전체 동물 MG53 – 중재 세포막 수리 및 세포 수준에서 동적 프로세스를 시각화하는 데 사용되는 프로토콜은 여기에 설명되어 있습니다. 이러한 방식은 플라즈마 막 resealing 및 재생 의학 세포 생물학을 조사하기 위해 적용할 수 있습니다.
세포막에 급성 부상의 복구는 정상적인 세포 생리학의 원소 과정이며, 결함 멤브레인 수리 많은 퇴행성 질병 인간에 연결되어 있습니다. 막 resealing 기기의 핵심 구성 요소로서 MG53의 최근 발견은 기본 조직 수리 생물학뿐만 아니라, 재생 의료에 잠재적 translational 애플 리케이션을위한 더 나은 분자의 이해 수 있습니다. 다음은 세부 고립 근육 섬유에 염료 항목을 측정하여 전 생체내 막 복구 능력을 테스트하기 위해, 마우스 모델에서 러닝 머신 운동 프로토콜을 사용하여 근육 손상의 수리에 MG53의 생체내 기능에 탐구하고 역동적인 과정을 감시하기위한위한 실험 프로토콜을 라이브 세포 공촛점 현미경을 사용하여 교양 세포 MG53 – 중재 소포 밀매와 세포막 수리니다.
러닝 머신의 실행이 치료 동물 운동 부하를 제공에 유용한 방법론이다. 측정 근육 기능이나 내구성 용량 방법으로 그것은 일관되게 재현할 패션 8 실행할 어려운 악명 시끄러운 접근이다. 일반적으로 배기하는 시간은 같은 일부 녹아웃 마우스 라인 9 야생 타입 마우스 사이의 그 같은 실험 그룹간에 큰 차이를 해결하기 위해 끝점으로 사용할 수 있습니다. 같은 일부 제약 시련으로 더 미묘한 차이를 생산 실험 조작이 기술과 관련된 소음 위의 차이를 해결하지 못할 수도 있습니다. 이러한 기술의 재현성과 감도를 극대화하기 위해서는 매우 밀접하게 세션에 세션 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 하루의 시간이 동물뿐만 아니라 사용되는 따뜻한 최대 기간 조건으로 행사되며, 중요한 요소이며, 재판에서 재판을 일관성 유지한다.
생쥐의 일부 변종은 다른 변종보다 러닝 머신에 더 많은 시간을 실행하고 지구력 운동 10 다르게 응답할 수있는 스트레인 효과가 러닝 머신 프로토콜의 설계에 상당한 영향을 줄 수 있습니다. 일반적인 지침으로, 많은 생쥐는 러닝 머신의 속도 상수를 증가 (M / M 시작 후 각 분에 대한 추가 1 5m / m 초기 속도)와 배기 연구에 200-300 총 미터 실행할 수 있습니다. 지구력 훈련은 생쥐 30 분 2 ~ 3 회 일주일 동안 9-12미터 / M 사이 실행할 수 있습니다. 그러나, 개별적인 연구는 일반적으로 개별적인 실험의 요구와 일치하는 프로토콜의 몇 가지 최적화가 필요합니다.
UV – 레이저 손상 절차는 골격근 섬유 3,6,11의 막 수리 능력을 측정하기위한 효과적인 방법으로 표시되었습니다. 이러한 실험의 성공에 한 중요한 구성 요소는 강선의 일반 패턴과 주름이 나타나지 않는 부드러운 sarcolemma과 직선, 막대 모양의 외관을 표시에만 근육 섬유를 사용하는 것입니다. 다른 근육 섬유를 선택하는 경우 멤브레인 손상이 이미 이러한 실험 결과에서 이러한 섬유 및 해석에 존재할 수 복잡한 수 있습니다. 그것은 조사 지역의 섬유 및 정의의 방향이 그림 1에 정의하는 것이 또한 중요합니다. 이 때문에 섬유 사이의 비교를 허용, 재현성 크기의 부상을 제공합니다. 부상의 정의 지역 섬유 내에서 완전히 거짓말을한다면, 내부 부상이 오히려 sarcolemma을 방해 이상 생성됩니다. 또한, ΔF / F 0 계산된 값을 의미 형광의 측정에 대해 선택한 관심 지역에 매우 민감합니다. 약 200μm 2와 부상 사이트를 포함한 인접의 지역이 적합합니다. 부상에 대해 정의된 지역과는 달리,이 지역은 섬유 내에 완전히 거짓말을한다. 당신은 섬유 외부 공간을 포함 시키면 더 심각 표현형와 섬유에 ΔF / F 0 줄이면서, 그 결과 빈 공간이 거의 염색 항목이 섬유에 ΔF / F 0을 증가합니다. 이 때문에 섬유 사이의 비교가 더 어렵게 분석의 감도를 감소시킵니다.
micropipette 손상 분석은 micropipette 및 유리 바닥 요리 사이의 각도를 효과적으로 세포막을 손상하기 위하여 약 45도해야합니다. 세포는 단단히 접시의 바닥에 부착되어야하며 둥근 세포들이 micropipette가 파고 후 분리합니다 대부분 때문에 사용하지 않아야합니다 micropipette 손상에 대한 선정되었습니다. 사포닌의 permeabilzation 실험은 침투 assays을 micropipette에 비해 수행하기 위해 덜 기술적 요구하고 상대적으로 빠르게됩니다. 그러나, 사포닌 그 접시의 다른 세포를 확산하고 손상 때문에 하나의 세포가 접시마다 사용할 수를 포함하여 사포닌 손상 몇 가지 제한이 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
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Rodent treadmill | Columbus Instruments Exer 3/6 or equivalent | |
70 % ethanol | ISC Bioexpress | |
Dissection tools including fine tip forceps, spring scissors | World Precision Instruments | |
2 mg/ml collagenase type I | Sigma | |
0 Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma | |
2.5mM Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma | |
Temperature controllable orbital shaker | New Brunswick or equivalent | |
Delta TPG Dish | Fisher Scientific | 1207133 |
LSM 510 confocal microscope with an Enterprise 80 mW UV laser or equivalent confocal microscope | Zeiss | |
FM1-43 or FM4-64 dyes | Invitrogen | |
Borosilicate Capillaries Size 0.8-1.0 X 100 mm | PYREX | Part No. 9530-2 |
Micropipette puller | Sutter Instruments | model P-97 |
3 axis micromanipulator | Narishige | MHW-3 |
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope | BioRad | MHW-3 |
Saponin | Sigma | 47036 |