動物全体でMG53を介した細胞膜修復のと細胞レベルで動的なプロセスを視覚化するために使用されるプロトコルは、ここで説明する。これらのメソッドは、細胞膜の再シール性と再生医療の細胞生物学を調査するために適用することができます。
細胞膜への急性損傷の修復は正常な細胞生理の元素プロセスであり、欠陥のある細胞膜の修復は、多くの退行性のヒト疾患にリンクされています。膜の再シール機械の主要コンポーネントとしてMG53の最近の発見は、基本的な組織修復の生物学だけでなく、再生医療の潜在的なトランスレーショナルアプリケーションのためのよりよい分子的理解が可能になります。ここでは詳細モデルマウスにトレッドミル運動負荷プロトコールを用いて筋損傷の修復にMG53の生体機能に探索するため、隔離された筋肉の繊維に染料エントリを測定することにより、 生体外での膜修復の能力をテストするため、および動的なプロセスを監視するための実験プロトコルをMG53を介した小胞輸送および生細胞共焦点顕微鏡を用いて培養細胞の細胞膜の修復の。
トレッドミルのランニングは、投与動物に運動負荷を提供することで有用な手法です。筋肉の機能や持久力を測定するための方法論としては、一貫して再現可能な方法8で実行することが困難であることで有 名騒々しいアプローチです。一般的に、枯渇度はこのようないくつかのノックアウトマウスの線と9は、野生型マウスとの間のそれらのような実験群の主な相違点を、解決するためにエンドポイントとして使用することができます。このようないくつかの医薬品試験など、より微妙な違いを、作り出す実験操作は、この手法に関連したノイズ上記の相違点が解決されない場合があります。これらの技術の再現性と感度を最大にするために、それは非常に密接にセッションにセッションの状態を維持することが重要です。動物は、行使だけでなく、ウォームアップ期間の条件が使用されている時刻は、重要な要因であると裁判から裁判に一貫性を保つ必要があります。
マウスの特定の菌株は、他の株よりもトレッドミル上ではるかに多くの時間を実行し、持久運動を10に異なる対応できるようにひずみの影響はトレッドミルのプロトコルの設計に大きな影響を与えることがあります。一般的なガイドラインとして、多くのマウスは、トレッドミルの速度で一定の増加(1 M / M、5 M / Mの初期速度は、開始後の各分追加)と疲労の研究では200から300合計メートルを実行できるようになります。持久力運動のためにマウスが30分2〜3回週に9〜12メートル/ mの間に実行される可能性があります。しかし、個々の研究は、通常、個々の実験的なニーズに合わせて、プロトコルのいくつか最適化が必要になります。
UV -レーザー損傷の手順は、骨格筋線維3,6,11の膜修復の能力を測定するための効果的な方法であることが示されている。これらの実験の成功への一つの重要なコンポーネントは、縞の規則的なパターンとしわに表示されないスムーズな筋鞘付きストレート、ロッド状の外観を表示する唯一の筋線維を使用することです。他の筋線維が選択されている場合、膜の損傷は、すでにこれらの実験結果からのこれらの繊維との解釈で存在してもよい複雑されることがあります。それは、照射領域の繊維と定義の向きは、図1で定義されていることも重要です。これは、このように繊維間の比較を可能にする、再現性の大きさの傷害を提供します。傷害の定義された領域は、繊維内に完全にある場合、内部の損傷はむしろ筋鞘を中断するよりも作成されます。また、ΔF/ F 0のため計算値は、平均蛍光の測定のために選択対象の領域に非常に敏感です。損傷部位を含む隣接した約200μmの2の面積、およびは、適切です。怪我のために定義されている地域とは異なり、この領域では繊維内に完全になるように置いてください。あなたが繊維の外側にスペースを含める場合、より重篤な表現型をもつ繊維でΔF/ F 0を削減しながら、結果の空白の領域が少ない染料エントリを持つ繊維でΔF/ F 0が増加します。これは、このように繊維間の比較をより困難に、アッセイの感度を減少させる。
マイクロピペットのダメージのアッセイのために、マイクロピペットやガラス底皿との間の角度は、効果的に細胞膜を損傷するために約45度にする必要があります。細胞がしっかりと皿の底に添付する必要があり、丸い細胞が、彼らはマイクロピペットを突っつい後にデタッチされる可能性が最も高いので、使用すべきではないマイクロピペットの損傷のために選ばれた。サポニンpermeabilzation実験では浸透アッセイをマイクロピペットに比べて実行するために以下の技術的要求と相対的に速くなります。しかし、サポニンはその皿の中で他のセルを拡散し、損傷することがあるので1つのセルのみを皿ごとに使用できることを含むサポニン損傷にはいくつかの制限が、あります。
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
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Rodent treadmill | Columbus Instruments Exer 3/6 or equivalent | |
70 % ethanol | ISC Bioexpress | |
Dissection tools including fine tip forceps, spring scissors | World Precision Instruments | |
2 mg/ml collagenase type I | Sigma | |
0 Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma | |
2.5mM Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma | |
Temperature controllable orbital shaker | New Brunswick or equivalent | |
Delta TPG Dish | Fisher Scientific | 1207133 |
LSM 510 confocal microscope with an Enterprise 80 mW UV laser or equivalent confocal microscope | Zeiss | |
FM1-43 or FM4-64 dyes | Invitrogen | |
Borosilicate Capillaries Size 0.8-1.0 X 100 mm | PYREX | Part No. 9530-2 |
Micropipette puller | Sutter Instruments | model P-97 |
3 axis micromanipulator | Narishige | MHW-3 |
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope | BioRad | MHW-3 |
Saponin | Sigma | 47036 |