Summary
I den här rapporten visar vi ett system för att isolera och odla celler givare från mus juvret och orthotopically transplantera dessa celler i mottagarländerna möss att analysera stromaceller: epiteliala interaktioner under juvertumör utveckling.
Abstract
Inverkan av stromaceller, bland andra fibroblaster på bröst tumörprogression är väl dokumenterade med hjälp av musmodeller, särskilt genom transplantation av stromaceller och epitelceller i mjölkkörtlar hos möss. Aktuella transplantation modeller innebär ofta användning av nedsatt immunförsvar möss på grund av olika genetiska bakgrunder stromaceller och epitelceller. Extracellulär matriser används ofta för att bädda in två olika celltyper för konsekvent cell-cell interaktioner, men omfattar användning av Matrigel eller råtta svans kollagen, som är immunogena substrat. Avsaknaden av fungerande T-celler från immunsupprimerade möss förhindrar korrekt bedömning av stromaceller om juvertumör progression in vivo, med viktiga konsekvenser för läkemedelsutveckling och effekt. Dessutom nedsatt immunförsvar möss är dyra, svåra att föda upp och kräver särskild omsorg villkor. För att övervinna dessa hinder, har vi utvecklat ett förhållningssätt till orthotopically transplantation stromaceller celler och epitelceller i möss med samma genetiska bakgrunden för att framkalla konsekvent tumörbildning. Detta system innebär avverkning normalt, cancer förknippas fibroblaster, PyVmT bröst celler cancer och kollagen från givare C57BL/6J möss. Cellerna är sedan inbäddade i kollagen och transplanteras i inguinal mjölkkörtlar hos kvinnliga C57BL/6J möss. Transplantation av PyVmT celler ensam bilda palpabla tumörer 30-40 dagar efter transplantation. Endpoint analys på 60 dagar visar att co-transplantation med fibroblaster ökar juvertumör tillväxt jämfört med PyVmT celler transplanterade ensam. Medan celler och matris från C57BL/6J möss användes i dessa studier, kan isolering av celler och matrix och transplantation tillvägagångssätt användas mot möss med olika genetisk bakgrund visar mångsidighet. Sammanfattningsvis kan detta system användas för att undersöka molekylära interaktioner mellan stromaceller och epitelceller, och övervinner kritiska begränsningar hos immunsupprimerade musmodeller.
Protocol
1. Isolering och utvinning av givare kollagen från C57BL/6J möss
- Offra mogna normala kvinnliga C57BL/6J möss med godkända IACUC metoder.
- Skörda svansar och njuta i 70% etanol i 45 minuter för att sterilisera vävnader. Torka svansar med silkespapper, linda i aluminiumfolie. Förvara svansar i -20 ° C tills det behövs.
- Placera svansar i en steril miljö som ett laminärt flöde huva. Använda sax, dela huden vid svansroten och dra bort från svansen. Ta bort från 0,5 till 1 cm från båda ändar av svansen och dela resterande svansen upp i tre eller fyra stycken. Dissekera senor från svansar och separera senor i enskilda fibrer med hjälp av en skalpell eller rakblad.
- Överför senan fibrerna till en steril behållare och tvätta med sterilt destillerat vatten. Överföring senor från svans av 5-7 möss till en 50 ml koniskt rör som innehåller 35 ml sterilt avjoniserat vatten som innehåller 50 enheter / ml penicillin penicillin, 50 mikrogram / ml streptomycin och 250 ng / ml amfotericin, och 0,034 N ättiksyra utspädd från en stamlösning isättika (17 N). Placera på rocker vid 4 ° C i en vecka för att extrahera kollagen.
- Spinn ner skräp i en bordsskiva Centrifugera vid 3000 g under 15 minuter. Överför supernatanten, cirka 30 MLS till två polykarbonat rör anpassad för Beckman 50,2 Ti rotor och snurra på 35.000 g (ca 17 tusen rpm) i 1 timme.
- Volymen av supernatanten kommer att behöva minskas för att uppnå en koncentration av 1-2 mg / ml. Överför supernatanten till ett ultracel 50 k Amicon filtrering enhet och snurra i en bordsskiva centrifugera vid 3000 rpm i 15 vid 4 ° C. Överför filtratet till en steril koniska rör och spara. Upprepa centrifugeringen tills volymen reducerats till 5-6 ml.
- Läs proteinkoncentration. Vi använder en standard Bradford analys (Biorad) med hjälp av BSA standarder (Biorad) och outspädda prover. Mät ett prov från din filtratet, som en negativ kontroll.
- Ytterligare kontrollera renhet utvinning genom att lösa ett urval av renat kollagen på 6% SDS polyakrylamidgel, 10 banor, 1,5 mm gel tjocklek. Förbered 20 mikrogram av provet i 30 l 1x SDS-PAGE buffert innehållande 63 mM Tris HCl 10% glycerol, 2% SDS 0,0025% Bromfenolblått i 1,5 ml Eppendorf-rör. Förbered en motsvarande mängd protein från rått svans kollagen typ I som en positiv kontroll. Dessutom förbereda en uppsättning BSA standarder på 2,5, 5, 10, 20 mikrogram spätts i PBS och 1x buffert. Koka proverna vid 95 ° C i 5 minuter.
- Låt proverna svalna och kort mikrofug (maximal hastighet i 10 sekunder) för att snurra ner kondens.
- Ladda prover proverna tillsammans med en molekylviktsmarkör. Till exempel belastning 5 ìl av Kalejdoskop Biorad protein standard. Elektrofores vid 150 volt i ca 1 timme eller tills färgen når botten.
- Ta bort gel och fläcken i coomassie blå buffert. Förbered denna buffert genom att blanda 2 g coomassie blå, 75 ml isättika, 500 ml etanol i en total volym på 1000 ml innehåller avjoniserat vatten. Också förbereda samma mängd Avfärga buffert att använda receptet utom utan coomassie blå reagens. Täck gelen med en tillräcklig volym för coomassie blå och plats på en rocker.
- Rock försiktigt i 1 timme vid RT och dekantera fläcken. Byt Avfärga lösningen när det blir mörkt blå. Kvarhålla gelen över natten eller tills de enskilda banden löses på gelen. Leta två kollagen band (molekylvikt = 90 kDa och 130 kDa) och notera styrkan av banden mot standarder och kontroller. Bild gelen med hjälp av en gel doc-system, om det behövs.
2. Isolering och odling av givare bröstcancer celler och fibroblaster från normal och PyVmT C57BL/6J möss
- Offra åldersmatchade kvinnor normalt eller PyVmT transgena möss efter 10 veckors ålder när tumörer är uppenbara och påtagliga i PyVmT transgena möss med godkända IACUC metoder.
- Avslöja musen på rygg på en plan yta och immobilisera lemmar med tejp lim.
- Gör en upp och ner T-snitt mellan bröstvårtorna av bröst-och ljumsk juvret och dra i huden luckan bakåt för att exponera bröstkörtlar. Ta bort bröst vävnader och finhacka i små bitar med hjälp av kirurgiska sax.
- Bereda 100 ml av en enzymatisk spjälkning cocktail som innehåller: 200 mg trypsin, 500 mg kollagenas, 4 mg DNAse, 100.000 enheter hyaluronidas i sterila PBS och antibiotika över natten på is och sedan för 3 h vid 37 ° C.
- Tillsätt 10 ml PBS innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS) till varje prov och centrifugera cellpelleten i en bordsskiva centrifugera vid 1500 rpm i 5 minuter vid 4 ° C.
- Försiktigt aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 5-7 ml PBS/10% FBS. Upprepa snurra och tvätta två gånger till.
- Resuspendera cellpelleten i 10 ml DMEM innehållande 10% FBS innehåller 50 enheter / ml penicillin, 50 mikrogram / ml streptomycin och 250 ng / ml amfotericin på 10 cm rätter belagda med kollagen typ I. att bestryka tallrikar med kollagen, späd kollagen 1 ml (med hjälp av lager 1,5 mg / ml) i 39 ml 0,02 N ättiksyra utspädd i sterilt destillerat vatten eller PBS. Pipettera 5 ml av kollagen fungerande lösning på 10 cm tallrikar. Inkubera vid rumstemperatur i minst 10 minuter. Aspirera överskott kollagen. Parafilm oanvända tallrikar och förvara vid 4 ° C i en vecka.
- Ändra media 2 - 3 gånger i veckan. Framgångsrik rötning av vävnader skall kännetecknas av förekomsten av epitelceller foci omgiven av spindeln formade fibroblastic celler.
- Separera fibroblaster och epitelceller genom selektiv tryspinization. Aspirera media och tvätta cellerna med PBS gång. Pipettera 1 ml 0,25% trypsin/0.54 mM EDTA på cellerna och inkubera vid rumstemperatur. Fibroblaster är mer löst vidhäftande än epitelceller. Kontrollera om fibroblast avskildhet under mikroskop efter 2 minuter, celler bör vara flytande i suspension eller avrundas uppåt medan epitelceller fokus fortfarande bör följas upp till ytan.
- Lätt tryck på skålen för att lossa fibroblaster och försiktigt pipettera 10 ml av serum som innehåller medium i skålen för att ta bort fibroblaster.
- Pipettera det media som innehåller fibroblaster i ett 15 ml koniskt rör och centrifugera som beskrivs i steg 5). Replate dessa celler på kollagen belagd 10 cm rätter och upprepa selektiva trypsinization tills fibroblaster och epitelceller är helt separerade.
- Kontrollera om cell renhetsgrad av immunofluorescens färgning för epitelial markörer som CK14 och CK18 och markörer fibroblast såsom alfa glatt muskulatur aktin (α-SMA).
3. Immunofluorescens färgning av odlade celler
- Placera glas täckglas i 6 cm rätter. Sterilisera genom UV-exponering i 5 till 10 minuter i ett laminärt flöde huva.
- Täck täckglas med 1-2 ml brukslösning lager kollagen i 10 minuter i rumstemperatur (RT). Aspirera självrisk.
- Trypsinize och plåt 200.000 epitelceller och fibroblaster per prov. Tillsätt 3-5 ml av kompletta media och inkubera i 24 timmar.
- Aspirera media, tvätta cellerna med PBS och fixa i iskallt metanol vid -20 ° C i 7 minuter.
- Tvätta cellerna med PBS två gånger för att ta bort etanol, och blockera med 1-2 ml PBS med 1% FBS i 1 timme vid RT.
- Använd pincett, ta bort täckglas och lägg i en stor grunt container täckt med Parafilm eller andra hydrofoba yta.
- Späd följande primära antikroppar 1:100 i blockerande lösningen: anti-glatt muskulatur aktin (α-SMA, anti-CK14 (basala epitelceller markör), anti-CK18 (luminala epiteliala markör).
- Pipettera 100 l av antikroppar direkt på täckglas i 1 timme vid RT. Inkubera en separat täckglas av celler i blockerande lösningen, detta prov kommer att fungera som den sekundära antikroppen kontroll.
- Aspirera antikropp och pipett 1 ml PBS direkt på täckglaset att tvätta. Aspirera och upprepa 3-5 gånger.
- Späd följande sekundära antikroppar i blockerande lösningen: anti-mus-Alexa 488 till 1:100, anti-mus biotinylerad vid 1: 500, anti-mus-Alexa-568.
- Linda behållaren med täckglas i aluminiumfolie. Pipettera 100 l av lämpliga sekundär antikropp direkt på täckglas: α-SMA med anti-mus-Alexa 568, CK 14 färgning med anti-mus biotinylerad och CK18 med anti-mus-alexa 488. Täck behållaren för att skydda prover från synligt ljus.
- Aspirera antikropp och tvätta med PBS i steg 9). Lämna prover i PBS, förutom CK14 färgning.
- Späd streptavidin konjugerad till Alexa 568 1:500 i PBS. Inkubera CK14 färgade prover med strepatividin-Alexa 568 i 30 minuter vid strålbehandling i mörkret. Tvätta i PBS i steg 9)
- Späd DAPI 1: 500 i PBS. Sug PBS från prover och inkubera med DAPI i 10 minuter RT i mörkret.
- Skölj prover med PBS. Pipettera 100 l av Förläng anti-fade reagensen in glasskivor, vrid täckglas över så att cellerna är vända glaset bilden. Luta täckglas till en vinkel för att försiktigt ta kontakt med montering media.
- Bild proverna med hjälp av en immunofluorescens mikroskop. Förvara proverna i mörkret för att skydda immunofluorescens signalen som kommer ca 2 veckor.
4. Beredning av kollagen inbäddade celler för ympning
- Att bädda in celler i kollagen, är det nödvändigt att sänka pH-värdet i kollagen att uppnå polymerisation genom att blanda kollagen med en inställning lösning. Förbered inställningen lösning genom att blanda 100 ml 10X Earls Balanced Salt Solution (EBSS) med 2,45 g NaHCO3, 7,5 ml 1 M NaOH och 42,5 ml sterilt destillerat vatten. Ytterligare sterilisera med en flaska topp 0,22 micron filter ansluten till en steril flaska. <li> Blanda kollagen (lager koncentration 1 mg / ml) med inställningen lösning vid en start 4: 1 ratio. För ett transplantat, blanda 100 l av kollagen med 25 ìl av inställningen lösning i ett Eppendorf-rör. Vortex kort eller pipettera provet upp och ner för att blanda provet noggrant.
- Lägg till kollagen eller inställning lösning på 5-10 l steg och blanda väl tills fenol röd färg i blandningen ändras till en ljus rosa till orange färg, vilket återspeglar ett neutralt pH. En gul färg indikerar surt pH-värde, medan mörkrosa speglar grundläggande pH. Låt blandningen på is för att förhindra polymerisation.
- Ta bort fibroblaster och epitelceller från plattan genom trypsinization. Först aspirera media och tvätta med 5 ml PBS. Pipettera 1 ml 0,25% trypsin/0.54 mM EDTA i HBSS per platta. Inkubera fibroblaster vid RT i 2-5 minuter. Inkubera epitelceller vid 37oC för 2-6 minuter. Plattorna försiktigt för att lossa cellerna. Kontrollera om det lossnar med hjälp av en microscope.Quench av trypsin genom att pipettera 9 ml komplett medium på plattan och överföra celler till en steril 15 ml koniska rör.
- Ta bort 50 ul och räkna cellerna genom hemocytometer. Notera den totala volymen av celler i varje rör (ca 10 ml).
- Pellets cellerna vid 1500 rpm i 5 min vid RT. Sug cellpelleten och återsuspendera cellerna till en koncentration av 100.000 cells/100 l. Till exempel resuspendera 500.000 celler i en total volym på 500 l av kompletta medier.
- Blanda 250.000 stromaceller (250 l) och 100.000 tumörceller (100 l) i ett separat rör. Mikrofugrör 10 sek 1000 rpm, avlägsna supernatanten genom att pipettera. Tillsätt 50 l av den justerade kollagen lösning celler. Pipettera upp och ner för att skingra de celler jämnt. Pipettera de 50 l i ett sterilt 6 cm vävnadskultur tallrik för att bilda en cirkulär droppe. Inkubera transplantatet vid 37 ° C i 10 minuter för att polymerisera.
- Tillsätt försiktigt 5 ml av kompletta media i plattan genom att luta plattan i vinkel och långsamt pipettera media genom ena sidan av plattan. Luta plattan runt tills medierna täcker transplantat.
- Inkubera under 24 timmar vid 37 ° C. Transplant omedelbart.
5. Orthoptic transplantation av kollagen inbäddade celler i C57BL/6J möss
- Tillverka en tunn glasstav för transplantation. Värm ett glas Pasteurpipett med en bunsenbrännare. Använd pincett, sträck i slutet av pipett ut till 2-3 mm i tjocklek. Låt svalna, och sterilisera med 70% etanol.
- Sterilisera följande kirurgiska instrument genom autoklavering och 70% etanol: fin kirurgisk sax, trubbiga kirurgisk sax, trubbig pincett, tunn pincett, såret klipp, sår häftklammer
- Bedöva musen med med 2-3% isofluran med en isofluran sophantering maskin. Den genomsnittliga O 2 flödet används är 1 L / minut genom näsan konen.
- Lägg musen på rygg och immobilisera lemmar med tejp eller andra flyttbara lim. Ta bort hår med kemiska hårborttagare som Nair. Sterilisera buken med bomull badda alternativt mellan 70% etanol och Betadine i ett mål-liknande sätt.
- Håll upp en del av huden som mjölkkörtlarna med trubbiga pincetten med en hand. Med den andra sidan, med trubbiga kirurgisk sax göra en upp och ner T-snitt mellan # 9 och # 10 bröstvårtor eller # 4 och # 5 bröstvårtor av inguinal mjölkkörtlarna att exponera bröstkörtlar.
- Gör en ficka snitt under lymfkörtel eller bröst artär med små kirurgiska våren sax.
- Ta bort kollagen transplantat från vävnadsodling maträtt med hjälp av pincett. Ta bort överflödig vätska ur kollagen transplantatet genom att försiktigt dutta på en steril torka och skjut kollagen transplantat helt i fickan med hjälp av en tunn glasstav.
- Sutur i huden luckan med # 2 tarmen absorberbara suturer eller häftklamrar sår.
- Låt musen återhämta sig i buren.
- Övervaka möss två gånger i veckan åtminstone palperas för tumörer. Sacrifice möss när tumörerna nå 1 cm i diameter. Harvest vävnad för analys.
6. Representativa resultat:
Isolering och utvinning av kollagen från C57BL/6J möss
Dessa rutiner var anpassade från 1. Utvinning av kollagen protein 5-7 mus svansar ger ca 1-1,5 mg / ml i en 6 ml slutlig volym, eller 6 - 9 mg protein. Genom coommassie fläcken, band motsvarande 90 kDa och 130 kDa upptäcks i gränderna lastade med prover ur musen svansar, tyder på förekomst av kollagen typ I och pro-kollagen respektive (Figur 1).
Isolering och odling av bröstcancer celler och fibroblaster från normal och PyVmT C57BL/6J möss.
De förfaranden som var anpassade från 2. PyVmT cancer celler och fibroblaster kan urskiljas genom skillnader i cellmorfologin och uttryck av specifika epiteliala och mesenkymala markKERS. PyVmT cancer celler identifieras av kullersten form och samtidigt uttrycka CK18, en luminala epiteliala markör och CK14, en basal epiteliala markör, men inte uttrycka α-SMA (figur 2). Bröst fibroblaster är större celler med en spindel formad fenotyp och uttrycker höga nivåer av α-SMA men inte uttrycka CK14 eller CK 18 (Figur 2). Dessa data indikerar över 95% cell renhet för fibroblaster och epitelceller genom att använda beskrivs förfaranden.
Orthoptic transplantation av kollagen inbäddade celler i C57BL/6J möss
Dessa rutiner var anpassade från 3, 4. Transplantation mottagaren möss offras när tumörer i antingen experimentella gruppen når 1,0 cm i diameter, eller ungefär 60 dagar. Även transplantation av PyVmT celler ensam resulterar i påtaglig tumörer efter 30 - 40 dagar, och nådde ett medelvärde tumör massa 0,335 gram på 60 dagar, co-transplantation av PyVmT cancer celler med bröst fibroblaster resulterar i en genomsnittlig tumör massa av 0,630 gram, vilket tyder på förbättring av tumörtillväxt med fibroblaster (Figur 3).
Figur 1. Coomassie fläck analys av kollagen typ I-extraktion från mus svansar. BSA (~ 66 kDa) är markerad med pil. Kommersiella råtta svans kollagen (20 mikrogram protein) och renat mus svans kollagen (20 mikrogram protein) anges med ruta (~ 130 kDa, ~ 90 kDa protein). Std = molekylvikt standard.
Figur 2. Immunofluorescens färgning av bröst donator PyVmT cancer celler och fibroblaster. Paneler A och B representerar PyVmT bröstcancer celler immunostained för antikroppar mot CK14 och CK18. Panel c representerar fibroblaster färgas med antikroppar mot α-SMA. Bilderna visas med DAPI overlay vid 20x förstoring.
Figur 3. Juvertumör utveckling i C57BL/6J möss i närvaro eller frånvaro av fibroblaster. Juvertumörer skördades från möss transplanteras med PyVmT cancer celler i närvaro eller frånvaro av bröst fibroblaster och vägs. Medelvärde + standardavvikelse för medelvärdet. N = 6 per grupp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den funktionella bidrag fibroblaster i tumörprogression har visats genom transplantation modeller, där cancer förknippas fibroblaster samarbete transplanteras med godartade bröst epitelceller leder till ökad tumörtillväxt och invasiv 5. Konventionella transplantation metoder har inblandade användning av SCID eller nakna möss att samarbeta transplantation stromaceller och epitelceller från olika genetiska mus bakgrunder eller olika arter. Nedsatt immunförsvar möss saknar fungerande T-celler, som spelar viktiga roller i medling anti-tumör immunitet genom erkännande av tumör specifika antigener och efterföljande inriktning av tumörceller, vilket hämmar metastasering 6. Dessutom har nya studier visat att fibroblaster är viktiga regulatorer av immunceller rekrytering 7, 8, vilket indikerar att utvecklingen av nya metoder för att studera stromaceller: epitelceller interaktioner är nödvändiga för att tydligare förstå mekanismerna mammary tumörprogression. Den beskrivs förfaranden visar en tillförlitlig metod att isolera och kultur bröst epiteliala och mesenkymala celler och orthotopically transplantera dessa celler hos immunkompetenta möss att bilda juvertumörer. Använda beskrivs rutiner, vi har ympats över 40 möss med olika experimentella grupper och olika effektmått med över en 97% framgångsrik transplantation takt, visar tillförlitligheten i detta system. Effekterna av mammary fibroblaster på tumörtillväxt i detta system överensstämmer med tidigare publicerade studier med subrenal kapsel ympning av fibroblaster med bröstcancer celler 9. Vi har funnit några problem med systemet i denna rapport. Om koncentrationen av den resulterande lagret är för låg för inbäddning celler kan man koncentrera sig ytterligare kollagen till en lägre volym eller isolera mer kollagen från ytterligare svansar. För att säkerställa konsekvent tumörbildning, är det viktigt att skingra de celler jämnt i kollagen kontakten hela kollagen genom att pipettera och undvika förekomst av bubblor i kollagen kontakten.
Den låga bakgrund av tumörbildning i C57BL/6J möss 10, 11 ger oss möjlighet att undersöka den funktionella bidrag specifika onkogener eller inaktivering av tumör stötvågsfilter i stromaceller: epiteliala interaktioner under bröst tumörprogression. Redovisning av specifika onkogener och tumör stötvågsfilter kan ändras i stromaceller eller epitelceller genom stabila uttryck av siRNA till exempel, innan transplantation. Eftersom primärceller senesce med ständiga passaging, är genetisk manipulation av odlade celler lättare om cellerna är förevigade, exempelvis genom spontana immortalisering eller uttryck för en onkogen 12, 13, 14, 15. Immortalisering av olika stromaceller celltyper har uppnåtts med makrofager och endotelceller 16, 17, 18. Immunfluorescens färgning för specifika stromaceller och epiteliala markörer visade renat populationer av fibroblaster och epitelceller isolerade i dessa studier. Dock kan identifiering av kontaminerande cellpopulationer kräver användning av flödet sortering för att ytterligare rena önskad cellpopulationer. Som ett alternativ till immortalisering och genetisk manipulation i kulturen, har utredare isolerade också specifika celltyper från transgena möss genom flöden sortering och direkt transplanterade cellerna i möss för studier av olika vävnader, däribland mjölkkörtlarna 19, 20. Detta tillvägagångssätt Detta tillvägagångssätt ger fysiologiskt relevanta galvaniska element, men kräver isolering av celler från möss varje gång. Men utbudet av celler och renhet cellpopulationer är beroende av det överflöd av cellen typ och om antalet möss som finns. Dessa utmaningar kan övervinnas med transplantation av tumörceller i möss bära fluorescerande reporter som aktin-GFP möss 21. I detta system skulle man kunna undersöka effekterna av den totala stroma på tumörtillväxt, men inte skilja på bidrag från särskilda stromaceller. Alla de metoder som kommer med specifika fördelar och nackdelar, och kan kombineras med det system som beskrivs i denna rapport, enligt utredarna behov. Dessutom kan de beskrivna systemet anpassas eller ändras för transplantation i olika genetisk bakgrund, transplantation av olika stromaceller celltyper och bröst epitelceller i olika stater av malignitet att avgöra hur dessa olika variabler påverkar stromaceller: epiteliala interaktioner och efterföljande tumörprogression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Djurförsök:
Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som anges av IACUC kommittén vid University of Kansas Medical Center.
Acknowledgments
Detta projekt finansieras genom av NIH / NCI licensnummer R00 CA127357 och University of Kansas Cancer Center Endowment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6N mice | Harlan Laboratories | N/A | |
| MMTV-PyVmT transgenic mice | Jackson Laboratory | 002374 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3039603PR | |
| DMEM | VWR international | 10000113873 | |
| Penicillin/streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-001 | |
| amphotericin | Fisher Scientific | BP2645-20 | |
| Amicon filtration columns ultracel 50k | EMD Millipore | UFC905008 | |
| Tubes for Beckman TI rotor | Beckman Coulter Inc. | 355618 | |
| Rat tail collagen | Fisher Scientific | CB 40236 | |
| 10x EBSS | Sigma-Aldrich | E7510-100ML | |
| Trypsin 1X, 0.25% in HBSS w/o Calcium and Magnesium | Fisher Scientific | MT-25-050-CI | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A491-212 | |
| Coomasie blue | Fisher Scientific | BP101 25 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T3924-100ml | |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich | ||
| hyalronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Kaleidoscope Protein standard | Bio-Rad | 1610375 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12545-78 | |
| Glass coverslips | VWR international | 101400-042 | |
| Vimentin antibody S-20 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-7558 | |
| α-smooth muscle actin antibody | Abcam | ab5694 | |
| CK14 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-53253 | |
| CK18 antibody | Abcam | ab668 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Anti-mouse biotinylated | Vector Laboratories | BA9200 | Distributed through Fisher |
| Anti-mouse-alexa-568 | Invitrogen | A10037 | |
| Anti-mouse- alexa-488 | Invitrogen | A11001 | |
| Streptavidin- alexa-488 | Invitrogen | S11226 | |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | |
| Prolong antifade | Invitrogen | P-36930 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-12 | |
| Fine spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| # 5 fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Gut chromic suture | Fisher Scientific | NC9326254 | |
| Glass Pasteur pipet | Fisher Scientific | 22-042-815 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A406P 4 | |
| betadine | Fisher Scientific | NC9386574 | |
| Wound clips | Fisher Scientific | 12032-07 | |
| Wound staple | Fisher Scientific | 12031-07 |
References
- Hayward, S., Haughney, P. C., Rosen, M. A., Greulich, K. M., Weier, H. U., Dahiya, R., Cunha, G. R. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-131 (1998).
- Cunha, G., Hom, Y. K., Young, P., Brody, J. Methods in Mammary Gland Biology. Asch, B. B., Ip, M. M. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. (2000).
- Ethier, S. P., Ammerman, C. A., Dziubinski, M. L. Methods in Mammary Gland Biology. Asch, B. B., Ip, M. M. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. (2000).
- Medina, D., Kittrell, F. Methods in Mammary Gland Biology. Asch, B. B., Ip, M. M. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. (2000).
- Kalluri, R., Zeisberg, M.
- DeNardo, D. G., Johansson, M., Coussens, L. M. Immune cells as mediators of solid tumor metastasis. Cancer Metastasis. 27, 11-18 (2008).
- Naito, M. Macrophage differentiation and function in health and disease. Pathol Int. 58, 143-155 (2008).
- Firestein, G. S. The T cell cometh: interplay between adaptive immunity and cytokine networks in rheumatoid arthritis. J Clin Invest. 114, 471-474 (2004).
- Cheng, N., Chytil, A., Shyr, Y., Joly, A., Moses, H. L. Enhanced Hepatocyte Growth Factor Signaling by Type II Transforming Growth Factor-{beta} Receptor Knockout Fibroblasts Promotes Mammary Tumorigenesis. Cancer Res. 67, 4869-4877 (2007).
- Qiu, T. H. Global expression profiling identifies signatures of tumor virulence in MMTV-PyMT-transgenic mice: correlation to human disease. Cancer Res. 64, 5973-5981 (2004).
- Schaffhausen, B. S., Roberts, T. M. Lessons from polyoma middle T antigen on signaling and transformation: A DNA tumor virus contribution to the war on cancer. Virology. 384, 304-316 (2009).
- Cepko, C. L. Immortalization of neural cells via retrovirus-mediated oncogene transduction. Annu Rev Neurosci. 12, 47-65 (1989).
- O'Hare, M. J. Conditional immortalization of freshly isolated human mammary fibroblasts and endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 646-651 (2001).
- Shay, J. W., Wright, W. E., Werbin, H. Defining the molecular mechanisms of human cell immortalization. Biochim Biophys Acta. 1072, 1-7 (1991).
- Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis. Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).
- Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
- Shen, G. Immortalization of endothelial cells differentiated from mouse embryonic stem cells. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 218-228 (2002).
- Wang, S. J., Greer, P., Auerbach, R. Isolation and propagation of yolk-sac-derived endothelial cells from a hypervascular transgenic mouse expressing a gain-of-function fps/fes proto-oncogene. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32, 292-299 (1996).
- Tiede, B. J., Owens, L. A., Li, F., DeCoste, C., Kang, Y. A novel mouse model for non-invasive single marker tracking of mammary stem cells in vivo reveals stem cell dynamics throughout pregnancy. PLoS One. 4, e8035-e8035 (2009).
- Guzman, R. Intracarotid injection of fluorescence activated cell-sorted CD49d-positive neural stem cells improves targeted cell delivery and behavior after stroke in a mouse stroke model. Stroke. 39, 1300-1306 (2008).
- Duda, D. G. Differential transplantability of tumor-associated stromal cells. Cancer Res. 64, 5920-5924 (2004).
