Summary
一个高效的程序，以评估单通跨膜结构域的寡聚化倾向（TMDS）描述。融合到ToxR的战区导弹防御系统组成的嵌合蛋白在大肠杆菌记者应变中表达。 TMD诱导齐聚的原因ToxR，记者蛋白的转录和生产，半乳糖苷酶的激活二聚体。
Abstract
蛋白质跨膜结构域的过于简单化的看法只是在磷脂双层锚早已disproven。跨膜蛋白在许多情况下，已经发展了高度复杂的行动机制。1-3的一种方式在膜蛋白可以调节自己的结构和功能是疏水螺旋的直接和具体的联系，形成结构化的跨膜低聚物4,5近来工作的重点分布在膜环境优先氨基酸在水溶液和不同的分子间作用力，驱动蛋白协会。6,7然而，在跨膜结构域的蛋白质的分子识别研究仍落后于那些滞后相比水溶性地区。一个主要的障碍依然存在：尽管跨膜齐聚可以实现显着的特异性和亲和力，他们协会的8直接测量是具有挑战性的。可应用的整合膜蛋白的功能研究的传统方法阻碍了固有的不溶性考试序列。生物物理研究代表跨膜结构域的合成肽获得的见解可以提供有用的结构的洞察力。然而，洗涤剂胶束或在这些研究中用来模仿细胞膜的脂质体系统的生物相关性往往是质疑;做肽在这些条件下采取类似母语的结构和其功能的行为，真正体现内的原生膜的行动模式？为了研究天然磷脂双层的跨膜序列之间的相互作用，Langosch实验室开发ToxR转录记者分析。利益的跨膜结构域嵌合蛋白与麦芽糖结合蛋白的位置，周质和ToxR表示提供的一份报告齐聚水平（图1）。
在过去的十年中，几个其他团体（如Engelman，DeGrado，夏嘉曦）进一步优化和应用这ToxR记者分析。10-13各种ToxR检测已成为金标准，以测试在细胞膜蛋白质相互作用。我们在此展示一个典型的实验操作，在我们的实验室，主要如下Langosch开发协议中进行。这个普遍适用的方法是非常有用的跨膜结构域自我协会在大肠杆菌中的分析大肠杆菌 ，其中β-半乳糖苷酶的生产是用来评估TMD齐聚倾向。战区导弹防御系统，诱导二聚化后，ToxR结合造成的β-半乳糖苷酶的LacZ基因调节的 CTX发起人。 ONPG除了lyzed细胞是通过比色读数。生产的光吸收物种O - nitrophenolate（ONP）（图2）中的β-半乳糖苷酶结果的ONPG水解断裂。
Protocol
1。克隆的注意事项
- NheI和BamHI酶切位点和5' -磷酸两侧的利益的战区导弹防御系统的商业化准备寡核苷酸可以连接到pTox7（我们实验室的一个碱基对的插入，修改后直接酶 BamHI酶切位点14）（图3）消化顺序用BamHI和NheI。寡核苷酸是一个例子所示：
5'ctagcTMDSEQUENCEg3“
3“gTMDSEQUENCEcctag5”
TMD的顺序应该是12-24残基（短序列大概拉长矢量编码的疏水残基）。为了调查的接口，顺序残留的插入和随之而来的残留删除ToxR的战区导弹防御系统的相对旋转的结果 。15,16最后，阿拉伯糖的浓度应在0.001和0.01％之间不同，应建立战区导弹防御系统的设计的4个变种（W / V）来确定观察到的最大的差异是在不同的战区导弹防御系统的序列之间的β-半乳糖苷酶信号的浓度;测试不同表达水平的建议，以确定下可以区分不同的亲和力最好的条件。除了阿拉伯糖和抗生素，IPTG的0.4毫米，可用于增强亲和力的差异不同的TMDS。 ToxR测量应至少一式四份。整个过程应重复至少三次不同质粒转换。
2。生长的细菌培养
- 轻轻解冻FHK12主管冰和转移到15 ml培养管细胞（200μL）。加入质粒DNA（200纳克）和细胞在冰上孵育30分钟。
- 热休克细胞孵育90小号在42℃，孵育2分钟冰。
- 添加SoC媒体（800μL），并在37样品°摇晃一小时（300转）彗星
- 氯霉素（30微克/毫升）和阿拉伯糖（0.0025％W / V）一式三份在15毫升培养管改造的混合物50μL接种5毫升LB培养基。孵育样品在37℃，摇晃20小时（300转） （或者5μL文化可以被用来在96孔板接种100μL介质处理大量样品时，这种方法非常有用，但错误会稍高。为了避免蒸发，这将导致错误，填补与媒体的最外层的水井，但不使用他们的样品，最后，双包装盖子和封口膜板之间的联合）。
3。测量的β-半乳糖苷酶的活性
- 板阅读器预热至28 ° C。
- 转移到一个水库的Z -缓冲，具有较大的枪头，确保只占用上层（水层）。将一个96孔板的孔100μL新鲜准备Z-buffer/chloroform。转移到板一式四份井5μL每一种文化。忽略文化的四口井将作为空白。
- 测量外径595 的板，以确定细胞密度。
- 加入50μL的Z-buffer/SDS板的所有油井。 10分析细胞板，摇板阅读器。确保细胞悬浮液是明确的裂解后，如果需要重复晃动一步。不完全溶解建议Z-buffer/chloroform是不新鲜配制。
- 加入50μL新鲜配制Z-buffer/ONPG所有的井，并返回该板块的酶标仪和测量外径405每20分钟30秒。
- 在使用下列公式（记住要减去空白）计算β-半乳糖苷酶的活性。外径405 /分的比例应该是使用所有数据点的OD 405范围0.0到1.0采用线性模型的拟合计算。
米勒的单位不同，有时在不同的日子记录。因此，这样的全球行动纲领“的参考构造应在每个测试测量。其值可用于ToxR值正常化。
4。蛋白表达的控制
- 执行免疫印迹验证甚至之间的结构蛋白的表达。结合在离心50μL一式三份的文化和离心（2000转，4分钟）。吹打取出上清，重悬在2个样品上样缓冲液的残留颗粒。
- 在一个标准的8％凝胶负载7.5μL进行电泳125 V为1小时5分钟。传输后，孵化，与抗- MBP HRP标记抗体和可视化;嵌合蛋白有时看到一些大约48 kDa的降解产物在约70 kDa的观察。内源性的MBP也观察到在45 kDa的（见图5）。
5。控制适当的膜插入
麦芽糖结合蛋白缺失的细胞系在使用，以评估适当的膜插入嵌合的战区导弹防御系统的构造。当最小的媒体作为唯一碳源生长与麦芽糖，只有正确位于周质麦芽糖结合蛋白的表达不可或缺的一种膜表达产物能够成长。
- 变换PD28细胞（如FHK12细胞所述），接种2毫升LB培养基。细胞增长37 ° C的晃动（300转）过夜。
- 在3500转离心沉淀细胞，10分钟，4 ° C和再悬浮在PBS（2毫升）洗轻柔吹打一个大型尖或温和的震荡。颗粒的细胞（如上述），第二次用PBS洗，颗粒，最后悬浮在PBS（1毫升）。
- 使用25μL重悬细胞接种5毫升，一式三份，并培育基本培养基，在37 °（300转）用颤抖的彗星。 15-25小时，大约每2小时转移到96孔板和使用的板块，读者的阅读每个样品200μLOD 595读数。
6。代表性的成果：
ToxR转录报告基因检测分析如图4所示的跨膜结构域的寡聚化倾向使用的一个例子。以前，我们进行了调查跨膜齐聚的multispanning膜的组成蛋白质的潜伏膜蛋白1（LMP - 1）通过各种技术，包括ToxR 14个跨膜结构域五（TM5）表现出强烈的倾向oligomerize的;这是证明高米勒单位，与阳性对照，GPA，以及建立dimerizing序列。一个有害突变，D150A，TM5降低oligomerize序列的能力。 LMP - 1的TM1不显着oligomerize和展品一个非常低的米勒单位略高于空白，非FHK12细胞转化的信号，信号。
图1。卡通描绘ToxR记者分析。 ToxR和LacZ基因转录的激活二聚体跨膜结构域（TMD）的驱动齐聚结果。 LacZ基因产物，β-半乳糖苷酶可以量化作为衡量oligomerize一个战区导弹防御系统的倾向。
图2。生产的光吸收物种O - nitrophenolate（ONP）的β-半乳糖苷酶结果的ONPG水解断裂。
图3。pToxR7质粒图谱。
图4。代表ToxR转录报告基因检测分析潜伏膜蛋白1的跨膜结构域的寡聚化倾向。跨膜结构域5（TM5）oligomerizes强烈，而跨膜结构域1（TM1）展品只有弱相互作用。 TM5 D150A突变显着降低能力oligomerize。 GPA是作为一个强大的二聚体阳性对照序列。空白表示未转换FHK12细胞。
图5。蛋白表达的免疫印迹。
图6。PD28互补的检测，以控制正确的膜插入到周质。阴性对照代表缺乏麦芽糖结合蛋白的构造。
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Discussion
ToxR转录报告基因检测是一个浅显的方式，以确定有oligomerize潜力的跨膜序列。由于内的细菌内膜发生的相互作用，这个实验绕过膜模仿的环境中学习系统的有效性相关的问题。这个实验，克隆到一个单一的质粒多个TMDS可以很容易地并行执行，并可以进行整个实验在96孔板格式，可用于高通量分析蛋白质序列的大量。一旦17已检测到的相互作用，可关键的功能残留审问突变分析，使所涉及的结构特征映射。在许多情况下，跨膜蛋白的晶体结构分析是有问题的的，需要替代的工具，如ToxR检测，建立功能的分子基础。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢美国国立卫生研究院（1R21CA138373站起来，对这项工作的财政支持（SU2C）癌症。HY是感激，2009年亿利奖由美国癌症研究，从悉尼金梅尔基金会金梅尔学者奖协会癌症研究中心（SKF - 08 - 101），和美国国家科学基金会教师早期职业奖（NSF0954819）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI restriction enzyme | Invitrogen | 15201023 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| NheI restriction enzyme | Invitrogen | 15444011 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| 15 mL culture tubes | Fisher Scientific | 14-956-1J | |
| SOC media | TEKnova, Inc. | S0225 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| LB media | Sigma-Aldrich | L7275 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | CO378 | Stock solution of 30 mg/ mL in ethanol stored in freezer |
| Arabinose | Fluka | 10839 | Stock solution of 2.5% (w/v) in water stored in freezer |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6858-06 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Sodium dodecylsulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| 2-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside (ONPG) | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Z-buffer | 16.1 g Na2HPO4 5.5g NaH2PO4 0.75g KCl 0.246g MgSO4 Make up to 1 l, pH 7.0 |
||
| Z-buffer/chloroform | 200 mL β-mercapt–thanol, 2 mL chloroform, make up to 20 mL with Z-buffer. Vortex for 1 min, centrifuge for 1 min at 800 rpm. Make fresh for each plate. | ||
| Z-buffer/SDS | 160 mg SDS dissolved in 10 mL Z-buffer | ||
| Z-buffer/ONPG | 40 mg ONPG in 10 mL Z-buffer. Make fresh for each plate | ||
| β-mercapt–thanol | Calbiochem | 444203 | |
| Anti-MBP monoclonal antibody (HRP conjugated) | New England Biolabs | E8038S | |
| Minimal media with maltose | 1 x M9 salts, 0.4% maltose, 1 mg/ mL thiamin, 2 mM MgSO4 | ||
| 96-well flat bottom plate | Sarstedt Ltd | 83.1835.300 | |
| Plate-reader | Beckman Coulter Inc. | DTX880 Multimode Detector | |
| Water bath | VWR international | 89032-204 | |
| Shaking incubator | Forma Scientific |
References
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