Summary
इस रिपोर्ट में, हम एक अलग करने के लिए प्रणाली और संस्कृति माउस स्तन ग्रंथि से दाता कोशिकाओं का प्रदर्शन, और orthotopically stromal विश्लेषण: स्तन ट्यूमर के विकास के दौरान उपकला बातचीत प्राप्तकर्ता चूहों में इन कोशिकाओं का प्रत्यारोपण.
Abstract
माउस मॉडल के उपयोग के माध्यम से स्तन ट्यूमर प्रगति पर fibroblasts सहित stromal कोशिकाओं के प्रभाव को अच्छी तरह से किया गया है stromal कोशिकाओं और चूहों की स्तन ग्रंथि में उपकला कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के माध्यम से विशेष रूप से, प्रलेखित. वर्तमान प्रत्यारोपण मॉडल अक्सर immunocompromised stromal कोशिकाओं और उपकला कोशिकाओं के अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि के कारण चूहों के उपयोग शामिल है. कोशिकी matrices अक्सर संगत सेल सेल बातचीत के लिए दो अलग अलग सेल प्रकार एम्बेड करते हैं, लेकिन Matrigel या चूहे की पूंछ कोलेजन, जो immunogenic substrates के इस्तेमाल को शामिल किया जाता है. immunocompromised चूहों से कार्यात्मक टी कोशिकाओं की कमी दवा के विकास और प्रभावकारिता पर महत्वपूर्ण प्रभाव के साथ vivo में स्तन ट्यूमर प्रगति पर stromal कोशिकाओं के सटीक आकलन, रोकता है . इसके अलावा, immunocompromised चूहों महंगा, नस्ल और विशेष देखभाल की स्थिति की आवश्यकता मुश्किल हैं. इन बाधाओं पर काबू पाने के लिए, हम एक दृष्टिकोण के लिए orthotopically चूहों में एक ही आनुवंशिक पृष्ठभूमि से stromal सेल और उपकला कोशिकाओं को लगातार ट्यूमर गठन को प्रेरित प्रत्यारोपण विकसित किया है. इस प्रणाली दाता C57BL/6J चूहों से सामान्य, कार्सिनोमा जुड़े fibroblasts, PyVmT स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं और कोलेजन कटाई शामिल है. कोशिकाओं तो कोलेजन में एम्बेडेड रहे हैं और वंक्षण महिला C57BL/6J चूहों की स्तन ग्रंथियों में प्रतिरोपित. अकेले PyVmT कोशिकाओं के प्रत्यारोपण स्पर्शनीय ट्यूमर 30-40 दिनों के बाद प्रत्यारोपण के रूप में. 60 दिनों में समापन बिंदु विश्लेषण दर्शाता है कि fibroblasts के साथ सह - प्रत्यारोपण PyVmT अकेले प्रतिरोपित कोशिकाओं की तुलना में स्तन ट्यूमर के विकास को बढ़ाता है. जबकि C57BL/6J चूहों से कोशिकाओं और मैट्रिक्स इन अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया, कोशिकाओं और मैट्रिक्स और प्रत्यारोपण दृष्टिकोण के अलगाव अलग आनुवंशिक बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन पृष्ठभूमि से चूहों की दिशा में लागू किया जा सकता है. संक्षेप में, इस प्रणाली stromal कोशिकाओं और उपकला कोशिकाओं के बीच आणविक मुलाकातों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और immunocompromised माउस मॉडल में महत्वपूर्ण सीमाओं पर काबू.
Protocol
1. अलगाव और C57BL/6J चूहों से दाता कोलेजन की निकासी
- परिपक्व सामान्य महिला C57BL/6J अनुमोदित IACUC तरीकों का उपयोग कर चूहों बलिदान.
- हार्वेस्ट पूंछ और 45 से ऊतकों बाँझ मिनट के लिए 70% इथेनॉल में लेना. टिशू पेपर के साथ पूंछ सूखी, एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटो. -20 डिग्री सेल्सियस में पूंछ स्टोर जब तक जरूरत है.
- पूंछ एक लामिना का प्रवाह हुड के रूप में एक बाँझ वातावरण में रखें. कैंची का प्रयोग, पूंछ जड़ में त्वचा विभाजन और छील पूंछ से दूर. पूंछ के दोनों सिरों से 0,5 करने के लिए 1 सेमी निकालें और शेष पूंछ तीन या चार टुकड़ों में विभाजित हैं. पूंछ से काटना, tendons और व्यक्ति एक स्केलपेल या रेजर ब्लेड का उपयोग कर फाइबर में, tendons अलग.
- एक बाँझ कंटेनर कण्डरा तंतुओं स्थानांतरण और बाँझ आसुत पानी से धो. 5-7 चूहों की पूंछ से एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार 35 मिलीलीटर बाँझ de-ionized 50 इकाइयों युक्त पानी / एमएल पेनिसिलिन पेनिसिलिन, 50 स्ट्रेप्टोमाइसिन / μg और 250 मिलीलीटर एनजी / amphotericin मिलीलीटर, और 0.034 N एसिटिक एसिड से पतला युक्त ट्यूब स्थानांतरण tendons हिमनदों एसिटिक एसिड (17 एन) के एक शेयर समाधान. झूली कुरसी पर, पर 4 प्लेस डिग्री सेल्सियस एक सप्ताह के लिए कोलेजन निकालने के लिए.
- नीचे 15 मिनट के लिए एक मेज 3000 जी शीर्ष पर अपकेंद्रित्र में मलबे स्पिन. दो polycarbonate +३५,००० ग्राम (लगभग सत्रह हज़ार rpm) के Beckman 50.2 तिवारी रोटर और स्पिन के लिए 1 घंटे के लिए अनुकूलित ट्यूबों के लिए स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला, लगभग 30 mls.
- सतह पर तैरनेवाला की मात्रा 1-2 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए कम किया जा आवश्यकता होगी. एक ultracel 50 कश्मीर Amicon निस्पंदन यूनिट और 3000 rpm पर एक तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र में स्पिन करने के लिए 15 के लिए 4 में सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण डिग्री सेल्सियस छानना एक बाँझ शंक्वाकार ट्यूब के लिए स्थानांतरण और बचाने. Centrifugation दोहराएँ जब तक 5-6 मिलीलीटर मात्रा को कम है.
- प्रोटीन एकाग्रता पढ़ें. हम एक मानक ब्रैडफोर्ड परख (Biorad) का उपयोग करें, BSA (Biorad) मानकों और undiluted नमूने का उपयोग कर. अपने छानना से एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक नमूना है, उपाय.
- इसके अलावा एक 6% एसडीएस polyacrylamide जेल, 10 गलियों, 1.5 मिमी जेल मोटाई पर कोलेजन शुद्ध एक नमूना हल द्वारा निकासी की शुद्धता की जांच करने के लिए. 30 μl 1x एसडीएस पृष्ठ लोड हो रहा है 63 मिमी Tris एचसीएल 10% ग्लिसरॉल, एसडीएस 2% 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों में 0.0025% bromophenol नीले युक्त बफर में नमूने के 20 μg तैयार करें. चूहे की पूंछ कोलेजन प्रकार मैं एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रोटीन के एक बराबर राशि से तैयार करें. इसके अलावा, 2.5, 5, 10, पर BSA मानकों का एक सेट तैयार, 20 μg पीबीएस और 1X लोड हो रहा है बफर में पतला. 95 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए पर नमूनों को उबाल लें.
- नमूने शांत और संक्षिप्त microfuge चलो (10 सेकंड के लिए अधिकतम गति) करने के लिए नीचे स्पिन संक्षेपण.
- एक आणविक वजन मार्कर के साथ नमूने नमूनों लोड. उदाहरण के लिए, बहुरूपदर्शक Biorad प्रोटीन मानक के 5 μl लोड. लगभग 1 घंटे के लिए 150 वोल्ट पर या डाई सामने तक Electrophorese नीचे तक पहुँचता है.
- जेल निकालें और coomassie नीले बफर में दाग. इस बफर coomassie नीले, 75 मिलीलीटर, हिमनदों एसिटिक एसिड, 1000 मिलीलीटर की कुल मात्रा de-ionized पानी युक्त में 500 मिलीलीटर इथेनॉल के 2 ग्राम मिश्रण से तैयार करें. इसके अलावा destain बफर का एक ही राशि coomassie नीले अभिकर्मक बिना छोड़कर नुस्खा का उपयोग कर तैयार है. Coomassie नीले और एक झूली कुरसी पर जगह के लिए पर्याप्त मात्रा के साथ जेल कवर.
- आरटी और दाग छानना कम 1 घंटे के लिए धीरे रॉक. बदलें destain समाधान जब यह गहरे नीले रंग बदल जाता है. जेल रातोंरात रोकेंगे या जब तक व्यक्ति बैंड जेल पर हल कर रहे हैं. दो कोलेजन बैंड (आणविक भार = 90 केडीए और 130 केडीए) का पता लगाएँ और मानकों और नियंत्रण के खिलाफ बैंड की ताकत ध्यान दें. जेल एक जेल डॉक्टर प्रणाली का उपयोग कर छवि, यदि आवश्यक हो.
2. अलगाव और दाता स्तन कार्सिनोमा सामान्य और PyVmT C57BL/6J चूहों से कोशिकाओं और fibroblasts की संस्कृति
- बलिदान उम्र उम्र के 10 सप्ताह के बाद महिला सामान्य या PyVmT ट्रांसजेनिक चूहों मिलान जब ट्यूमर PyVmT ट्रांसजेनिक चूहों में अनुमोदित IACUC तरीकों का उपयोग स्पष्ट और स्पर्शनीय हैं.
- अपनी पीठ पर एक फ्लैट सतह पर माउस बेनकाब और टेप चिपकने का उपयोग अंग स्थिर है.
- वक्ष और वंक्षण स्तन ग्रंथि के निपल्स के बीच टी चीरा नीचे एक ऊपर और त्वचा प्रालंब वापस खींचने के लिए स्तन ग्रंथियों का पर्दाफाश. स्तन के ऊतकों को निकालें और छोटे टुकड़ों में शल्य कैंची का उपयोग कीमा.
- , 200 मिलीग्राम trypsin, 500 मिलीग्राम collagenase, 4 मिलीग्राम DNase, 100.000 बाँझ पीबीएस में hyaluronidase इकाइयों और एंटीबायोटिक दवाओं, बर्फ पर रातोंरात और 3 घंटे के लिए तो 37 में डिग्री सेल्सियस: एक enzymatic पाचन युक्त कॉकटेल के 100 मिलीलीटर तैयार
- पीबीएस प्रत्येक नमूना और अपकेंद्रित्र सेल गोली 4 में एक तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र में 5 मिनट के लिए 1500 rpm पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त डिग्री सेल्सियस के 10 मिलीलीटर जोड़ें
- धीरे aspirate सतह पर तैरनेवाला और PBS/10% FBS की 5-7 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend. स्पिन दोहराएँ और दो बार धोने.
- DMEM के 10 मिलीलीटर 10% अमेरिकन प्लान युक्त में सेल गोली Resuspendएस 50 इकाइयों से युक्त / मिलीलीटर पेनिसिलिन, 50 स्ट्रेप्टोमाइसिन μg / मिलीग्राम और 250 एनजी / एमएल 10 सेमी व्यंजन कोलेजन टाइप कोलेजन के साथ कोट प्लेटों के लिए मैं के साथ लेपित पर amphotericin, 39 में कोलेजन 1 मिलीलीटर (शेयर 1.5 मिलीग्राम / एमएल) का उपयोग कर पतला 0.02 एन एसिटिक एसिड के मिलीलीटर बाँझ आसुत जल या पीबीएस में पतला. Pipet 5 कोलेजन के MLS 10 सेमी प्लेटों पर समाधान काम कर रहा है. 10 मिनट के लिए एक न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. अतिरिक्त कोलेजन Aspirate. Parafilm अप्रयुक्त प्लेटें और 4 बजे दुकान ° सी एक सप्ताह के लिए.
- 3 बार एक सप्ताह - 2 मीडिया बदलें. ऊतकों के सफल पाचन उपकला धुरी आकार fibroblastic कोशिकाओं से घिरा हुआ foci के उपस्थिति द्वारा विशेषता हो जाएगा.
- चयनात्मक tryspinization द्वारा fibroblasts और उपकला कोशिकाओं को अलग. Aspirate मीडिया और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को एक बार धोने. Pipet 0.25% पर trypsin/0.54 मिमी EDTA कमरे के तापमान पर कोशिकाओं और सेते 1 मिलीग्राम. Fibroblasts अधिक शिथिल उपकला कोशिकाओं की तुलना में पक्षपाती हैं. Fibroblast टुकड़ी के लिए 2 मिनट के बाद खुर्दबीन के नीचे की जाँच करें, कोशिकाओं को निलंबन में तैर जाना चाहिए या गोल है जबकि उपकला foci अभी भी सतह का पालन किया जाना चाहिए.
- हल्के पकवान नल और fibroblasts धीरे pipet 10 mls पकवान में सीरम युक्त माध्यम से ढीला करने के लिए fibroblasts हटायें.
- Pipet मीडिया एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र के रूप में चरण 5 में वर्णित में fibroblasts युक्त). Replate कोलेजन लेपित 10 सेमी व्यंजन पर इन कोशिकाओं और चयनात्मक trypsinization प्रक्रिया दोहराएँ जब तक fibroblasts और उपकला कोशिकाओं को पूरी तरह से अलग हो रहे हैं.
- जैसे CK14 और CK18 और अल्फा चिकनी पेशी actin (α-SMA) के रूप में fibroblast मार्करों उपकला मार्करों के लिए immunofluorescence धुंधला द्वारा कोशिका की शुद्धता के लिए जाँच करें.
3. संवर्धित कोशिकाओं के immunofluorescence धुंधला
- 6 सेमी बर्तन में गिलास coverslips रखें. एक लामिना का प्रवाह हुड में 5 से 10 मिनट के लिए यूवी जोखिम से जीवाणुरहित.
- Coverslip कमरे के तापमान (आर टी) पर 10 मिनट के लिए शेयर कोलेजन समाधान काम करने की 1-2 मिलीलीटर के साथ कोट. अतिरिक्त Aspirate.
- Trypsinize और प्लेट नमूना प्रति 200.000 उपकला कोशिकाओं या fibroblasts. पूरा मीडिया के 3-5 मिलीलीटर जोड़ें और 24 घंटे के लिए सेते हैं.
- मीडिया Aspirate, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोने और बर्फ -20 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए ठंडे मेथनॉल में ठीक है.
- पीबीएस के साथ कोशिकाओं धो PBS आरटी से कम 1 घंटे के लिए 1% FBS युक्त 1-2 मिलीलीटर के साथ दो बार इथेनॉल, और ब्लॉक को दूर करने के लिए.
- संदंश का प्रयोग, coverslips और एक बड़े उथले parafilm या अन्य हाइड्रोफोबिक सतह के साथ कवर कंटेनर में जगह हटा दें.
- विरोधी चिकनी पेशी actin (α-sma, विरोधी CK14 (बेसल उपकला मार्कर), विरोधी CK18 (luminal उपकला मार्कर): निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी अवरुद्ध समाधान में 1:100 पतला.
- Pipet आरटी से कम 1 घंटे के लिए coverslips पर सीधे एंटीबॉडी के 100 μl. अवरुद्ध समाधान में कोशिकाओं के अलग coverslip सेते हैं, इस नमूने माध्यमिक एंटीबॉडी नियंत्रण के रूप में सेवा करेंगे.
- सीधे धोने coverslip पर एंटीबॉडी और pipet पीबीएस के 1 मिलीलीटर Aspirate. Aspirate और 3-5 बार दोहराएँ.
- 1:100 पर 488 विरोधी माउस Alexa, 1 पर biotinylated विरोधी माउस:: 500, विरोधी माउस - alexa 568 अवरुद्ध समाधान में निम्न माध्यमिक एंटीबॉडी पतला.
- लपेटें एल्यूमीनियम पन्नी में coverslips के साथ कंटेनर. 568 विरोधी माउस - Alexa, सी.के. 14 विरोधी माउस के साथ धुंधला हो जाना biotinylated और 488 विरोधी माउस Alexa के साथ CK18 के साथ α sma: coverslips पर सीधे 100 उचित माध्यमिक एंटीबॉडी के μl Pipet. कंटेनर कवर करने के लिए दृश्य प्रकाश से नमूनों की रक्षा.
- एंटीबॉडी Aspirate और चरण 9 में के रूप में पीबीएस के साथ धोने). पीबीएस में नमूने को छोड़कर CK14 के लिए धुंधला हो जाना, छोड़ो.
- 568 alexa पीबीएस में 1:500 संयुग्मित streptavidin पतला. Strepatividin 568 - Alexa के साथ आरटी पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में CK14 दाग नमूने सेते हैं. चरण 9 में के रूप में पीबीएस में धो)
- पीबीएस में DAPI 500: 1 पतला. नमूनों से पीबीएस Aspirate और DAPI साथ मिनट आरटी अंधेरे में 10 के लिए सेते हैं.
- पीबीएस के साथ नमूने कुल्ला. Pipet 100 के μl गिलास स्लाइड पर विरोधी फीका अभिकर्मक लम्बा है, इतना है कि कोशिकाओं का सामना कर रहे हैं गिलास स्लाइड पर coverslip बारी. एक कोण से coverslip झुकाएँ धीरे बढ़ते मीडिया के साथ संपर्क बनाने.
- छवि नमूने एक immunofluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग. अंधेरे में नमूने रखें immunofluorescence संकेत है, जो लगभग 2 सप्ताह पिछले जाएगा की रक्षा के लिए.
4. कलम बांधने का काम के लिए कोलेजन एम्बेडेड कोशिकाओं की तैयारी
- कोलेजन में कोशिकाओं को एम्बेड करने के लिए, यह कोलेजन के पीएच कम करने के लिए सेटिंग समाधान के साथ कोलेजन मिश्रण से polymerization को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. NaHCO3 की 2.45 ग्राम, 1 एम NaOH के 7.5 मिलीग्राम और बाँझ आसुत जल के 42.5 मिलीलीटर के साथ 10X अर्ल बैलेंस्ड नमक समाधान के 100 मिलीलीटर (EBSS) मिश्रण द्वारा स्थापित समाधान तैयार करें. इसके अलावा एक बोतल शीर्ष 0.22 माइक्रोन फिल्टर एक बाँझ बोतल से जुड़ी इकाई का उपयोग बाँझ. <अनुपात 1: li> मिश्रण (शेयर एकाग्रता 1 मिलीग्राम / एमएल) के एक प्रारंभिक 4 पर समाधान की स्थापना के साथ कोलेजन. एक भ्रष्टाचार के लिए, एक Eppendorf ट्यूब में समाधान की स्थापना की 25 μl के साथ कोलेजन के 100 μl मिश्रण. भंवर संक्षिप्त या नमूना pipet ऊपर और नीचे करने के लिए नमूना मिश्रण अच्छी तरह से.
- कोलेजन या 5-10 μl वेतन वृद्धि पर सेटिंग समाधान जोड़ें और phenol के लाल रंग एक नारंगी रंग के लिए गुलाबी प्रकाश के मिश्रण में परिवर्तन जब तक मिश्रण अच्छी तरह से, एक तटस्थ पीएच को दर्शाती है. एक पीले रंग अम्लीय pH इंगित करता है जबकि गहरे गुलाबी बुनियादी पीएच को दर्शाता है. Polymerization रोकने के बर्फ पर मिश्रण रखें.
- Trypsinization द्वारा थाली से fibroblasts और उपकला कोशिकाओं निकालें. सबसे पहले, मीडिया aspirate और पीबीएस के 5 मिलीलीटर से धो. Pipet 0.25% प्लेट प्रति HBSS में trypsin/0.54 मिमी EDTA के 1 मिलीलीटर. आरटी पर 2-5 मिनट के लिए fibroblasts सेते हैं. 37oC पर 2-6 मिनट के लिए उपकला कोशिकाओं सेते हैं. प्लेटें धीरे ठोकर करने के लिए कोशिकाओं को ढीला करने के लिए. थाली पर पूरा माध्यम से 9 मिलीलीटर pipetting से एक microscope.Quench trypsin का उपयोग कर टुकड़ी के लिए जाँच करें और एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण.
- 50 उल निकालें और hemocytometer द्वारा कोशिकाओं गिनती. नोट प्रत्येक ट्यूब में कक्षों की कुल मात्रा (लगभग 10 मिलीलीटर).
- गोली आरटी पर 5 मिनट के लिए 1500 rpm पर कोशिकाओं. सेल गोली Aspirate और 100.000 cells/100 μl की एकाग्रता के लिए कोशिकाओं resuspend. उदाहरण के लिए, पूरा मीडिया के 500 μl की कुल मात्रा में 500,000 कोशिकाओं resuspend.
- एक अलग ट्यूब में 250.000 stromal कोशिकाओं (250 μl) और 100,000 ट्यूमर कोशिकाओं (100 μl) मिक्स. Microfuge 10 सेकंड 1000 आरपीएम, pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें. कोशिकाओं को समायोजित कोलेजन समाधान के 50 μl जोड़ें. Pipet और नीचे कोशिकाओं को समान रूप से फैलाने के. Pipet एक बाँझ 6 सेमी टिशू कल्चर प्लेट में 50 μl एक परिपत्र बूंद के रूप में करने के लिए. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 10 मिनट polymerize करने के लिए भ्रष्टाचार को सेते हैं.
- धीरे से एक कोण पर झुकने की थाली से थाली में 5 mls और पूरा मीडिया के जोड़ने धीरे धीरे थाली के एक तरफ से मीडिया pipetting. थाली के आसपास जब तक मीडिया भ्रष्टाचार को शामिल किया गया झुकाएँ.
- 37 पर 24 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस तुरंत प्रत्यारोपण.
5. Orthoptic C57BL/6J चूहों में कोलेजन एम्बेडेड कोशिकाओं के प्रत्यारोपण
- प्रत्यारोपण सर्जरी के लिए एक पतली गिलास छड़ी बनाना. एक Bunsen बर्नर का उपयोग कर एक गिलास पाश्चर pipet हीट. संदंश का प्रयोग, pipet के अंत 2-3 मिमी मोटाई में खिंचाव. शांत करते हैं, और 70% इथेनॉल द्वारा बाँझ.
- Autoclaving और 70% इथेनॉल द्वारा निम्नलिखित शल्य चिकित्सा उपकरणों जीवाणुरहित: ठीक शल्य कैंची, कुंद शल्य कैंची, कुंद संदंश, पतली संदंश, घाव क्लिप, प्रधान घाव
- 2-3 isoflurane% एक isoflurane सफाई मशीन का उपयोग कर के साथ माउस का प्रयोग कर anesthetize. औसत हे 2 प्रवाह इस्तेमाल की दर एक नाक शंकु के माध्यम से एल / मिनट है.
- अपनी पीठ पर माउस लेटाओ और टेप या अन्य हटाने योग्य चिपकने वाला के साथ अंग स्थिर है. रासायनिक नायर जैसे बाल पदच्युत के साथ बाल निकालें. कपास 70% इथेनॉल और betadine के बीच वैकल्पिक रूप से एक लक्ष्य की तरह फैशन में swabbing के साथ पेट जीवाणुरहित.
- स्तन ग्रंथि द्वारा एक हाथ से कुंद संदंश का प्रयोग त्वचा का एक हिस्सा पकड़ो. दूसरे हाथ के साथ, कुंद शल्य कैंची का उपयोग टी 9 # # 10 निपल्स या # 4 और वंक्षण स्तन ग्रंथियों # 5 निपल्स के बीच चीरा नीचे उल्टा कर स्तन ग्रंथियों को बेनकाब करने के लिए.
- लिम्फ नोड के अंतर्गत या छोटे शल्य वसंत कैंची के साथ स्तन धमनी जेब चीरा बनाओ.
- टिशू कल्चर संदंश का उपयोग पकवान से कोलेजन भ्रष्टाचार निकालें. कोलेजन भ्रष्टाचार से धीरे एक बाँझ पर dabbing पोंछ और कोलेजन भ्रष्टाचार पूरी तरह से जेब में एक पतली गिलास छड़ी का उपयोग कर स्लाइड द्वारा अतिरिक्त तरल निकालें.
- सीवन त्वचा प्रालंब # 2 पेट absorbable sutures या घाव स्टेपल का उपयोग.
- माउस के पिंजरे में ठीक.
- कम से कम दो बार साप्ताहिक चूहों मॉनिटर, ट्यूमर के लिए छूकर. बलिदान चूहों जब ट्यूमर व्यास में 1 सेमी तक पहुँचने. विश्लेषण के लिए हार्वेस्ट ऊतकों.
6. प्रतिनिधि परिणाम:
अलगाव और C57BL/6J चूहों से कोलेजन की निकासी
इन प्रक्रियाओं 1 से अनुकूलित किया गया. प्रोटीन की 9 मिलीग्राम 5-7 माउस पूंछ से कोलेजन प्रोटीन की निकालना पैदावार 1-1.5 लगभग मिलीग्राम / 6 मिलीलीटर अंतिम मात्रा में मिलीलीटर, या 6. Coommassie करके दाग, 90 केडीए और 130 केडीए के लिए इसी बैंड माउस पूंछ से निकाले नमूनों के साथ भरी हुई गलियों में पता चला रहे हैं, कोलेजन टाइप और मैं - समर्थक कोलेजन की उपस्थिति क्रमशः संकेत (चित्रा 1).
अलगाव और स्तन कार्सिनोमा सामान्य और PyVmT C57BL/6J चूहों से कोशिकाओं और fibroblasts की संस्कृति.
प्रक्रियाओं 2 से अनुकूलित किया गया. PyVmT कार्सिनोमा कोशिकाओं और fibroblasts सेल आकारिकी में विशिष्ट उपकला और mesenchymal बाजार के मतभेद और अभिव्यक्ति द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता हैkers. PyVmT कार्सिनोमा कोशिकाओं cobblestone आकार और सह व्यक्त CK18, luminal उपकला मार्कर और CK14, एक बेसल उपकला मार्कर, लेकिन व्यक्त α sma (चित्रा 2) द्वारा पहचाने जाते हैं. स्तन fibroblasts एक धुरी के आकार phenotype के साथ बड़े कोशिकाओं रहे हैं और α-sma के उच्च स्तर व्यक्त लेकिन CK14 या सी.के. 18 (चित्रा 2) व्यक्त नहीं. इन आंकड़ों fibroblasts और उपकला कोशिकाओं उल्लिखित प्रक्रियाओं का उपयोग करने के लिए 95% सेल शुद्धता पर संकेत मिलता है.
Orthoptic C57BL/6J चूहों में कोलेजन एम्बेडेड कोशिकाओं के प्रत्यारोपण
इन प्रक्रियाओं से 3, 4 अनुकूलित किया गया. प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता चूहों का बलिदान कर रहे हैं जब या तो प्रयोगात्मक समूह में ट्यूमर व्यास में 1.0 सेमी, या लगभग 60 दिनों तक पहुँचने. जबकि PyVmT अकेले स्पर्शनीय ट्यूमर में कोशिकाओं के परिणाम के 30 प्रत्यारोपण के बाद 40 दिन, 60 दिन में 0.335 ग्राम के एक मतलब ट्यूमर जन तक पहुँचने, सह PyVmT 0.630 ग्राम के एक मतलब ट्यूमर जन में स्तन fibroblasts परिणामों के साथ कार्सिनोमा कोशिकाओं के प्रत्यारोपण, वृद्धि का संकेत fibroblasts (चित्रा 3) द्वारा ट्यूमर के विकास के.
चित्रा 1. Coomassie कोलेजन टाइप मैं माउस पूंछ से निकासी के दाग विश्लेषण BSA (~ 66 केडीए). तीर द्वारा संकेत है. वाणिज्यिक चूहे की पूंछ कोलेजन (20 μg प्रोटीन), और शुद्ध माउस पूंछ कोलेजन (20 μg प्रोटीन) बॉक्स (~ 130 केडीए, प्रोटीन ~ 90 केडीए) के द्वारा संकेत कर रहे हैं. एसटीडी = आणविक वजन मानक.
चित्रा 2. दाता PyVmT स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं और fibroblasts immunofluorescence धुंधला हो जाना. पैनलों एक और ख PyVmT स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं एंटीबॉडी के लिए CK14 और CK18 immunostained. पैनल ग α-sma करने के लिए एंटीबॉडी के साथ दाग fibroblasts का प्रतिनिधित्व करता है. छवियाँ 20x बढ़ाई DAPI ओवरले के साथ दिखाया गया है.
चित्रा 3. Fibroblasts की उपस्थिति या अनुपस्थिति में C57BL/6J चूहों में स्तन ट्यूमर के विकास. स्तन ट्यूमर स्तन fibroblasts की उपस्थिति या अनुपस्थिति में PyVmT कार्सिनोमा कोशिकाओं के साथ प्रतिरोपित चूहों से काटा गया और तौला. + मतलब की मानक त्रुटि मतलब. एन = 6 समूह प्रति.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ट्यूमर प्रगति में fibroblasts के कार्यात्मक योगदान प्रत्यारोपण मॉडल के माध्यम से प्रदर्शित किया गया है, जिसमें कार्सिनोमा जुड़े fibroblasts सौम्य स्तन वृद्धि ट्यूमर के विकास और 5 invasiveness में उपकला कोशिकाओं परिणामों के साथ सह प्रतिरोपित. पारंपरिक प्रत्यारोपण दृष्टिकोण अलग आनुवंशिक माउस पृष्ठभूमि या विभिन्न प्रजातियों में से stromal सह प्रत्यारोपण और उपकला कोशिकाओं के लिए SCID या नग्न चूहों का उपयोग शामिल है. Immunocompromised चूहों कार्यात्मक टी कोशिकाओं है, जो ट्यूमर विशिष्ट एंटीजन और लक्ष्यीकरण ट्यूमर कोशिकाओं के बाद, बाधा metastatic प्रसार 6 की मान्यता के माध्यम से विरोधी ट्यूमर उन्मुक्ति mediating में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने की कमी है. इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि fibroblasts प्रतिरक्षा सेल 7 भर्ती, 8 की महत्वपूर्ण नियामकों हैं, संकेत है कि नए तरीकों के विकास के लिए stromal अध्ययन करने के लिए: उपकला कोशिका बातचीत आवश्यक हैं क्रम में करने के लिए और अधिक स्पष्ट रूप से स्तन ट्यूमर प्रगति के तंत्र को समझने. उल्लिखित प्रक्रियाओं के लिए एक विश्वसनीय विधि का प्रदर्शन: अलग और संस्कृति स्तन उपकला और mesenchymal कोशिकाओं और orthotopically असुरक्षित चूहों में स्तन ट्यूमर फार्म के लिए इन कोशिकाओं का प्रत्यारोपण करने के लिए. उल्लिखित प्रक्रियाओं का उपयोग करना, हम 40 के साथ विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों और विभिन्न endpoints के एक 97% सफल प्रत्यारोपण दर पर, इस प्रणाली की विश्वसनीयता का प्रदर्शन चूहों पर grafted है. स्तन fibroblasts की इस प्रणाली में ट्यूमर के विकास पर प्रभाव पहले प्रकाशित subrenal स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं के साथ fibroblasts की 9 कलम बांधने का काम कैप्सूल शामिल अध्ययन के साथ संगत कर रहे हैं. हम इस रिपोर्ट में प्रणाली के साथ कुछ चिंताओं पाया है. यदि जिसके परिणामस्वरूप शेयर की एकाग्रता एम्बेड कोशिकाओं के लिए बहुत कम है, एक और एक कम मात्रा में कोलेजन ध्यान केंद्रित कर सकते हैं या अतिरिक्त पूंछ से अधिक कोलेजन को अलग. लगातार ट्यूमर गठन सुनिश्चित करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कोशिकाओं pipetting द्वारा कोलेजन भर में कोलेजन प्लग में समान रूप से फैलाने और कोलेजन प्लग में बुलबुले की उपस्थिति से बचने के.
स्तन ट्यूमर प्रगति के दौरान उपकला बातचीत: C57BL/6J 10 चूहों, 11 में ट्यूमर गठन के कम पृष्ठभूमि हमें stromal में विशिष्ट ट्यूमर शामक या ओंकोजीन निष्क्रियता के कार्यात्मक योगदान की जांच करने के लिए अनुमति देता है. विशिष्ट ओंकोजीन और ट्यूमर शामक की अभिव्यक्ति stromal कोशिकाओं या स्थिर siRNAs की अभिव्यक्ति के माध्यम से उदाहरण के लिए, पहले प्रत्यारोपण के लिए उपकला कोशिकाओं में संशोधित किया जा सकता है. क्योंकि प्राथमिक कोशिकाओं नित्य passaging के साथ senesce, संवर्धित कोशिकाओं के आनुवंशिक हेरफेर आसान अगर कोशिकाओं को अमर कर रहे हैं, सहज या एक ओंकोजीन 12, 13, 14, 15 की अमरता अभिव्यक्ति के माध्यम से उदाहरण के लिए,. अलग stromal सेल प्रकार की अमरता मैक्रोफेज और endothelial कोशिकाओं 16, 17, 18 के साथ हासिल किया गया है . विशिष्ट stromal और उपकला मार्करों के लिए immunofluorescence धुंधला fibroblasts की उच्च शुद्ध आबादी और इन अध्ययनों में अलग उपकला कोशिकाओं का पता चला. हालांकि, contaminating सेल आबादी की पहचान प्रवाह का उपयोग करने के लिए आगे से वांछित सेल आबादी को शुद्ध छँटाई की जरूरत हो सकती है. अमरता और संस्कृति में आनुवंशिक हेरफेर के लिए एक विकल्प के रूप में, जांचकर्ताओं भी प्रवाह छँटाई के माध्यम से ट्रांसजेनिक चूहों से विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं अलग और स्तन ग्रंथि 19, 20 सहित विभिन्न ऊतकों के अध्ययन के लिए चूहों में सीधे इन कोशिकाओं प्रतिरोपित. यह दृष्टिकोण इस दृष्टिकोण पैदावार physiologically प्रासंगिक प्राथमिक कोशिकाओं, लेकिन हर बार चूहों से कोशिकाओं के अलगाव की आवश्यकता है. हालांकि, कोशिकाओं और सेल आबादी की शुद्धता की आपूर्ति सेल प्रकार की बहुतायत पर उपलब्ध चूहों की संख्या पर निर्भर हैं. इन चुनौतियों जैसे फ्लोरोसेंट संवाददाता actin-GFP 21 चूहों ले चूहों में ट्यूमर कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के साथ दूर किया जा सकता है . इस प्रणाली में, एक ट्यूमर प्रगति पर समग्र stroma के प्रभाव की जांच करने में सक्षम हो सकता है, लेकिन विशिष्ट stromal कोशिकाओं के योगदान भेद नहीं है. प्रत्येक दृष्टिकोण के विशिष्ट फायदे और नुकसान के साथ आता है, और इस रिपोर्ट में वर्णित व्यवस्था के साथ संयुक्त किया जा सकता है 'जांचकर्ताओं की जरूरतों के अनुसार,. इसके अलावा, वर्णित व्यवस्था या अनुकूलित किया जा सकता है प्रत्यारोपण के लिए संशोधित अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि, अलग stromal सेल प्रकार के प्रत्यारोपण और दुष्टता के अलग राज्यों में स्तन उपकला कोशिकाओं में यह निर्धारित करने के लिए कैसे इन विभिन्न चर stromal प्रभावित: उपकला बातचीत और बाद में ट्यूमर प्रगति.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
पशु प्रयोगों:
जानवरों पर प्रयोगों कान्सास मेडिकल सेंटर के विश्वविद्यालय में IACUC समिति द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
Acknowledgments
इस परियोजना के माध्यम से NIH / NCI अनुदान R00 संख्या CA127357 और कान्सास कैंसर सेंटर बंदोबस्ती के विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6N mice | Harlan Laboratories | N/A | |
| MMTV-PyVmT transgenic mice | Jackson Laboratory | 002374 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3039603PR | |
| DMEM | VWR international | 10000113873 | |
| Penicillin/streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-001 | |
| amphotericin | Fisher Scientific | BP2645-20 | |
| Amicon filtration columns ultracel 50k | EMD Millipore | UFC905008 | |
| Tubes for Beckman TI rotor | Beckman Coulter Inc. | 355618 | |
| Rat tail collagen | Fisher Scientific | CB 40236 | |
| 10x EBSS | Sigma-Aldrich | E7510-100ML | |
| Trypsin 1X, 0.25% in HBSS w/o Calcium and Magnesium | Fisher Scientific | MT-25-050-CI | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A491-212 | |
| Coomasie blue | Fisher Scientific | BP101 25 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T3924-100ml | |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich | ||
| hyalronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Kaleidoscope Protein standard | Bio-Rad | 1610375 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12545-78 | |
| Glass coverslips | VWR international | 101400-042 | |
| Vimentin antibody S-20 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-7558 | |
| α-smooth muscle actin antibody | Abcam | ab5694 | |
| CK14 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-53253 | |
| CK18 antibody | Abcam | ab668 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Anti-mouse biotinylated | Vector Laboratories | BA9200 | Distributed through Fisher |
| Anti-mouse-alexa-568 | Invitrogen | A10037 | |
| Anti-mouse- alexa-488 | Invitrogen | A11001 | |
| Streptavidin- alexa-488 | Invitrogen | S11226 | |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | |
| Prolong antifade | Invitrogen | P-36930 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-12 | |
| Fine spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| # 5 fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Gut chromic suture | Fisher Scientific | NC9326254 | |
| Glass Pasteur pipet | Fisher Scientific | 22-042-815 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A406P 4 | |
| betadine | Fisher Scientific | NC9386574 | |
| Wound clips | Fisher Scientific | 12032-07 | |
| Wound staple | Fisher Scientific | 12031-07 |
References
- Hayward, S., Haughney, P. C., Rosen, M. A., Greulich, K. M., Weier, H. U., Dahiya, R., Cunha, G. R. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-131 (1998).
- Cunha, G., Hom, Y. K., Young, P., Brody, J. Methods in Mammary Gland Biology. Asch, B. B., Ip, M. M. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. (2000).
- Ethier, S. P., Ammerman, C. A., Dziubinski, M. L. Methods in Mammary Gland Biology. Asch, B. B., Ip, M. M. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. (2000).
- Medina, D., Kittrell, F. Methods in Mammary Gland Biology. Asch, B. B., Ip, M. M. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. (2000).
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).
- DeNardo, D. G., Johansson, M., Coussens, L. M. Immune cells as mediators of solid tumor metastasis. Cancer Metastasis. 27, 11-18 (2008).
- Naito, M. Macrophage differentiation and function in health and disease. Pathol Int. 58, 143-155 (2008).
- Firestein, G. S. The T cell cometh: interplay between adaptive immunity and cytokine networks in rheumatoid arthritis. J Clin Invest. 114, 471-474 (2004).
- Cheng, N., Chytil, A., Shyr, Y., Joly, A., Moses, H. L. Enhanced Hepatocyte Growth Factor Signaling by Type II Transforming Growth Factor-{beta} Receptor Knockout Fibroblasts Promotes Mammary Tumorigenesis. Cancer Res. 67, 4869-4877 (2007).
- Qiu, T. H. Global expression profiling identifies signatures of tumor virulence in MMTV-PyMT-transgenic mice: correlation to human disease. Cancer Res. 64, 5973-5981 (2004).
- Schaffhausen, B. S., Roberts, T. M. Lessons from polyoma middle T antigen on signaling and transformation: A DNA tumor virus contribution to the war on cancer. Virology. 384, 304-316 (2009).
- Cepko, C. L. Immortalization of neural cells via retrovirus-mediated oncogene transduction. Annu Rev Neurosci. 12, 47-65 (1989).
- O'Hare, M. J. Conditional immortalization of freshly isolated human mammary fibroblasts and endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 646-651 (2001).
- Shay, J. W., Wright, W. E., Werbin, H. Defining the molecular mechanisms of human cell immortalization. Biochim Biophys Acta. 1072, 1-7 (1991).
- Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis. Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).
- Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
- Shen, G. Immortalization of endothelial cells differentiated from mouse embryonic stem cells. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 218-228 (2002).
- Wang, S. J., Greer, P., Auerbach, R. Isolation and propagation of yolk-sac-derived endothelial cells from a hypervascular transgenic mouse expressing a gain-of-function fps/fes proto-oncogene. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32, 292-299 (1996).
- Tiede, B. J., Owens, L. A., Li, F., DeCoste, C., Kang, Y. A novel mouse model for non-invasive single marker tracking of mammary stem cells in vivo reveals stem cell dynamics throughout pregnancy. PLoS One. 4, e8035-e8035 (2009).
- Guzman, R. Intracarotid injection of fluorescence activated cell-sorted CD49d-positive neural stem cells improves targeted cell delivery and behavior after stroke in a mouse stroke model. Stroke. 39, 1300-1306 (2008).
- Duda, D. G. Differential transplantability of tumor-associated stromal cells. Cancer Res. 64, 5920-5924 (2004).
