这里描述的是MG53介导的细胞在整个动物的膜修复,并在细胞水平上的动态过程可视化的协议。这些方法可以适用于调查的质膜再加盖印章和再生医学细胞生物学。
急性损伤细胞膜的修复是一个正常的细胞生理学的元素的过程中,已与许多退化的人类疾病和有缺陷的膜修复。最近发现的膜再加盖印章机器的重要组成部分MG53允许以一个更好的组织修复的基础生物学,以及在再生医学的潜力翻译应用分子了解。 :我们在体内的MG53的功能,在使用跑步机上锻炼的小鼠模型协议,用于测试测量到孤立的肌纤维的染料进入体内膜的修复能力,肌肉损伤的修复,探索和监控的动态过程详细的实验协议MG53 -介导的囊泡贩运和使用活细胞共聚焦显微镜培养细胞的细胞膜修复。
跑步机上跑步是一种有用的方法治疗的动物提供一个运动负荷。作为测量肌肉的功能或续航能力方法,它是出了名的嘈杂的方法,是难以执行, 一贯重现时尚8。在一般情况下,消耗体力的时间可以被用来作为终点,以解决重大的实验组之间的差异,如之间的一些基因敲除小鼠的线条和野生型小鼠9。产生更微妙的差异,如一些药品试验,实验操作,可能不会解决上述这种技术带来的噪音的差异。为了最大限度地发挥这些技术的重复性和灵敏度,重要的是保持在会话的条件非常密切。一天的时间行使的动物,以及作为热身期间使用条件,都是重要的因素,从审判审判应保持一致。
应变效应可以跑步机协议的设计上有重大影响,跑步机比其他品系小鼠的某些菌株可以运行更多的时间和不同的反应耐力运动10。作为一般指引,许多小鼠将能够运行在跑步机的速度不断的增加(5 M / M 1 M / M的初始速度为每分钟后开始添加)在用尽研究200-300平方米。对于耐力运动的老鼠可以运行9日至12日之间的M / M 2或30分钟,每周3次。然而,个别的研究,通常会需要一些协议,以配合个别的实验需要优化。
紫外激光损伤过程已被证明是一个有效的方法用于测量骨骼肌纤维膜3,6,11修复能力。这些实验的成功的一个重要组成部分,是只使用肌纤维显示一条直线,杆形美观的条纹的规律和平稳,不会出现皱纹肌膜。如果选择其他的肌肉纤维膜破坏,可能已经在这些纤维和从这些实验结果的解释可能是复杂的。同样重要的是,在图1中定义的纤维方向和照射区域的定义。这提供了一个重复性大小的损伤,从而使纤维之间的比较。如果损伤定义的区域内完全在于纤维,内伤将被创建,而不是破坏肌膜。此外,ΔF/ F 0的计算值是非常敏感的地区平均荧光测量选定的利益。面积大约为200μm2,和包括损伤部位附近,是适当的。受伤定义的区域不同,这方面应该完全躺在内的纤维。如果包括纤维以外的空间,由此产生的空白区域将增加小染料进入纤维 ΔF/ F 0,同时降低更严重的表型纤维ΔF / F 0。这降低了检测的灵敏度,从而使纤维间的比较困难。
对于微量的损伤检测,之间的微管和玻璃底菜的角度应约45度,为了有效地破坏细胞膜。被选为细胞微管损坏,应紧紧地贴盘底部和圆润的细胞不应该,因为最有可能,他们将分离后微量戳。皂素permeabilzation实验技术要求高,相对更快地执行比较微量渗透检测。不过,也有一些局限性皂素的损害,包括只有一个细胞,每皿可用于以来皂素会扩散并破坏其他细胞,菜。
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
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Rodent treadmill | Columbus Instruments Exer 3/6 or equivalent | |
70 % ethanol | ISC Bioexpress | |
Dissection tools including fine tip forceps, spring scissors | World Precision Instruments | |
2 mg/ml collagenase type I | Sigma | |
0 Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma | |
2.5mM Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma | |
Temperature controllable orbital shaker | New Brunswick or equivalent | |
Delta TPG Dish | Fisher Scientific | 1207133 |
LSM 510 confocal microscope with an Enterprise 80 mW UV laser or equivalent confocal microscope | Zeiss | |
FM1-43 or FM4-64 dyes | Invitrogen | |
Borosilicate Capillaries Size 0.8-1.0 X 100 mm | PYREX | Part No. 9530-2 |
Micropipette puller | Sutter Instruments | model P-97 |
3 axis micromanipulator | Narishige | MHW-3 |
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope | BioRad | MHW-3 |
Saponin | Sigma | 47036 |