Décrites ici sont des protocoles utilisés pour visualiser le processus dynamique de MG53 médiation réparation de la membrane cellulaire chez les animaux entiers et au niveau cellulaire. Ces méthodes peuvent être appliquées pour étudier la biologie cellulaire de refermeture membrane plasmique et la médecine régénérative.
Réparation de lésion aiguë de la membrane cellulaire est un processus élémentaire de physiologie cellulaire normale et réparation de la membrane défectueuse a été lié à de nombreuses maladies dégénératives humaines. La découverte récente de MG53 comme un élément clé de la machinerie rescellage membrane permet une meilleure compréhension moléculaire de la biologie de base de réparation des tissus, ainsi que pour les applications potentielles translationnelle en médecine régénérative. Ici, nous détaillons les protocoles expérimentaux pour explorer la fonction in vivo de MG53 dans la réparation des blessures musculaires en utilisant des protocoles d'exercice sur tapis roulant sur des modèles de souris, pour tester la capacité de la membrane ex vivo par la mesure de réparation de l'entrée du colorant dans les fibres musculaires isolées, et pour le suivi du processus dynamique du trafic vésiculaire MG53-médiation et de réparation dans la membrane cellulaire des cellules cultivées en utilisant la microscopie confocale de cellules vivantes.
Le tapis roulant est une méthodologie utile à fournir une charge d'exercice pour les animaux traités. Comme une méthodologie pour mesurer la fonction musculaire ou la capacité d'endurance, il s'agit d'une approche notoirement bruyants qui est difficile à exécuter d'une manière reproductible 8. En général, les temps d'épuisement peut être utilisé comme un point final pour résoudre les différences majeures entre les groupes expérimentaux, comme ceux entre certaines lignées de souris knock-out et des souris de type sauvage 9. Les manipulations expérimentales qui produisent différence plus subtile, comme certains essais pharmaceutiques, ne peuvent pas résoudre les différences au-dessus du bruit associé à cette technique. Afin de maximiser la reproductibilité et la sensibilité de ces techniques, il est important de maintenir les conditions d'une session à de très près. L'heure de la journée, les animaux sont exercés, ainsi que les conditions chaudes période allant utilisées, sont des facteurs importants et devraient rester cohérentes d'un essai à.
Effets de déformation peuvent avoir un impact significatif sur la conception de protocoles de tapis roulant que certaines souches de souris peut fonctionner pendant beaucoup plus de temps sur le tapis roulant que les autres souches et réagissent différemment à un exercice d'endurance 10. En règle générale, beaucoup de souris sera capable d'exécuter 200-300 mètres au total dans une étude de l'épuisement avec une augmentation constante de la vitesse du tapis roulant (5 m / m vitesse initiale de 1 m / m ajoutée pour chaque minute après le démarrage). Pour un exercice d'endurance des souris peuvent être effectués entre 9 à 12 m / m pendant 30 minutes 2 ou 3 fois par semaine. Cependant, des études individuelles nécessitent habituellement une optimisation du protocole pour correspondre à des besoins individuels expérimental.
La procédure de dommages des rayons UV-laser a été montré pour être une méthode efficace pour mesurer la capacité de réparation de la membrane des fibres musculaires squelettiques 3,6,11. Une composante essentielle à la réussite de ces expériences est d'utiliser des fibres musculaires qui affichent une seule droite, l'aspect en forme de tige avec un motif régulier de stries et d'un sarcolemme lisse qui ne semble pas froissé. Si d'autres fibres musculaires sont sélectionnés endommager les membranes peuvent être déjà présents dans ces fibres et l'interprétation des résultats de ces expériences peuvent être compliquées. Il est aussi important que l'orientation de la fibre et la définition de la région irradiée être tel que défini dans la figure 1. Cette offre d'une blessure de la taille reproductibles, permettant ainsi la comparaison entre les fibres. Si la région définie de blessure se situe complètement dans la fibre, une blessure interne sera créée, plutôt que de perturber le sarcolemme. En outre, la valeur calculée pour AF / F 0 est très sensible à la région d'intérêt choisie pour la mesure de la fluorescence moyenne. Une zone d'environ 200μm 2, adjacente et y compris le site de la lésion, est appropriée. Contrairement à la région définie par une blessure, cette zone devrait se situer complètement à l'intérieur de la fibre. Si vous incluez un espace extérieur de la fibre, la région va augmenter entraînant vierge AF / F 0 en fibres avec une entrée de teinture peu tout en réduisant AF / F 0 en fibres avec un phénotype plus sévère. Cela diminue la sensibilité de l'essai, ce qui rend la comparaison entre les fibres plus difficile.
Pour le dosage de dommages micropipette, l'angle entre la micropipette et le plat à fond de verre devrait être d'environ 45 degrés afin de bien endommager la membrane cellulaire. Les cellules ont été choisis pour les dommages micropipette devrait être étroitement attaché au fond du plat et des cellules arrondies ne doit pas être utilisé car ils seront très probablement se détacher après micropipette piquer. Expériences permeabilzation saponine sont techniquement moins exigeant et relativement plus rapide pour effectuer des tests par rapport à micropipette pénétration. Cependant, il existe plusieurs limites à la saponine dommages, y compris celle d'une seule cellule peut être utilisé par plat, depuis la saponine se diffuse et des lésions d'autres cellules dans ce plat.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
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Rodent treadmill | Columbus Instruments Exer 3/6 or equivalent | |
70 % ethanol | ISC Bioexpress | |
Dissection tools including fine tip forceps, spring scissors | World Precision Instruments | |
2 mg/ml collagenase type I | Sigma | |
0 Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma | |
2.5mM Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma | |
Temperature controllable orbital shaker | New Brunswick or equivalent | |
Delta TPG Dish | Fisher Scientific | 1207133 |
LSM 510 confocal microscope with an Enterprise 80 mW UV laser or equivalent confocal microscope | Zeiss | |
FM1-43 or FM4-64 dyes | Invitrogen | |
Borosilicate Capillaries Size 0.8-1.0 X 100 mm | PYREX | Part No. 9530-2 |
Micropipette puller | Sutter Instruments | model P-97 |
3 axis micromanipulator | Narishige | MHW-3 |
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope | BioRad | MHW-3 |
Saponin | Sigma | 47036 |