Summary
הליך יעיל להעריך את הנטייה oligomerization יחיד לעבור תחומים הטרנסממברני (TMDS) מתואר. חלבונים כימרי המורכב TMD התמזגו ToxR באים לידי ביטוי למתח כתב החיידק. TMD-Induced oligomerization גורם dimerization של ToxR, הפעלת שעתוק וייצור חלבונים הכתב,-galactosidase.
Abstract
התצוגה פשטני של תחומים הטרנסממברני חלבון רק עוגנים bilayers פוספוליפידים מכבר מופרכת. במקרים רבים קרום פורש חלבונים התפתחו מנגנונים מתוחכמים ביותר של פעולה. 1-3 דרך אחת שבה חלבונים בממברנה יכולים לווסת את המבנים שלהם פונקציות היא על ידי מגע ישיר וספציפי של סלילים הידרופובי, להרכיב oligomers הטרנסממברני מובנים. 4,5 האחרונות הרבה העבודה התמקדה הפצה של חומצות אמינו נמצאו מועדף בהשוואה בתמיסה מימית לבין כוחות מולקולאריים שונים חלבון כונן העמותה. 6,7 עם זאת, מחקרים של הכרה מולקולרית בבית תחום הטרנסממברני של חלבונים עדיין מפגרת אלה בסביבת קרום מסיס במים אזורים. המכשול העיקרי שנותר: למרות הספציפיות מדהים זיקה כי oligomerization הטרנסממברני יכולים להשיג, 8 מדידה ישירה של הקשר שלהם הוא מאתגר. מתודולוגיות מסורתית להחיל ללמוד את תפקוד הממברנה נפרד חלבון יכול להיות הקשו על ידי שבחוסר הטבועה של רצפים תחת בחינה. תובנות Biophysical זכה ללמוד פפטידים סינתטיים המייצגים תחומים הטרנסממברני יכול לספק תובנה מבניים שימושי. עם זאת, הרלוונטיות הביולוגית של micellar את חומר הניקוי או מערכות liposome שימוש במחקרים אלה לחקות ממברנות הסלולר מוטלת בספק לעתים קרובות, לעשות פפטידים לאמץ מבנה יליד דמוי בתנאים אלה ועושה התנהגות פונקציונלי שלהם באמת משקפים את מצב הפעולה בתוך קרום יליד ? כדי ללמוד את יחסי הגומלין של רצפי הטרנסממברני ב bilayers פוספוליפידים טבעיים, פיתחה את מבחני המעבדה Langosch ToxR כתב תעתיק. 9 תחום הטרנסממברני עניין מבוטא חלבון כימרי עם חלבון מחייב מלטוז עבור מיקום periplasm ו ToxR לספק דו"ח רמת oligomerization (איור 1).
בעשור האחרון, קבוצות אחרות (למשל אנגלמן, דגראדו, שי) אופטימיזציה נוספת ויישומי assay זה כתב ToxR. 10-13 מבחני ToxR שונים הפכו להיות תקן הזהב לבחון חלבונים אינטראקציות קרום התא. אנחנו כאן להדגים פעולה ניסיוני טיפוסי שנערך במעבדה שלנו בעיקר כדלקמן פרוטוקולים שפותחו על ידי Langosch. שיטה זו החלה בדרך כלל שימושי ניתוח של תחום העמותה עצמית הטרנסממברני ב E. coli, שבו β-galactosidase ייצור משמש כדי להעריך את הנטייה oligomerization TMD. עם dimerization TMD-Induced, ToxR נקשר האמרגן ctx גרימת עד ויסות של הגן LacZ עבור galactosidase-β. Readout colorimetric מתקבל על ידי תוספת של ONPG לתאי lyzed. מחשוף hydrolytic של ONPG ידי β-galactosidase תוצאות בייצור של המינים קליטת אור O-nitrophenolate (ONP) (איור 2).
Protocol
1. שיבוט שיקולים
- Oligonucleotides מוכן מסחרית המייצגת את TMD עניין מוקף NheI ואתרי BamHI הגבלה 5'-פוספורילציה ניתן ligated לתוך pTox7 (שונה במעבדה שלנו על ידי החדרה של זוג אחד בבסיס ישירות אחרי האתר מגבלה BamHI 14) (איור 3) מתעכל ברצף עם BamHI ו NheI. Oligonucleotide דוגמה מוצג להלן:
5'ctagcTMDSEQUENCEg3 "
3 "gTMDSEQUENCEcctag5"
רצף TMD צריך להיות 12-24 שאריות (רצפים קצרים יותר יהיה כנראה להיות מוארך על ידי וקטור שאריות מקודדים הידרופובי). על מנת לחקור את הממשק, ארבע גרסאות של עיצוב TMD יש ליצור שם הוספות שאריות רציפים שאריות מחיקות במקביל לגרום סיבוב של קרוב ל TMD ToxR. 15,16 לבסוף, ריכוז arabinose צריך להיות נע בין 0.001 ו - 0.01% (w / v) כדי לזהות את הריכוז המרבי שבו ההבדלים β-galactosidase אותות בין רצפים שונים TMD הם נצפו; בדיקת רמות ביטוי שונות מומלץ לזהות את התנאים בהם זיקות שונות ניתן להבחין בין הטוב ביותר. בנוסף arabinose ואנטיביוטיקה, 0.4 mM IPTG יכול לשמש כדי לשפר את ההבדלים של זיקות בין TMDS שונים. המדידה ToxR יש לבצע לפחות ארבע פעמים. ההליך כולו יש לחזור לפחות שלוש פעמים עם הפלסמיד טרנספורמציות שונות.
2. צמיחה של תרבויות חיידקית
- בעדינות להפשיר FHK12 תאים המוסמכת (200 μl) על הקרח ולהעביר לתוך צינור תרבות 15 מ"ל. הוסף ה-DNA פלסמיד (200 ng) ו דגירה התאים על קרח למשך 30 דקות.
- חום הלם תאים על ידי הדגירה של 90 על 42 מעלות צלזיוס, ואחריו הדגירה על קרח דק '2.
- הוסף SOC התקשורת (800 μl) ו דגירה דגימות ב 37 ° C עם רועד (300 סל"ד) אחד ח
- לחסן 5 LB התקשורת מ"ל עם chloramphenicol (30 מיקרוגרם / מ"ל) ו arabinose (0.0025% w / v) עם 50 μl של התערובת שינוי ב 15 תרבות צינורות מ"ל בשלושה עותקים. דגירה דגימות ב 37 ° C עם רועד (300 סל"ד) למשך 20 ח (לחלופין 5 μl של התרבות ניתן לחסן 100 μl של המדיום בצלחת 96-היטב. שיטה זו יעילה כאשר מדובר במספרים גדולים של דגימות, למרות שגיאות יהיה מעט גבוה יותר. על מנת למנוע אידוי, אשר יוביל טעות, למלא את בארות החיצונית עם התקשורת, אבל לא להשתמש בהם דגימות. לבסוף, פעמיים לעטוף את משותף בין המכסה את הצלחת עם parafilm).
3. מדידה של פעילות β-galactosidase
- מחממים את צלחת הקורא 28 ° C.
- העברת ה-Z כליקול לתוך מאגר עם טיפ גדול פיפטה, מקפיד לקחת רק את השכבה העליונה (מימית). העברת 100 μl של Z-buffer/chloroform מוכן טרי על בארות צלחת 96-היטב. העברת 5 μl של כל תרבות לתוך בארות הצלחת ארבע פעמים. השמט את התרבות מארבע הבארות אשר תשמש את החסר.
- מדוד את OD 595 הצלחת לקבוע צפיפות התאים.
- הוסף 50 μl של Z-buffer/SDS לכל הבארות של הצלחת. לנער את הצלחת לקורא הצלחת עבור 10 דקות עד lyze התאים. ודא השעיות תא ברורים לאחר תמוגה וחזור על צעד רועד אם נדרש. תמוגה הושלמה מציע את Z-buffer/chloroform לא היה מוכן טרי.
- הוסף 50 μl מוכן טרי Z-buffer/ONPG לכל הבארות ולהחזיר את צלחת לקורא את הצלחת למדוד OD של 405 כל 30 דקות 20.
- חישוב β-galactosidase הפעילות באמצעות המשוואה הבאה (לזכור להפחית את ריק). יחס של 405 OD / min צריך להיות מחושב באמצעות כל נקודות הנתונים בטווח OD 405 0.0-1.0 באמצעות מודל ליניארי מתאים.
יחידות מילר שונים לפעמים כאשר רשמה בימים שונים. לכן, לבנות התייחסות כמו GPA צריך להימדד כל בדיקה. הערכים שלו יכול לשמש לנורמליזציה של ערכי ToxR.
4. הבקרה של ביטוי חלבון
- בצע המערבי סופג כדי לוודא אפילו ביטוי חלבון בין המבנים. שלב 50 μl של התרבויות בשלושה עותקים ו צנטריפוגה (2000 סל"ד, 4 דקות) ב microcentrifuge. הסר את supernatant ידי pipetting ו resuspend גלולה שיורית 2 חיץ טעינת x המדגם.
- טען 7.5 μl על ג'ל 8% סטנדרטי ולבצע electrophoreses ב V 125 דקות, 1 שעה 5. לאחר ההעברה, דגירה עם נוגדן HRP-מצומדות אנטי MBP ולדמיין; חלבון כימרי הוא ציין בכ 70 kDa עם כמה מוצרים השפלה לראות לפעמים סביב 48 kDa. MBP אנדוגני הוא ציין גם 45 kDa (ראה איור 5).
5. הבקרה של הכנסת ממברנה פרופר
קו תא חסר חלבון מחייב מלטוז משמש כדי להעריך את ההכנסה קרום תקין של לבנות את TMD chimeric. כאשר גדל על התקשורת מינימלי עם מלטוז כמקור פחמן יחיד, רק תאים להביע קרום בלתי נפרד מוצר ביטוי עם חלבון מלטוז מחייב ממוקם כראוי periplasm מסוגלים לגדול.
- המרה PD28 תאים (כפי שתואר עבור FHK12 תאים) ו לחסן 2 מ"ל של מדיום LB. לגדל את התאים ב 37 ° C עם רועד (300 סל"ד) למשך הלילה.
- גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב 3500 סל"ד, 10 דק ', 4 ° C ולשטוף ידי resuspension ב PBS (2 מ"ל) על ידי pipetting עדין עם טיפ גדול או vortexing עדין. גלולה התאים (לעיל), לשטוף עם PBS בפעם השנייה, גלולה ו resuspend לבסוף PBS (1 מ"ל).
- השתמש 25 μl של תאים resuspended לחסן 5 התקשורת מינימלי מ"ל בשלושה עותקים לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רועד (300 סל"ד). קח OD 595 קריאות בין 15-25 שעות, בערך כל 2 שעות על ידי העברת 200 μl של כל דגימה לתוך צלחת 96-היטב וקריאה באמצעות צלחת הקורא.
6. נציג תוצאות:
דוגמה לשימוש assay כתב ToxR תעתיק לנתח את הנטייה oligomerization של תחומים הטרנסממברני ב שמוצג באיור 4. בעבר אנחנו בחנו את oligomerization של תחומים הטרנסממברני מן multispanning קרום בלתי נפרד סמויה קרום חלבון חלבון-1 (LMP-1) על ידי טכניקות שונות, לרבות ToxR 14 תחום הטרנסממברני חמישה (TM5) הוצגה התערוכה נטייה חזקה oligomerize. זו באה לידי ביטוי גבוהה יחידות מילר, להשוות שליטה חיובית, GPA, רצף ומבוססת dimerizing. מוטציה מזיקה ב TM5, D150A, מפחית את היכולת של הרצף כדי oligomerize. LMP-1 TM1 לא oligomerize משמעותית ותערוכות אות נמוך מאוד מילר היחידה, בדיוק מעל האות עבור ריק, לא שינו FHK12 תאים.
קריקטורה איור 1. המתארת את assay כתב ToxR. תחום הטרנסממברני (TMD) מונע תוצאות oligomerization ב dimerization של ToxR והפעלה של שעתוק LacZ. מוצר הגן של LacZ, β-galactosidase ניתן לכמת כמדד הנטייה של TMD כדי oligomerize.
איור 2. מחשוף hydrolytic של ONPG ידי β-galactosidase תוצאות בייצור של המינים קליטת אור O-nitrophenolate (ONP).
איור 3. המפה פלסמיד של pToxR7.
איור 4. Assay נציג ToxR כתב תעתיק ניתוח הנטייה oligomerization של קרום סמוי חלבון-1 תחומים הטרנסממברני. תחום הטרנסממברני 5 (TM5) oligomerizes בתוקף, בעוד תחום הטרנסממברני 1 (TM1) מוצגים רק האינטראקציה החלשה. D150A מוטציה TM5 מפחית באופן משמעותי את יכולתה oligomerize. GPA נכלל כרצף בקרה חיובית dimerization חזק. ריק מייצג untransformed FHK12 תאים.
איור 5. כתם המערבי לביטוי חלבונים.
איור 6. PD28 assay השלמה לשלוט על הכניסה קרום הנכונה periplasm. בקרה שלילית מייצגת לבנות חסר חלבון מחייב מלטוז.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Assay כתב תעתיק ToxR היא דרך קליל לזהות רצפי הטרנסממברני עם פוטנציאל oligomerize. מאז האינטראקציות מתרחשות בתוך הקרום הפנימי חיידקי, assay זה עוקף את הנושאים הקשורים תוקפו של מערכות הלומדים קרום כוזב סביבות. בהתחשב בכך שיבוט של TMDS מרובים לתוך פלסמיד אחד יכול בקלות להתבצע במקביל assay כולו יכול להתבצע במתכונת-96 גם צלחת, assay זה יכול לשמש עבור ניתוח תפוקה גבוהה של מספר גדול של רצפי חלבונים. 17 לאחר האינטראקציה זוהה, שאריות התפקודית מפתח יכול להיות נחקר על ידי ניתוח מוטציוני, המאפשר מיפוי של תכונות מבניות מעורב. במקרים רבים, ניתוח קריסטלוגרפיים של חלבונים הטרנסממברני הוא בעייתי, הדורש כלים חלופיים כגון assay ToxR להקים את הבסיס המולקולרי של פונקציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מודים המכונים הלאומיים לבריאות (1R21CA138373 ואת לעמוד סרטן (SU2C) עבור תומך הכספיים של עבודה זו. ח.י. היא אסירת תודה על פרס 2009 עליון מן האגודה האמריקאית לחקר הסרטן, פרס המלומד קימל מן סידני קימל קרן לחקר הסרטן (SKF-08-101), ואת הקרן הלאומית למדע הקריירה המוקדמת הפקולטה פרס (NSF0954819).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI restriction enzyme | Invitrogen | 15201023 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| NheI restriction enzyme | Invitrogen | 15444011 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| 15 mL culture tubes | Fisher Scientific | 14-956-1J | |
| SOC media | TEKnova, Inc. | S0225 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| LB media | Sigma-Aldrich | L7275 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | CO378 | Stock solution of 30 mg/ mL in ethanol stored in freezer |
| Arabinose | Fluka | 10839 | Stock solution of 2.5% (w/v) in water stored in freezer |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6858-06 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Sodium dodecylsulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| 2-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside (ONPG) | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Z-buffer | 16.1 g Na2HPO4 5.5g NaH2PO4 0.75g KCl 0.246g MgSO4 Make up to 1 l, pH 7.0 |
||
| Z-buffer/chloroform | 200 mL β-mercapt–thanol, 2 mL chloroform, make up to 20 mL with Z-buffer. Vortex for 1 min, centrifuge for 1 min at 800 rpm. Make fresh for each plate. | ||
| Z-buffer/SDS | 160 mg SDS dissolved in 10 mL Z-buffer | ||
| Z-buffer/ONPG | 40 mg ONPG in 10 mL Z-buffer. Make fresh for each plate | ||
| β-mercapt–thanol | Calbiochem | 444203 | |
| Anti-MBP monoclonal antibody (HRP conjugated) | New England Biolabs | E8038S | |
| Minimal media with maltose | 1 x M9 salts, 0.4% maltose, 1 mg/ mL thiamin, 2 mM MgSO4 | ||
| 96-well flat bottom plate | Sarstedt Ltd | 83.1835.300 | |
| Plate-reader | Beckman Coulter Inc. | DTX880 Multimode Detector | |
| Water bath | VWR international | 89032-204 | |
| Shaking incubator | Forma Scientific |
References
- Parker, M. S. Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices. Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).
- Mo, W., Zhang, J. T. Oligomerization of human ATP-binding cassette transporters and its potential significance in human disease. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 1049-1063 (2009).
- von Heijne, G.
- Van Horn, W. D. Solution nuclear magnetic resonance structure of membrane-integral diacylglycerol kinase. Science. 324, 1726-1729 (2009).
- Hattori, M. Mg(2+)-dependent gating of bacterial MgtE channel underlies Mg(2+) homeostasis. Embo J. 28, 3602-3612 (2009).
- Ulmschneider, M. B., Sansom, M. S. Amino acid distributions in integral membrane protein structures. Biochim Biophys Acta. 1512, 1-14 (2001).
- Deber, C. M., Goto, N. K.
- Gerber, D., Shai, Y. In vivo detection of hetero-association of glycophorin-A and its mutants within the membrane. J Biol Chem. 276, 31229-31232 (2001).
- Langosch, D., Brosig, B., Kolmar, H. p, Fritz, H. J. Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator. J Mol Biol. 263, 525-530 (1996).
- Russ, W. P., Engelman, D. M. TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 863-868 (1999).
- Berger, B. W. Consensus motif for integrin transmembrane helix association. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 703-708 (2010).
- Oates, J., King, G., Dixon, A. M. Strong oligomerization behavior of PDGFbeta receptor transmembrane domain and its regulation by the juxtamembrane regions. Biochim Biophys Acta. 1798, 605-615 (2010).
- Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins. J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).
- Sammond, D. W. Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1. , Forthcoming (2010).
- Li, R. Dimerization of the transmembrane domain of Integrin alphaIIb subunit in cell membranes. J Biol Chem. 279, 26666-26673 (2004).
- Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper. J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).
- Finger, C., Escher, C., Schneider, D. The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions. Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).
