Qui descritte sono protocolli utilizzati per visualizzare il processo dinamico della MG53-mediata riparazione membrana cellulare in animali interi ed a livello cellulare. Questi metodi possono essere applicati per studiare la biologia cellulare della medesima membrana plasmatica e la medicina rigenerativa.
Riparazione di lesioni acute alla membrana cellulare è un processo elementare di normale fisiologia cellulare e difettosa riparazione della membrana è stata collegata a molte malattie degenerative umane. La recente scoperta della MG53 come componente chiave della macchina medesima membrana permette una migliore comprensione della biologia molecolare di base della riparazione dei tessuti, così come per potenziali applicazioni traslazionale in medicina rigenerativa. Qui dettaglio i protocolli sperimentali per esplorare la funzione in vivo di MG53 nella riparazione di lesioni muscolo utilizzando protocolli di esercizio al treadmill in modelli murini, per testare la capacità di membrana ex vivo riparazione misurando ingresso colorante in fibre muscolari isolate, e per il monitoraggio del processo dinamico della MG53-mediata traffico di vescicole e membrana riparazione cellulare nelle cellule in coltura di cellule vive usando la microscopia confocale.
Esecuzione tapis roulant è una metodologia utile a fornire un carico di esercizio per gli animali trattati. Come una metodologia per misurare la funzione muscolare o la capacità di resistenza si tratta di un approccio noto rumore che è difficile da eseguire in modo costantemente riproducibile 8. In generale, i tempi di esaurimento può essere utilizzato come un endpoint per risolvere grandi differenze tra i gruppi sperimentali, come quelle tra le linee del mouse alcuni topi knockout e wild-type 9. Manipolazioni sperimentali che producono differenze più sottili, come ad esempio alcune prove farmaceutiche, non può risolvere le divergenze di sopra del rumore associati a questa tecnica. Al fine di massimizzare la riproducibilità e la sensibilità di queste tecniche, è importante mantenere le condizioni per la sessione a sessione molto da vicino. L'ora del giorno gli animali sono esercitate, nonché le condizioni di caldo periodo di presentazione utilizzata, sono fattori importanti e dovrebbero rimanere costanti da prova a prova.
Effetti di deformazione può avere un impatto significativo sulla progettazione di protocolli di tapis roulant come alcuni ceppi di topi può funzionare per molto più tempo sul tapis roulant di altri ceppi e rispondono in modo diverso di esercitare la resistenza 10. Come regola generale, i topi molti saranno in grado di eseguire 200-300 metri totali in uno studio di esaurimento con aumento costante della velocità del tapis roulant (5 m / m velocità iniziale di 1 m / m aggiunto per ogni minuto dopo l'avvio). Per un esercizio di resistenza del topo può essere eseguito tra 9-12 m / m per 30 minuti 2 o 3 volte a settimana. Tuttavia, studi individuali di solito richiedono una ottimizzazione del protocollo per soddisfare esigenze individuali sperimentale.
L'UV-laser procedura danno è stato dimostrato di essere un metodo efficace per misurare la capacità di riparazione della membrana delle fibre muscolari scheletriche 3,6,11. Un componente essenziale per il successo di questi esperimenti è quello di utilizzare le fibre muscolari che visualizzano solo un diritto, aspetto a forma di asta con uno schema regolare di striature e di un sarcolemma liscia che non appare rugosa. Se le fibre muscolari sono selezionati altri danni membrana possono essere già presenti in queste fibre e l'interpretazione dei risultati di questi esperimenti può essere complicata. E 'anche importante che l'orientamento delle fibre e la definizione della regione irradiata essere definito in Figura 1. Questo fornisce una lesione di dimensioni riproducibili, in modo da permettere un raffronto tra le fibre. Se la regione definita di lesioni si trova completamente all'interno della fibra, una lesione interna verrà creato, piuttosto che interrompere il sarcolemma. Inoltre, il valore calcolato per ΔF / F 0 è molto sensibile alla regione di interesse selezionate per la misurazione della fluorescenza media. Una superficie di circa 200μm 2, adiacente e incluso il sito della lesione, è appropriato. A differenza della regione definita per infortunio, questa area dovrebbe trovarsi completamente all'interno della fibra. Se si include lo spazio al di fuori della fibra, l'area risulta vuota aumenterà ΔF / F 0 in fibre con poco colorante riducendo al contempo l'ingresso ΔF / F 0 in fibre con un fenotipo più grave. Questo diminuisce la sensibilità del dosaggio, rendendo così il confronto tra le fibre più difficile.
Per l'analisi danno micropipetta, l'angolo tra la micropipetta e fondo piatto di vetro dovrebbe essere di circa 45 gradi in modo da danneggiare in modo efficace la membrana cellulare. Le cellule sono state scelte per danni micropipetta deve essere strettamente collegato al fondo del piatto e le cellule arrotondate non deve essere utilizzato poiché la maggior parte è probabile che si staccano dopo micropipetta frugando. Esperimenti permeabilzation saponina sono meno tecnicamente impegnativo e piuttosto veloce da eseguire rispetto alla micropipetta test di penetrazione. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni per i danni saponina, comprese che solo una cellula può essere utilizzato per ogni piatto dal saponina si diffonderà e danneggiare le altre cellule in quel piatto.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Rodent treadmill | Columbus Instruments Exer 3/6 or equivalent | |
70 % ethanol | ISC Bioexpress | |
Dissection tools including fine tip forceps, spring scissors | World Precision Instruments | |
2 mg/ml collagenase type I | Sigma | |
0 Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma | |
2.5mM Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma | |
Temperature controllable orbital shaker | New Brunswick or equivalent | |
Delta TPG Dish | Fisher Scientific | 1207133 |
LSM 510 confocal microscope with an Enterprise 80 mW UV laser or equivalent confocal microscope | Zeiss | |
FM1-43 or FM4-64 dyes | Invitrogen | |
Borosilicate Capillaries Size 0.8-1.0 X 100 mm | PYREX | Part No. 9530-2 |
Micropipette puller | Sutter Instruments | model P-97 |
3 axis micromanipulator | Narishige | MHW-3 |
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope | BioRad | MHW-3 |
Saponin | Sigma | 47036 |