Hier beschriebenen Protokolle verwendet werden, um den dynamischen Prozess der MG53-vermittelte Zellmembran Reparatur in ganzen Tieren und auf zellulärer Ebene sichtbar machen. Diese Methoden können auf die Zellbiologie der Plasmamembran Wiederverschließen und der regenerativen Medizin untersucht werden.
Die Reparatur der akuten Verletzung an der Zellmembran ist ein elementarer Prozess der normalen zellulären Physiologie und defekte Membran Reparatur hat zu vielen degenerativen Erkrankungen des Menschen in Verbindung gebracht worden. Die jüngste Entdeckung von MG53 als wichtige Komponente der Membran Wiederverschließen Maschinen ermöglicht eine bessere molekulare Verständnis der biologischen Grundlagen der Reparatur von Gewebe, als auch für potenzielle translationale Anwendungen in der regenerativen Medizin. Hier haben wir ausführlich die experimentelle Protokolle für die Erkundung der in vivo Funktion des MG53 in die Reparatur von Muskelverletzungen mit Laufband Protokolle an Mausmodellen, für die Prüfung der ex vivo Membran Reparatur Kapazität durch Messung Farbstoff Einstieg in isolierten Muskelfasern, und für die Überwachung des dynamischen Prozess der MG53-vermittelte Vesikeltransport und Zellmembran Reparatur in kultivierten Zellen mit lebenden Zellen der konfokalen Mikroskopie.
Laufband ist eine nützliche Methode ist die Bereitstellung einer Trainingsbelastung zu den behandelten Tieren. Als eine Methode zur Messung der Muskelfunktion und Ausdauer Kapazität ist ein notorisch lauten Ansatz, der nur schwer in eine gleichbleibend reproduzierbar 8 ausgeführt wird. Im Allgemeinen können Zeiten bis zur Erschöpfung als Endpunkt verwendet werden, um große Unterschiede zwischen den experimentellen Gruppen, wie jene zwischen einigen Knockout-Maus Linien und Wildtyp-Mäusen 9 zu beheben. Experimentelle Manipulationen, die subtiler Unterschied, wie einige pharmazeutische Prozesse zu erzeugen, kann nicht aufgelöst werden Unterschiede über den Lärm mit dieser Technik verbunden sind. Um die Reproduzierbarkeit und Sensitivität dieser Techniken zu maximieren, ist es wichtig, die Bedingungen für Sitzung zu Sitzung sehr eng zu halten. Die Zeit des Tages die Tiere ausgeübt werden, sowie die Aufwärmphase Bedingungen verwendet werden, sind wichtige Faktoren und sollte konsistent bleiben von Versuch zu Versuch.
Verzerrungseffekte können erhebliche Auswirkungen auf die Gestaltung der Laufband-Protokolle, wie bestimmte Stämme von Mäusen kann viel mehr Zeit auf dem Laufband als andere Stämme und reagieren unterschiedlich auf Ausdauertraining 10. Als allgemeine Richtlinie wird viele Mäuse in der Lage sein zu 200-300 Metern insgesamt zu einer Erschöpfung Studie mit konstanter Anstieg der Geschwindigkeit des Laufbandes (5 m / m Anfangsgeschwindigkeit mit 1 m / m pro Minute nach dem Start aufgenommen) laufen. Für ein Ausdauertraining die Mäuse können zwischen 9-12 m / m für 30 Minuten 2 oder 3 mal pro Woche durchgeführt werden. Allerdings werden die einzelnen Studien erfordern in der Regel einige Optimierungen des Protokolls zum individuellen experimentellen Anforderungen entsprechen.
Der UV-Laser-Schaden Verfahren hat sich gezeigt, dass eine effektive Methode zur Messung der Membran Reparatur Kapazität von Skelettmuskelfasern 3,6,11 werden. Ein wesentlicher Bestandteil für den Erfolg dieser Experimente ist es, nur Muskelfasern, die einen geraden, stabförmigen Aussehen Display mit einem regelmäßigen Muster von Rillen und einen reibungslosen Sarkolemm, dass nicht angezeigt wird faltig verwenden. Wenn andere Muskelfasern aktiviert sind Membran beschädigen können bereits vorhanden sein in dieser Fasern und Interpretation der Ergebnisse aus diesen Experimenten kann kompliziert sein. Es ist auch wichtig, dass die Ausrichtung der Faser und der Definition der bestrahlten Region wie in Abbildung 1 definiert werden. Dies stellt eine Verletzung von reproduzierbaren Größe, so dass Vergleich zwischen Fasern. Wenn der definierte Bereich der Verletzung liegt vollständig innerhalb der Faser, wird eine innere Verletzung als Störung des Sarkolemm erstellt werden. Darüber hinaus ist der Wert für &Dgr; F / F 0 berechnet sehr empfindlich auf die Region von Interesse für die Messung der mittleren Fluoreszenz ausgewählt. Eine Fläche von ca. 200 um 2, neben und mit der verletzten Stelle, ist angemessen. Im Gegensatz zu der Region für Verletzungen definiert, sollte dieser Bereich vollständig innerhalb der Faser. Wenn Sie Platz außerhalb der Faser enthalten, werden die daraus resultierenden leeren Bereich &Dgr; F / F 0 in Fasern mit wenig Farbstoff Eintrag zu erhöhen bei gleichzeitiger Senkung der &Dgr; F / F 0 in Fasern mit einem schwereren Phänotyp. Dies verringert die Empfindlichkeit des Tests, wodurch Vergleich zwischen den Fasern erschwert.
Für die Mikropipette Schäden Assay sollte der Winkel zwischen der Mikropipette und Glasboden Schüssel etwa 45 Grad sein, um effektiv Schäden der Zellmembran. Die Zellen wurden für Mikropipette Schaden gewählt werden sollte fest mit dem Boden der Schale angebracht werden und runden Zellen nicht, da die meisten wahrscheinlich werden sie nach Mikropipette Stossen zu lösen. Saponin permeabilzation Experimente sind technisch weniger anspruchsvoll und relativ schneller im Vergleich zu Penetration Tests Mikropipette durchzuführen. Es gibt jedoch mehrere Einschränkungen auf Saponin Schäden, einschließlich, dass nur eine Zelle pro Gericht kann verwendet werden, da Saponin wird diffus und Schäden anderer Zellen in die Schüssel.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
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Rodent treadmill | Columbus Instruments Exer 3/6 or equivalent | |
70 % ethanol | ISC Bioexpress | |
Dissection tools including fine tip forceps, spring scissors | World Precision Instruments | |
2 mg/ml collagenase type I | Sigma | |
0 Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma | |
2.5mM Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma | |
Temperature controllable orbital shaker | New Brunswick or equivalent | |
Delta TPG Dish | Fisher Scientific | 1207133 |
LSM 510 confocal microscope with an Enterprise 80 mW UV laser or equivalent confocal microscope | Zeiss | |
FM1-43 or FM4-64 dyes | Invitrogen | |
Borosilicate Capillaries Size 0.8-1.0 X 100 mm | PYREX | Part No. 9530-2 |
Micropipette puller | Sutter Instruments | model P-97 |
3 axis micromanipulator | Narishige | MHW-3 |
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope | BioRad | MHW-3 |
Saponin | Sigma | 47036 |