroblasti sono importanti regolatori del reclutamento delle cellule immunitarie 7, 8, indicando che lo sviluppo di nuovi approcci per lo studio stromali: le interazioni delle cellule epiteliali sono necessari al fine di comprendere meglio i meccanismi di progressione del tumore mammario. Le procedure descritte dimostrano un metodo affidabile per: isolare e la cultura delle cellule mesenchimali ed epiteliali mammarie e ortotopicamente trapianto di queste cellule in topi immunocompetenti a formare tumori mammari. Utilizzando le procedure descritte, abbiamo innestato più di 40 topi con diversi gruppi sperimentali e endpoint diversi, con oltre un tasso del 97% dei trapianti di successo, dimostrando l'affidabilità di questo sistema. Gli effetti di fibroblasti mammari sulla crescita del tumore in questo sistema sono coerenti con gli studi precedentemente pubblicato che coinvolgono capsula subrenal innesto di fibroblasti con cellule di carcinoma mammario 9. Abbiamo trovato poche preoccupazioni con il sistema nella presente relazione. Se la concentrazione dello stock risultante è troppo bassa per le cellule embedding, si può ulteriormente concentrare il collagene ad un volume inferiore o isolare più collagene da code aggiuntivi. Per garantire una formazione costante del tumore, è importante per disperdere le cellule in modo uniforme nella spina collagene per tutto il collagene pipettando ed evitare la presenza di bolle nella spina collagene.
Lo sfondo bassa di formazione del tumore nei topi C57BL/6J 10, 11 ci permette di indagare il contributo funzionale di specifici oncogeni o l'inattivazione di oncosoppressori in stromali: interazioni epiteliali durante la progressione tumorale mammaria. Espressione di specifici oncogeni e soppressori tumorali possono essere modificati in cellule stromali o cellule epiteliali attraverso l'espressione stabile di siRNA per esempio, prima del trapianto. Poiché le cellule primarie senesce con continui passaging, la manipolazione genetica delle cellule in coltura è più facile se le cellule sono immortalati, per esempio attraverso immortalizzazione spontanea o espressione di un oncogene 12, 13, 14, 15. Immortalizzazione di diversi tipi di cellule stromali è stato realizzato con macrofagi e cellule endoteliali 16, 17, 18. Immunofluorescenza per specifici marcatori stromali ed epiteliali rivelato popolazioni altamente purificate di fibroblasti e cellule epiteliali isolate in questi studi. Tuttavia, l'identificazione di popolazioni di cellule contaminanti può richiedere l'uso del flusso di smistamento per purificare ulteriormente le popolazioni cella desiderata. In alternativa alla immortalizzazione e la manipolazione genetica di cultura, i ricercatori hanno anche isolato specifici tipi cellulari da topi transgenici attraverso la selezione di flusso e direttamente trapiantato queste cellule in topi per lo studio dei diversi tessuti, tra cui la ghiandola mammaria 19, 20. Questo approccio Questo approccio produce pile fisiologicamente rilevanti, ma richiede l'isolamento di cellule di topi di volta in volta. Tuttavia, la fornitura di celle e la purezza di popolazioni di cellule dipendono l'abbondanza del tipo di cellula e sul numero di topi a disposizione. Queste sfide possono essere superate con il trapianto di cellule tumorali in topi portatori giornalista fluorescenti come actina-GFP topi 21. In questo sistema, si sarebbe in grado di studiare gli effetti dello stroma generale sulla progressione del tumore, ma non distinguere il contributo di specifiche cellule stromali. Ciascuno dei metodi viene fornito con specifici vantaggi e svantaggi, e può essere combinata con il sistema descritto in questo rapporto, in base alle esigenze degli investigatori '. Inoltre, il sistema descritto può essere adattato o modificato per trapianto in diversi background genetico, il trapianto dei diversi tipi di cellule stromali e cellule epiteliali mammarie in vari stati di malignità per determinare come queste variabili che influiscono stromali: interazioni epiteliali e la successiva progressione del tumore.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sperimentazione animale:
Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dal comitato IACUC presso l'Università del Kansas Medical Center.
Acknowledgments
Questo progetto è stato finanziato attraverso dal NIH / NCI codice di autorizzazione R00 CA127357 e l'Università del Kansas Cancer Center Endowment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6N mice | Harlan Laboratories | N/A | |
| MMTV-PyVmT transgenic mice | Jackson Laboratory | 002374 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3039603PR | |
| DMEM | VWR international | 10000113873 | |
| Penicillin/streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-001 | |
| amphotericin | Fisher Scientific | BP2645-20 | |
| Amicon filtration columns ultracel 50k | EMD Millipore | UFC905008 | |
| Tubes for Beckman TI rotor | Beckman Coulter Inc. | 355618 | |
| Rat tail collagen | Fisher Scientific | CB 40236 | |
| 10x EBSS | Sigma-Aldrich | E7510-100ML | |
| Trypsin 1X, 0.25% in HBSS w/o Calcium and Magnesium | Fisher Scientific | MT-25-050-CI | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A491-212 | |
| Coomasie blue | Fisher Scientific | BP101 25 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T3924-100ml | |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich | ||
| hyalronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Kaleidoscope Protein standard | Bio-Rad | 1610375 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12545-78 | |
| Glass coverslips | VWR international | 101400-042 | |
| Vimentin antibody S-20 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-7558 | |
| α-smooth muscle actin antibody | Abcam | ab5694 | |
| CK14 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-53253 | |
| CK18 antibody | Abcam | ab668 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Anti-mouse biotinylated | Vector Laboratories | BA9200 | Distributed through Fisher |
| Anti-mouse-alexa-568 | Invitrogen | A10037 | |
| Anti-mouse- alexa-488 | Invitrogen | A11001 | |
| Streptavidin- alexa-488 | Invitrogen | S11226 | |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | |
| Prolong antifade | Invitrogen | P-36930 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-12 | |
| Fine spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| # 5 fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Gut chromic suture | Fisher Scientific | NC9326254 | |
| Glass Pasteur pipet | Fisher Scientific | 22-042-815 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A406P 4 | |
| betadine | Fisher Scientific | NC9386574 | |
| Wound clips | Fisher Scientific | 12032-07 | |
| Wound staple | Fisher Scientific | 12031-07 |
References
- Hayward, S., Haughney, P. C., Rosen, M. A., Greulich, K. M., Weier, H. U., Dahiya, R., Cunha, G. R. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-131 (1998).
- Cunha, G., Hom, Y. K., Young, P., Brody, J. Methods in Mammary Gland Biology. Asch, B. B., Ip, M. M. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. (2000).
- Ethier, S. P., Ammerman, C. A., Dziubinski, M. L. Methods in Mammary Gland Biology. Asch, B. B., Ip, M. M. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. (2000).
- Medina, D., Kittrell, F. Methods in Mammary Gland Biology. Asch, B. B., Ip, M. M. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. (2000).
- Kalluri, R., Zeisberg, M.
- DeNardo, D. G., Johansson, M., Coussens, L. M. Immune cells as mediators of solid tumor metastasis. Cancer Metastasis. 27, 11-18 (2008).
- Naito, M. Macrophage differentiation and function in health and disease. Pathol Int. 58, 143-155 (2008).
- Firestein, G. S. The T cell cometh: interplay between adaptive immunity and cytokine networks in rheumatoid arthritis. J Clin Invest. 114, 471-474 (2004).
- Cheng, N., Chytil, A., Shyr, Y., Joly, A., Moses, H. L. Enhanced Hepatocyte Growth Factor Signaling by Type II Transforming Growth Factor-{beta} Receptor Knockout Fibroblasts Promotes Mammary Tumorigenesis. Cancer Res. 67, 4869-4877 (2007).
- Qiu, T. H. Global expression profiling identifies signatures of tumor virulence in MMTV-PyMT-transgenic mice: correlation to human disease. Cancer Res. 64, 5973-5981 (2004).
- Schaffhausen, B. S., Roberts, T. M. Lessons from polyoma middle T antigen on signaling and transformation: A DNA tumor virus contribution to the war on cancer. Virology. 384, 304-316 (2009).
- Cepko, C. L. Immortalization of neural cells via retrovirus-mediated oncogene transduction. Annu Rev Neurosci. 12, 47-65 (1989).
- O'Hare, M. J. Conditional immortalization of freshly isolated human mammary fibroblasts and endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 646-651 (2001).
- Shay, J. W., Wright, W. E., Werbin, H. Defining the molecular mechanisms of human cell immortalization. Biochim Biophys Acta. 1072, 1-7 (1991).
- Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis. Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).
- Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
- Shen, G. Immortalization of endothelial cells differentiated from mouse embryonic stem cells. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 218-228 (2002).
- Wang, S. J., Greer, P., Auerbach, R. Isolation and propagation of yolk-sac-derived endothelial cells from a hypervascular transgenic mouse expressing a gain-of-function fps/fes proto-oncogene. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32, 292-299 (1996).
- Tiede, B. J., Owens, L. A., Li, F., DeCoste, C., Kang, Y. A novel mouse model for non-invasive single marker tracking of mammary stem cells in vivo reveals stem cell dynamics throughout pregnancy. PLoS One. 4, e8035-e8035 (2009).
- Guzman, R. Intracarotid injection of fluorescence activated cell-sorted CD49d-positive neural stem cells improves targeted cell delivery and behavior after stroke in a mouse stroke model. Stroke. 39, 1300-1306 (2008).
- Duda, D. G. Differential transplantability of tumor-associated stromal cells. Cancer Res. 64, 5920-5924 (2004).
