Summary
يوصف إجراء فعال لتقييم النزوع oligomerization من المجالات عبر الغشاء المفرد مرور (TMDS). يتم التعبير عن البروتينات خيالية تتكون من انظمة الدفاع الصاروخى التكتيكى لتنصهر في ToxR مراسل سلالة E. القولونية. TMD بفعل أسباب oligomerization dimerization من ToxR ، وتفعيل النسخ وإنتاج البروتين المراسل ، - غالاكتوزيداز.
Abstract
رأي التبسيط من المجالات عبر الغشاء البروتين هو مجرد المراسي في طبقات ثنائية فسفوليبيد منذ زمن طويل ثبت بطلانها. في كثير من الحالات تطورت الأغشية التي تغطي البروتينات آليات متطورة للغاية للعمل. 1-3 وإحدى الطرق التي يمكن أن تعدل بروتينات غشاء هياكلها ووظائفها هي عن طريق الاتصال المباشر ومحددة من اللوالب مسعور ، وتشكيل oligomers عبر الغشاء منظم. 4،5 الأخيرة الكثير وقد تركز العمل على توزيع الأحماض الأمينية وجدت في بيئة تفضيلي غشاء مقارنة محلول مائي والقوات بين الجزيئات المختلفة التي تدفع الجمعيات البروتين. 6،7 ومع ذلك ، فإن الدراسات الاعتراف الجزيئية في المجال للبروتينات عبر الغشاء لا يزال متخلفا عن تلك التي للذوبان في الماء المناطق. لا تزال هناك عقبة رئيسية : على الرغم من خصوصية ملحوظة والتي تقارب oligomerization عبر الغشاء يمكن أن يحقق ، 8 القياس المباشر انتماءاتهم ليست هينة. يمكن أن تعوق تطبيق المنهجيات التقليدية لدراسة الغشاء لا يتجزأ من وظيفة البروتين اللاانحلال المتأصلة في متواليات تحت الفحص. يمكن رؤى البيوفيزيائية المكتسبة من دراسة المجالات التي تمثل الببتيدات الاصطناعية عبر الغشاء تقدم نظرة هيكلية مفيدة. ومع ذلك ، شكك في كثير من الأحيان أهميتها البيولوجية للmicellar المنظفات أو أنظمة الحويصلية المستخدمة في هذه الدراسات لتقليد الأغشية الخلوية ؛ لا الببتيدات اعتماد هيكل الأم تشبه في ظل هذه الظروف وسلوكهم الوظيفي لا تعكس حقا طريقة العمل داخل غشاء الأم ؟ تطوير مختبر Langosch لدراسة التفاعلات بين متواليات عبر الغشاء في طبقات ثنائية فسفوليبيد الطبيعية ، والمقايسات ToxR مراسل النسخي. يعبر 9 المجال عبر الغشاء من الفائدة وهو بروتين خيالية مع بروتين ملزمة المالتوز عن الموقع إلى الجبلة المحيطية وToxR تقديم تقرير مستوى oligomerization (الشكل 1).
في العقد الماضي ، العديد من المجموعات الأخرى (مثل Engelman ، DeGrado ، شاي) وكذلك تحسين تطبيق هذا الاختبار مراسل ToxR. 10-13 والمقايسات ToxR مختلف اصبحت معيار الذهب لاختبار البروتين البروتين التفاعلات في أغشية الخلايا. نظهر هنا عملية نموذجية تجريبية أجريت في المختبر لدينا في المقام الأول الذي يلي البروتوكولات التي وضعتها Langosch. هذا الأسلوب ينطبق عموما مفيدة لتحليل الذات عبر الغشاء الجمعيات في مجال E. القولونية ، حيث يتم استخدام β - غالاكتوزيداز الإنتاج لتقييم النزوع oligomerization انظمة الدفاع الصاروخى التكتيكى. TMD المحرض على dimerization ، ToxR بربط المروج CTX مما يصل تنظيم الجينات LacZ لغالاكتوزيداز - β. يتم الحصول على قراءات اللونية التي ONPG إضافة إلى خلايا lyzed. حلمهي تشطر من ONPG بواسطة β - غالاكتوزيداز النتائج في إنتاج أنواع ضوء تمتص س nitrophenolate (ONP) (الشكل 2).
Protocol
1. الاستنساخ اعتبارات
- يمكن ligated [أليغنوكليوتيد] أعد تجاريا يمثلون المصالح TMD محاط NheI والمواقع وتقييد BamHI 5' - فسفرته في pTox7 (تعديلها في المختبر لدينا من قبل الإدراج من الزوج قاعدة واحدة مباشرة بعد تقييد موقع BamHI 14) (الشكل 3) هضمها بالتسلسل مع BamHI وNheI. وأبدت قليل النوكليوتيد المثال أدناه :
5'ctagcTMDSEQUENCEg3 '
3 'gTMDSEQUENCEcctag5'
وينبغي أن يكون تسلسل TMD 12-24 البقايا (ويفترض أن تكون أقصر متواليات ممدود من قبل مخلفات ناقلات مسعور المشفرة). من أجل التحقيق في الواجهة ، ينبغي إنشاء أربعة أنواع من تصميم انظمة الدفاع الصاروخى التكتيكى الإدراج حيث بقايا متسلسلة ويصاحب ذلك نتيجة مخلفات الحذف في تناوب النسبي لانظمة الدفاع الصاروخى التكتيكى ToxR. 15،16 وأخيرا ، يجب أن تكون متنوعة وتركز أرابينوز بين 0.001 و 0.01 ٪ (ث / ت) لتحديد تركيز حيث لوحظ اختلاف في أقصى β - غالاكتوزيداز الإشارات بين متواليات TMD مختلفة ؛ اختبار مستويات التعبير المختلفة لتحديد أوصت الشروط التي بموجبها يمكن تمييز الانتماءات المختلفة أفضل. بالإضافة إلى أرابينوز والمضادات الحيوية ، ويمكن استخدام 0.4 ملي IPTG لتعزيز الصلات بين الاختلافات في TMDS مختلفة. وينبغي إجراء قياس ToxR على الأقل في quadruplicate. وينبغي تكرار هذا الإجراء كله ثلاث مرات على الأقل مع التحولات البلازميد مختلفة.
2. نمو الثقافات البكتيرية
- أذاب بلطف FHK12 الخلايا المختصة (200 ميكرولتر) على الجليد ونقل في أنبوب 15 مل الثقافة. إضافة DNA البلازميد (200 نانوغرام) ، واحتضان الخلايا على الثلج لمدة 30 دقيقة.
- حرارة صدمة الخلايا الحضانة لمدة 90 ثانية في درجة حرارة 42 درجة مئوية ، تليها الحضانة على الجليد لمدة 2 دقيقة.
- إضافة SOC وسائل الإعلام (800 ميكرولتر) ، واحتضان العينات عند 37 مع اهتزاز (300 دورة في الدقيقة) لمدة ساعة درجة مئوية
- تلقيح 5 مل مع وسائل الاعلام LB الكلورامفينيكول (30 ميكروغرام / مل) ، وأرابينوز (0.0025 ٪ ث / ت) مع 50 ميكرولتر من الخليط التحول في 15 مل من أنابيب الثقافة في ثلاث نسخ. احتضان عينات في 37 مع اهتزاز (300 دورة في الدقيقة) لمدة 20 ساعة درجة مئوية (يمكن أن تستخدم بدلا من 5 ميكرولتر من ثقافة لتطعيم 100 ميكرولتر من المتوسطة في لوحة 96 - جيدا. وهذه الطريقة مفيدة عند التعامل مع أعداد كبيرة من العينات ، وعلى الرغم من الأخطاء وسوف يكون أعلى قليلا. ومن أجل تجنب التبخر ، مما سيؤدي للخطأ ، وملء الآبار الأبعد مع وسائل الاعلام ، ولكن لا تستخدمها للحصول على عينات وأخيرا ، انقر نقرا مزدوجا التفاف المشترك بين الغطاء والصفيحة مع parafilm).
3. قياس نشاط β - غالاكتوزيداز
- تسخين لوحة قارئ الى 28 درجة مئوية.
- نقل Z - المخزن في المستودع مع طرف ماصة كبيرة ، مع التأكد من تناول فقط العليا (المائي) طبقة. نقل 100 ميكرولتر من Z-buffer/chloroform الطازجة إلى آبار لوحة 96 - جيدا. نقل 5 ميكرولتر من كل ثقافة في آبار من لوحة في quadruplicate. حذفت الثقافة من أربعة آبار التي ستكون بمثابة فارغة.
- قياس OD 595 من لوحة لتحديد كثافة الخلية.
- إضافة ميكرولتر من 50 Z-buffer/SDS لجميع الآبار من لوحة. تهز القارئ لوحة في لوحة لمدة 10 دقيقة إلى lyze الخلايا. تأكد من الايقاف الخلية واضحة بعد تحلل وكرر الخطوة تهز إذا لزم الأمر. تحلل ناقصة لم يكن يوحي Z-buffer/chloroform الطازجة.
- إضافة 50 ميكرولتر الطازجة Z-buffer/ONPG لجميع الآبار وعودة لوحة للقارئ لوحة ، وقياس كل OD 405 ق 30 لمدة 20 دقيقة.
- حساب β - غالاكتوزيداز النشاط باستخدام المعادلة التالية (تذكر لطرح فارغة). ينبغي أن تحسب نسبة OD 405 / دقيقة باستخدام كافة نقاط البيانات في نطاق 405 OD 0،0-1،0 باستخدام تناسب النموذج الخطي.
وحدات ميلر تختلف أحيانا عندما سجلت في أيام مختلفة. لذا ، ينبغي أن يقاس بناء مرجعية مثل برنامج العمل العالمي في كل اختبار. ويمكن استخدام قيمها لتطبيع القيم ToxR.
4. الرقابة على التعبير البروتين
- أداء الغربية النشاف للتحقق من التعبير حتى بين البنى البروتين. تجمع 50 ميكرولتر ثقافات ثلاث نسخ وأجهزة الطرد المركزي (2000 دورة في الدقيقة ، 4 دقيقة) في microcentrifuge. إزالة طاف بواسطة pipetting وresuspend الكرية المتبقية في المخزن 2 × عينة التحميل.
- تحميل 7.5 ميكرولتر على مستوى 8 ٪ هلام وتنفيذ استخدام الاستشراد عند 125 V لل1 دقيقة 5 ساعة. بعد نقل واحتضان مع الضد HRP - مترافق مكافحة MBP وتصور ؛ لوحظ أن البروتين خيالية في حوالي 70 كيلو دالتون مع بعض المنتجات تدهور ينظر أحيانا حوالي 48 كيلو دالتون. ومن الملاحظ أيضا MBP الذاتية في 45 كيلو دالتون (انظر الشكل 5).
5. الرقابة على الإدراج غشاء السليم
ويستخدم خط خلية من نقص في البروتين ملزمة المالتوز لتقييم المناسبة الإدراج الغشاء من بناء انظمة الدفاع الصاروخى التكتيكى خيالية. عندما نمت على وسائل الاعلام مع الحد الأدنى من المالتوز كمصدر وحيد للكربون ، والخلايا الوحيدة التي تعبر عن غشاء يتجزأ المنتج التعبير مع البروتين الموجود المالتوز ملزمة بشكل صحيح إلى الجبلة المحيطية هي قادرة على النمو.
- تحويل خلايا PD28 (كما هو موضح لFHK12 الخلايا) وتطعيم 2 مل من المتوسط LB. تنمو الخلايا في 37 مع اهتزاز (300 دورة في الدقيقة) درجة مئوية خلال الليل.
- بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 3500 دورة في الدقيقة ، 10 دقيقة ، 4 درجات مئوية ، وأغسلها في برنامج تلفزيوني عن طريق إعادة تعليق (2 مل) من قبل pipetting لطيف مع طرف vortexing كبيرة أو لطيف. بيليه الخلايا (على النحو الوارد أعلاه) ، ويغسل مع برنامج تلفزيوني للمرة الثانية ، وبيليه resuspend أخيرا في برنامج تلفزيوني (1 مل).
- 25 ميكرولتر استخدام الخلايا معلق لتطعيم 5 الحد الأدنى من وسائل الاعلام مل في ثلاث نسخ ، واحتضان مع اهتزاز عند 37 (300 دورة في الدقيقة) درجة مئوية. تأخذ OD 595 قراءات بين 15-25 ساعة ، وتقريبا كل ساعة 2 بواسطة نقل 200 ميكرولتر من كل عينة إلى لوحة 96 - جيدا والقراءة باستخدام لوحة قارئ.
6. ممثل النتائج :
مثال للاستخدام مقايسة مراسل الترانسكربتي ToxR لتحليل النزعة oligomerization عبر الغشاء في المجالات المبينة في الشكل 4. سبق لدينا التحقيق في oligomerization المجالات عبر الغشاء من multispanning الأغشية لا يتجزأ من البروتين غشاء الكامنة البروتين - 1 (LMP - 1) من خلال تقنيات مختلفة ، من بينها 14 ToxR ظهر المجال عبر الغشاء خمسة (TM5) يحمل نزعة قوية لoligomerize. ويتجلى ذلك من خلال وحدات ميلر عالية وقابلة للمقارنة لرقابة إيجابية ، GPA ، تسلسل راسخة dimerizing. تحور الضارة في TM5 ، D150A ، ويقلل من قدرة تسلسل لoligomerize. LMP - 1 TM1 لا oligomerize كبيرة والمعارض وحدة ميلر منخفضة جدا الإشارة ، مجرد الإشارة أعلاه لفارغة ، وخلايا FHK12 غير المتحول.
الشكل 1. كارتون مسيئة للمقايسة مراسل ToxR. المجال عبر الغشاء (TMD) مدفوعة النتائج oligomerization في dimerization من ToxR وتفعيل النسخ LacZ. الجين المنتج للLacZ ، يمكن كميا β - غالاكتوزيداز كمقياس للميل لانظمة الدفاع الصاروخى التكتيكى لoligomerize.
الشكل 2 ، وتشطر حلمهي من ONPG بواسطة β - غالاكتوزيداز النتائج في إنتاج أنواع ضوء تمتص س nitrophenolate (ONP).
الشكل 3. خريطة البلازميد من pToxR7.
الشكل 4. الممثل ToxR مقايسة مراسل الترانسكربتي تحليل الميل oligomerization من البروتين غشاء الكامنة - 1 المجالات عبر الغشاء. المجال عبر الغشاء 5 (TM5) oligomerizes بقوة ، في حين عبر الغشاء المجال 1 (TM1) المعارض سوى التفاعل الضعيف. D150A طفرة في TM5 يقلل بشكل كبير من قدرتها على oligomerize. يتم تضمين برنامج العمل العالمي كتسلسل إيجابية للسيطرة dimerization قوية. يمثل فارغة untransformed FHK12 الخلايا.
الشكل 5. طخة غربية للتعبير البروتين.
الشكل 6. PD28 مقايسة تكامل للسيطرة على غشاء الإدراج الصحيح إلى الجبلة المحيطية. السيطرة السلبية يمثل نقص في بناء البروتين ملزمة المالتوز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في مقايسة ToxR مراسل الترانسكربتي هو وسيلة سهلة لتحديد تسلسل عبر الغشاء مع احتمال oligomerize. منذ التفاعلات التي تحدث داخل الغشاء الداخلي البكتيرية ، وهذا الاختبار تلتف حول القضايا المرتبطة بصحة نظم الدراسة في بيئات المحاكاة الأغشية. نظرا إلى أن الاستنساخ يمكن بسهولة من TMDS متعددة في البلازميد واحد أن يتم بالتوازي ويمكن تنفيذ الفحص بأكمله في 96 - جيدا شكل لوحة ، يمكن استخدام هذا الاختبار لتحليل إنتاجية عالية لأعداد كبيرة من سلاسل بروتين (17). وبمجرد ان يرى تم الكشف عن التفاعل ، ويمكن استجوابه بقايا مفتاح الفنية من خلال تحليل طفرية ، مما يسمح للتعيين من الميزات الهيكلية المعنية. في كثير من الحالات ، وتحليل البروتينات عبر الغشاء البلورات هي الإشكالية ، وتتطلب أدوات بديلة مثل مقايسة ToxR لوضع الأسس الجزيئية وظيفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر المعهد الوطني للصحة (1R21CA138373 وانهض لمكافحة السرطان (SU2C) عن الدعم المالي لهذا العمل. HY تشعر بالامتنان للحصول على جائزة Elion 2009 من الجمعية الأمريكية لأبحاث السرطان ، وهي جائزة الباحث كيميل من مؤسسة سيدني كيميل ل أبحاث السرطان (SKF - 08 - 101) ، وكلية المؤسسة الوطنية للعلوم في وقت مبكر جائزة شهادة (NSF0954819).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI restriction enzyme | Invitrogen | 15201023 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| NheI restriction enzyme | Invitrogen | 15444011 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| 15 mL culture tubes | Fisher Scientific | 14-956-1J | |
| SOC media | TEKnova, Inc. | S0225 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| LB media | Sigma-Aldrich | L7275 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | CO378 | Stock solution of 30 mg/ mL in ethanol stored in freezer |
| Arabinose | Fluka | 10839 | Stock solution of 2.5% (w/v) in water stored in freezer |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6858-06 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Sodium dodecylsulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| 2-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside (ONPG) | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Z-buffer | 16.1 g Na2HPO4 5.5g NaH2PO4 0.75g KCl 0.246g MgSO4 Make up to 1 l, pH 7.0 |
||
| Z-buffer/chloroform | 200 mL β-mercapt–thanol, 2 mL chloroform, make up to 20 mL with Z-buffer. Vortex for 1 min, centrifuge for 1 min at 800 rpm. Make fresh for each plate. | ||
| Z-buffer/SDS | 160 mg SDS dissolved in 10 mL Z-buffer | ||
| Z-buffer/ONPG | 40 mg ONPG in 10 mL Z-buffer. Make fresh for each plate | ||
| β-mercapt–thanol | Calbiochem | 444203 | |
| Anti-MBP monoclonal antibody (HRP conjugated) | New England Biolabs | E8038S | |
| Minimal media with maltose | 1 x M9 salts, 0.4% maltose, 1 mg/ mL thiamin, 2 mM MgSO4 | ||
| 96-well flat bottom plate | Sarstedt Ltd | 83.1835.300 | |
| Plate-reader | Beckman Coulter Inc. | DTX880 Multimode Detector | |
| Water bath | VWR international | 89032-204 | |
| Shaking incubator | Forma Scientific |
References
- Parker, M. S. Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices. Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).
- Mo, W., Zhang, J. T. Oligomerization of human ATP-binding cassette transporters and its potential significance in human disease. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 1049-1063 (2009).
- von Heijne, G. Membrane-protein topology. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 909-918 (2006).
- Van Horn, W. D. Solution nuclear magnetic resonance structure of membrane-integral diacylglycerol kinase. Science. 324, 1726-1729 (2009).
- Hattori, M. Mg(2+)-dependent gating of bacterial MgtE channel underlies Mg(2+) homeostasis. Embo J. 28, 3602-3612 (2009).
- Ulmschneider, M. B., Sansom, M. S. Amino acid distributions in integral membrane protein structures. Biochim Biophys Acta. 1512, 1-14 (2001).
- Deber, C. M., Goto, N. K. Folding proteins into membranes. Nat Struct Biol. 3, 815-818 (1996).
- Gerber, D., Shai, Y. In vivo detection of hetero-association of glycophorin-A and its mutants within the membrane. J Biol Chem. 276, 31229-31232 (2001).
- Langosch, D., Brosig, B., Kolmar, H. p, Fritz, H. J. Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator. J Mol Biol. 263, 525-530 (1996).
- Russ, W. P., Engelman, D. M. TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 863-868 (1999).
- Berger, B. W. Consensus motif for integrin transmembrane helix association. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 703-708 (2010).
- Oates, J., King, G., Dixon, A. M. Strong oligomerization behavior of PDGFbeta receptor transmembrane domain and its regulation by the juxtamembrane regions. Biochim Biophys Acta. 1798, 605-615 (2010).
- Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins. J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).
- Sammond, D. W. Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1. , Forthcoming (2010).
- Li, R. Dimerization of the transmembrane domain of Integrin alphaIIb subunit in cell membranes. J Biol Chem. 279, 26666-26673 (2004).
- Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper. J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).
- Finger, C., Escher, C., Schneider, D. The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions. Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).
