Summary
전체 동물 MG53 - 중재 세포막 수리 및 세포 수준에서 동적 프로세스를 시각화하는 데 사용되는 프로토콜은 여기에 설명되어 있습니다. 이러한 방식은 플라즈마 막 resealing 및 재생 의학 세포 생물학을 조사하기 위해 적용할 수 있습니다.
Abstract
세포막에 급성 부상의 복구는 정상적인 세포 생리학의 원소 과정이며, 결함 멤브레인 수리 많은 퇴행성 질병 인간에 연결되어 있습니다. 막 resealing 기기의 핵심 구성 요소로서 MG53의 최근 발견은 기본 조직 수리 생물학뿐만 아니라, 재생 의료에 잠재적 translational 애플 리케이션을위한 더 나은 분자의 이해 수 있습니다. 다음은 세부 고립 근육 섬유에 염료 항목을 측정하여 전 생체내 막 복구 능력을 테스트하기 위해, 마우스 모델에서 러닝 머신 운동 프로토콜을 사용하여 근육 손상의 수리에 MG53의 생체내 기능에 탐구하고 역동적인 과정을 감시하기위한위한 실험 프로토콜을 라이브 세포 공촛점 현미경을 사용하여 교양 세포 MG53 - 중재 소포 밀매와 세포막 수리니다.
Protocol
1. 마우스 모델에서 근육 부상의 범위를 밝히려을위한 러닝 머신 러닝
- 실행중인 프로토콜 중에 사용할 수 있도록 러닝 머신 표면의 각도를 설정합니다. 일반적으로 평면 수준 또는 7 °와 15 ° 사이의도 각도는 내리막이나 오르막 사용됩니다. 다른 사람들이 러닝 머신은 다른 수단을 통해 상승을 요구하면서 일부 treadmills는 경사면을 조정 통합 장치에있다.
- 실행중인 프로토콜 동안 동물로부터 폐기물을 수집하기 위해 러닝 머신에서 동물을 올려 놓기 전에 러닝 머신 아래 트레이 또는 파란색 실험실 패드를 놓습니다.
- 실행중인 생쥐는 러닝 머신의 환경에 acclimated해야하기 전에. 이것은에서 전기 그리드 및 벨트 드라이브 모터하지만 벨트 (예 : 0m / s의 설정 속도) 안움직로 15 분 러닝 머신에서 동물을 배치 포함됩니다.
- 동기 전기 그리드를 켭니다. 사용하는 펄스의 강도 및 빈도는 보통 treadmills에 대한 제어 하나의 제조 업체에서 다른 다릅니다 수 있습니다. 일반적으로, 최대 강도는 높은 주파수 (적어도 이초 회) 준수 여부를 개선하는 동안 실행하는 마우스 동기를 부여하기 위해 필요하지 않습니다.
- 실행중인 프로토콜을 시작하는 러닝 머신 벨트를 활성화합니다. 약 5m / 분 초기 속도는 생쥐에 대한 따뜻한 최대 기간 동안 사용해야합니다. 러닝 머신의 속도는 일반적으로 러닝 머신의 시작을 다음 1-2미터 / 각 분간 분을 추가하여 천천히 가속 수 있습니다.
- 대부분의 프로토콜에서 동물의 준수는 실험 실행이 시작되기 전에 3~10일에 대한 따뜻한 최대 속도로 짧은 실행의 일련 (5 분) 실시하여 향상시킬 수 있습니다.
- 급성 배기 운동은 일반적으로 최대 속도까지 시간과 러닝 머신의 속도를 증가 포함됩니다 (일반적으로 <30m / m)이 생쥐는 피로의 흔적을 보여주기 전까진 달성 및 유지 관리됩니다. 배기 판단 기준은 다를 수 있지만 일반적으로 러닝 머신의 표면에 반환하지 않고 전기 그리드에서 전기 그리드 또는 5 연속 초에있는 시간의 절반 이상을 지출 마우스를 포함합니다. 개인 마우스가 소진되면 그것은 러닝 머신에서 제거할 수 있습니다 실행의 총 시간이 기록됩니다.
- 러닝 머신의 각도를 변경하는 것은 운동 부하 (오르막 각도)를 증가 시키거나 근육 섬유 1 sarcolemmal 세포막을 찢어 손상 편심 수축 (내리막 각도)를 유발하는 급성 실행 실험에 사용할 수 있습니다. 에반스 청색 색소가 손상된 근육 섬유 2,3를 식별하는 histological 염료로 사용하기 위해 같은 절차를하기 전에 동물에 주입 수 있습니다.
- 프로토콜을 실행하는 인내력 훈련은 근육이나 심장 혈관 시스템의 개조를 생산하기 위해서는 시간의 연장 기간 (최대 개월까지)을 통해 동물에 운동 부하를 제공합니다. 절차는하지만 (> 1 시간) 최대 속도는 일반적으로 낮은과 실행 시간이 매우 긴 수 있습니다 (단계 1.5) 위와 동일합니다 따뜻해.
- 생쥐를 실행 완료들은 연습장에 제공될 수 있습니다 후. 생쥐가 실행되는 동안 Treadmills는 일반적으로 특히 긴 프로토콜을 통해 아주 더러운된다. 그것은 각각의 사용에 따라 일반적으로 70 % 에탄올 스프레이로, 러닝 머신을 청소하는 것이 필요합니다.
2. 절연 근육 섬유의 막 복구 용량의 전 VIVO 분석은 UV - 레이저 손상 다음
- 마우스에서 도보 flexor digitorum brevis (FDB) 근육의 표면 계층을 해부하다. 아래 근육을 손상하지 않도록주의하면서 첫째, 중간 라인에서 단독 오픈의 피부를 잘라 다음 수평 상처를 만들고 피부를 제거합니다. FDB 근육 (근위 힘줄)의 평면 흰 힘줄이 뼈에 부착 calcaneus 볼 수 있습니다. 솔직하게 포셉으로 힘줄이 분리 및 첨부 파일의 사이트에 힘줄이 가까이를 끊다, 포셉하여 무료 힘줄 잡고 연결된 남아있는 결합 조직을 깎다가 주변 조직에서 FDB를 구분 부드럽게 끌어. FDB는 다음과 힘줄은 근육의 깊은 계층에 연결할 위치를 절단에 의해 삭제될 수 있습니다 각각의 자리에 말초 힘줄 지점을 보는시.
- collagenase 솔루션의 사전 예열 ° C 1.5 ML Eppendorf 튜브, 37 ° C 궤도 통에 가로 방향으로 테이프 튜브에서 37과 65 분 200 rpm으로 흔들. 1 ML에서 FDB 근육 묶음을 넣어 부화의 시간은 닳은 모양과 근육의 연한 색깔로 표시됩니다 충분한 소화를 보장하기 위해 조정해야 할 수 있습니다.
- 소화 번들 쉽게 중단없이 통과 수 있도록 충분한 직경을 가진자를 엔드와 1 ML 피펫 팁을 통해 2.5 칼슘 2 + Tyrode의 ~ 600 μl를 포함하는 1.5 μl 원심 튜브에 소화 FDB 번들을 신중하게 전송합니다. 부드럽게 번들에서 느슨한 섬유를 흔들 수있는 튜브를 플립.
- 30 μL 피펫 팁 컷 있도록 D부드럽게 피펫으로 번들을 그려 후 솔루션에 그것을 다시 밀어 pipettor를 사용하여 - (직경 20 μm의 15 사이) iameter은 근육 번들보다 약간 작습니다.. 섬유의 대부분은 번들에서 정신을 때까지이 과정을 반복합니다.
- 유리 바닥 델타 T 접시에 원하는 금액과 드롭을 잘 부드럽게 튜브를 회전하여 분리된 여러개의 섬유를 섞는다. 로드할 볼륨 분리 및 특정 프로토콜에 대한 요리에 필요한 유용한 섬유의 숫자의 효율성에 따라 달라집니다. 나머지 섬유 ° C 추가 연구에 대한 대략 6 시간 동안 4 튜브에 저장할 수 있습니다.
- 5 분 그대로 앉아 접시를 허용합니다. 이것은 섬유가 음식의 유리 바닥을 준수 할 수 있습니다.
- UV 레이저를 갖춘 공촛점 현미경에서 유리 바닥 접시를 놓습니다. 정상적인 줄무늬 패턴과 모양 같은 직선, 막대의 존재를 확인하기 위해> 100X 확대 위상 현미경 아래에있는 섬유를 관찰합니다.
- 2.5 μm의 5 최종 농도 솔루션 FM1 - 43 또는 FM4 - 64 styrylpyridinium 염료 4 추가합니다.
- 섬유는 맨 아래 오른쪽에있는보기의 필드 (그림 1)의 왼쪽 상단에서 45 ° 각도로 지향되도록 섬유 위치 그것 이미징 윈도우에 손상을 유발합니다. 5 초 동안 최대 전력으로 설정 UV 레이저 (80 MW 이상, 364분의 351 NM)를 사용하여 플라즈마 막의 5x5 픽셀 영역 (약 0.9μmx0.9μm)을 비추다. 조사 지역은 플라즈마 막을 분할해야한다 나머지는 섬유 (그림 1) 외부되어야 동안은 5x5 상자의 절반이 섬유 내부에 있어야입니다.
- 최대 5 분 동안 오초 각각의 간격으로 섬유에 염색 항목의 이미지를 캡처합니다.
- 형광 염료가 결국 섬유로 endocytosed되므로, 요리 당 더 이상 세 이상 섬유 2.8 단계를 반복하여 모든 데이터 분석을 복잡하게. 3 섬유 후 새로운 요리는 2.5 단계에서 준비되어야합니다.
- 염료 항목의 금액을 측정하기 위해 각 캡처한 프레임 사이의 형광 강도의 변화 (ΔF / F 0) 계산하여 데이터를 분석할 수 있습니다. 이것은 공개 가능한 ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/)로 분석 소프트웨어를 사용하여이 지역에 약 200 μm의의 의미 형광 측정을 필요로합니다. 섬유 사이의 비교 들어, 다음 계산은 각 프레임에 대한하여야한다 : F 0 첫 번째 캡처 프레임 (T = 0; 부상하기 전에)에 대한 관심의 지역의 평균 형광이다 ΔF / F 0,, 그리고 ΔF입니다 이후의 각 프레임의 형광의 변화 (FF 0).
3. 세포막 복구의 동적 프로세스를 모니터하기 위해 셀 공촛점 이미징 라이브
- Micropipettes은 PYREX 모세 혈관에서 만들어졌다. 모세관은 micropipette의 풀러에 위치하고 미리 설정된 프로그램 (열 = 695; = 50를 당겨; 벨 .= 55; 시간 = 250)로 뽑았습니다.
- Micropipette는 3 축 (XYZ) micromanipulator에 붙어 있 었지.
- 세포는 유리 바닥 델타 T 요리에 대한 일반적인 방법을 사용하여 플라스미드 DNA와 transfected 있습니다. 미디어는 2.5mM 칼슘 2 전환되어야합니다 + 실험을 시작 Tyrode 버퍼 전에.
- transfected 세포를 포함하는 유리 요리 40X 1.3NA 기름 침지 목적으로 공촛점 현미경 스캐닝 레이저에 배치했다.
- 급성 라이브 세포 손상은 세포막에 micropipette를 삽입하여 수행하고 신속하게 세포 3,6의 micropipette을 철회했다. 연속 라이브 셀 이미지는 1.54 S / 프레임의 간격으로 획득했다.
- 사포닌 유도 막 장애 분석을위한, 2.5mM 칼슘 2에 0.005 %의 사포닌 (시그마)는 + Tyrode 버퍼는 중력 흐름 맞춤 조립 재관류 시스템 7 perfused했다. 재관류 율은 약 1 ML / 분 및 재관류 팁 직접 몇 군데되는 셀 위에 위치해야합니다.
4. 대표 결과 :
마우스 러닝 머신의 실행의 대표적인 영화가 촬영 중에 만들 수 있습니다. 골격 근육 손상에 의한 생쥐 - 영화는 mg53 - /의 감소 실행 능력을 설명합니다.
위 내용 UV - 레이저 손상 프로토콜로 인한 피해의 정도는 분석 섬유 막 복구 용량에 따라 달라집니다. 이 용량은 섬유가 격리되었던에서 마우스의 유전자형, 세포외 조건 및 단백질 발현 (transfection 또는 감염)에있는 변경에 의해 영향을받습니다. 정상 야생 유형 섬유 염색 항목 (그림 2A)을 중간에 약간의 수 있습니다. mg53 - /에서 파생된 근육 섬유 - 손상 막 수리 능력 마우스 섬유 (그림 2B)에 염료를 더 중요한 항목을 표시합니다.
의 microelectrode 부상 쇼 translocation MG53 함유 vesi를위한 일반적인 검색 결과부상 사이트에 cles. 그림 3A와 3B 쇼 GFP - MG53는 세포막에 micropipette 삽입하여 손상된 C2C12 myotubes을 transfected. micropipette 손상 전에 세포에서 GFP - MG53는 플라즈마 막과 세포질 세 양쪽에 위치해 있습니다. micropipette 보급에 따라, GFP - MG53 포함 vesicles 손상은 사이트 (같은 화살촉으로 표시)으로 옮겼습니다. 그림 3C는 사포닌의 0.005 %, 플라즈마 막을 permeabilize 수있는 세제로 처리 GFP - MG53 transfected C2C12 myoblasts을 보여줍니다. 사포닌 치료시, GFP - MG53는 cytosol에서 세포막을 translocated.
Weisleder, 외. 그림 1. 광섬유 정렬 및 상해 지역 정의.보고 표시된 상해 지역의 정의 분야 내에서 고립 근육 섬유의 적절한 방향.
Weisleder, 외. 그림 2. FDB 섬유. 이미지의 UV 레이저 손상 전에 부상 (0 초, 왼쪽)과 200 초 게시물 부상 (오른쪽)에서 섬유를 보여줍니다. 야생 타입 마우스 (A)에서 섬유가 약간의 부상을 보여줍니다. 손상된 막 수리와 마우스의 섬유는 (B)를 입력 더 많은 염료 수 있습니다.
Weisleder, 외. 그림 3. 교양 세포로 Microelectrode과 사포닌 손상. 이미지 C2C12 myotubes (A, B) 및 부상 (위)와 포스트 부상 (하단)로 사전에 C2C12 myoblast를 (C)를 보여줍니다. microelectrode (A, B)로 부상 세포는 부상 사이트 (화살표)에 MG53 translocation을 보여줍니다. 사포닌 (C) 대우 세포는 세포막에 MG53 translocation을 보여줍니다.
Discussion
러닝 머신의 실행이 치료 동물 운동 부하를 제공에 유용한 방법론이다. 측정 근육 기능이나 내구성 용량 방법으로 그것은 일관되게 재현할 패션 8 실행할 어려운 악명 시끄러운 접근이다. 일반적으로 배기하는 시간은 같은 일부 녹아웃 마우스 라인 9 야생 타입 마우스 사이의 그 같은 실험 그룹간에 큰 차이를 해결하기 위해 끝점으로 사용할 수 있습니다. 같은 일부 제약 시련으로 더 미묘한 차이를 생산 실험 조작이 기술과 관련된 소음 위의 차이를 해결하지 못할 수도 있습니다. 이러한 기술의 재현성과 감도를 극대화하기 위해서는 매우 밀접하게 세션에 세션 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 하루의 시간이 동물뿐만 아니라 사용되는 따뜻한 최대 기간 조건으로 행사되며, 중요한 요소이며, 재판에서 재판을 일관성 유지한다.
생쥐의 일부 변종은 다른 변종보다 러닝 머신에 더 많은 시간을 실행하고 지구력 운동 10 다르게 응답할 수있는 스트레인 효과가 러닝 머신 프로토콜의 설계에 상당한 영향을 줄 수 있습니다. 일반적인 지침으로, 많은 생쥐는 러닝 머신의 속도 상수를 증가 (M / M 시작 후 각 분에 대한 추가 1 5m / m 초기 속도)와 배기 연구에 200-300 총 미터 실행할 수 있습니다. 지구력 훈련은 생쥐 30 분 2 ~ 3 회 일주일 동안 9-12미터 / M 사이 실행할 수 있습니다. 그러나, 개별적인 연구는 일반적으로 개별적인 실험의 요구와 일치하는 프로토콜의 몇 가지 최적화가 필요합니다.
UV - 레이저 손상 절차는 골격근 섬유 3,6,11의 막 수리 능력을 측정하기위한 효과적인 방법으로 표시되었습니다. 이러한 실험의 성공에 한 중요한 구성 요소는 강선의 일반 패턴과 주름이 나타나지 않는 부드러운 sarcolemma과 직선, 막대 모양의 외관을 표시에만 근육 섬유를 사용하는 것입니다. 다른 근육 섬유를 선택하는 경우 멤브레인 손상이 이미 이러한 실험 결과에서 이러한 섬유 및 해석에 존재할 수 복잡한 수 있습니다. 그것은 조사 지역의 섬유 및 정의의 방향이 그림 1에 정의하는 것이 또한 중요합니다. 이 때문에 섬유 사이의 비교를 허용, 재현성 크기의 부상을 제공합니다. 부상의 정의 지역 섬유 내에서 완전히 거짓말을한다면, 내부 부상이 오히려 sarcolemma을 방해 이상 생성됩니다. 또한, ΔF / F 0 계산된 값을 의미 형광의 측정에 대해 선택한 관심 지역에 매우 민감합니다. 약 200μm 2와 부상 사이트를 포함한 인접의 지역이 적합합니다. 부상에 대해 정의된 지역과는 달리,이 지역은 섬유 내에 완전히 거짓말을한다. 당신은 섬유 외부 공간을 포함 시키면 더 심각 표현형와 섬유에 ΔF / F 0 줄이면서, 그 결과 빈 공간이 거의 염색 항목이 섬유에 ΔF / F 0을 증가합니다. 이 때문에 섬유 사이의 비교가 더 어렵게 분석의 감도를 감소시킵니다.
micropipette 손상 분석은 micropipette 및 유리 바닥 요리 사이의 각도를 효과적으로 세포막을 손상하기 위하여 약 45도해야합니다. 세포는 단단히 접시의 바닥에 부착되어야하며 둥근 세포들이 micropipette가 파고 후 분리합니다 대부분 때문에 사용하지 않아야합니다 micropipette 손상에 대한 선정되었습니다. 사포닌의 permeabilzation 실험은 침투 assays을 micropipette에 비해 수행하기 위해 덜 기술적 요구하고 상대적으로 빠르게됩니다. 그러나, 사포닌 그 접시의 다른 세포를 확산하고 손상 때문에 하나의 세포가 접시마다 사용할 수를 포함하여 사포닌 손상 몇 가지 제한이 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rodent treadmill | Columbus Instruments Exer 3/6 or equivalent | ||
| 70 % ethanol | ISC Bioexpress | ||
| Dissection tools including fine tip forceps, spring scissors | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 2 mg/ml collagenase type I | Sigma-Aldrich | ||
| 0 Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma-Aldrich | ||
| 2.5mM Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma-Aldrich | ||
| Temperature controllable orbital shaker | New Brunswick Scientific | ||
| Delta TPG Dish | Fisher Scientific | 1207133 | |
| LSM 510 confocal microscope with an Enterprise 80 mW UV laser or equivalent confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| FM1-43 or FM4-64 dyes | Invitrogen | ||
| Borosilicate Capillaries Size 0.8-1.0 X 100 mm | PYREX | Part No. 9530-2 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | model P-97 | |
| 3 axis micromanipulator | Narishige International | MHW-3 | |
| Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope | Bio-Rad | MHW-3 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 |
References
- Armstrong, R. B., Ogilvie, R. W., Schwane, J. A. Eccentric exercise-induced injury to rat skeletal muscle. J Appl Physiol. 54, 80-93 (1983).
- Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. J Anat. 200, 69-79 (2002).
- Cai, C. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
- Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. Monitoring secretory membrane with FM1-43 fluorescence. Annu Rev Neurosci. 22, 1-10 (1999).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4592-4597 (2003).
- Cai, C. Membrane repair defects in muscular dystrophy are linked to altered interaction between MG53, caveolin-3, and dysferlin. J Biol Chem. 284, 15894-15902 (2009).
- Wang, X. Cardioprotection of ischemia/reperfusion injury by cholesterol-dependent MG53-mediated membrane repair. Circ Res. 107, 76-83 (2010).
- Knab, A. M.
- Zhao, X. Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice. Physiol Genomics. 23, 72-78 (2005).
- Massett, M. P., Berk, B. C. Strain-dependent differences in responses to exercise training in inbred and hybrid mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 288, 1006-1013 (2005).
- Bansal, D. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
