Summary
단일 패스 transmembrane 도메인의 oligomerization의 성향 (TMDS)을 평가하는 효율적인 절차를 설명합니다. ToxR에 융합 TMD 구성된 키메라 단백질은 E. 대장균 기자 스트레인에 표현됩니다. TMD 유도 oligomerization는 ToxR, 해독 및 기자 단백질의 생산, - galactosidase의 활성의 dimerization이 발생합니다.
Abstract
disproven되어 이후 단백질 transmembrane 도메인의 oversimplified 전망은 단순히 인지질의 bilayers의 앵커 오래되었습니다. 많은 경우에 막 - 스패닝 단백질 행동의 고도로 복잡한 메커니즘을 발전시켜 왔습니다. 막 단백질들의 구조와 기능을 조절 할 수있는 1-3 편도는 구조 transmembrane의 oligomers를 형성, 소수성의 나선의 직접적이고 구체적인 접촉하는 것입니다. 4,5 대부분 최근이 작업은 우선적으로 수용액 및 드라이브 단백질 협회. 6,7는 그럼에도 불구하고, 단백질의 transmembrane 도메인에서 분자 인식 연구가 계속 중 그 뒤에 lags하는 다른 분자간 부대 비교 멤브레인 환경에서 발견된 아미노산의 분포에 초점을했습니다 수용성 지역. 주요 장애물은 남아있다 : 놀라운 특이성과 transmembrane의 oligomerization 얻을 수있는 친화력에도 불구하고, 그들의 협회 8 직접 측정은 도전입니다. 통합 멤브레인 단백질 기능 연구에 적용된 전통 방법론은 시험에서 시퀀스의 고유 불용성에 의해 방해하실 수 있습니다. transmembrane 도메인을 나타내는 합성 펩티드를 공부에서 얻은 통찰력 Biophysical 유용한 구조적 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그러나 세제 micellar이나 세포 세포막을 모방하는 이러한 연구에 사용되는 리포좀 시스템의 생물 학적 관련은 종종 의문이며 펩티드는 이러한 조건 하에서 원시와 같은 구조를 채택하고 그들의 기능 동작은 진정한 네이티브 막 내에서 동작의 모드를 반영하지 ? 천연 인지질의 bilayers의 transmembrane 시퀀스의 상호 작용을 연구하기 위해 Langosch 실험실 ToxR transcriptional 기자 assays을 개발했습니다. 관심사 9 transmembrane 도메인이 periplasm 및 ToxR에 위치 말토오스 결합 단백질과 키메라 단백질로 표현되는 보고서를 제공하는 oligomerization의 수준 (그림 1).
지난 10 년, 여러 다른 그룹 (예 : Engelman, DeGrado, 샤이)는 더욱 최적화하고 ToxR 기자 분석을 적용. 10-13 다양한 ToxR의 assays는 세포 점막에 단백질 단백질 상호 작용을 테스트하는 황금 표준이되었습니다. 우리는 여기에 주로 Langosch에 의해 개발된 프로토콜을 따르는 우리 연구실에서 수행 전형적인 실험 작업을 보여줍니다. 이것은 일반적으로 적용되는 방법은 E.에 transmembrane 도메인 자체 협회의 분석에 유용합니다 β - galactosidase 생산이 TMD oligomerization의 성향을 평가하는 데 사용됩니다 대장균. TMD 유도 dimerization시, ToxR은 β - galactosidase에 대한 LacZ 유전자의 최대 규제를 일으키는 CTX업자에 바인딩합니다. colorimetric 판독이 lyzed 세포 ONPG를 추가하여 얻을 수 있습니다. 빛을 흡수 종 O - nitrophenolate (ONP) (그림 2)의 생산에 β - galactosidase 결과에 의해 ONPG의 가수 분해 절단.
Protocol
1. 복제 고려 사항
- NheI과 BamHI 제한 사이트와 5' - phosphorylated 둘러싸인 관심 TMD를 대표하는 상업 준비 oligonucleotides는 pTox7 (직접 BamHI 제한 사이트 14 차례의 기본 쌍 삽입하여 연구실에서 수정) (그림 3) 순차적으로 소화에 출혈도 잡았 수 있습니다 BamHI과 NheI와 함께. 예제 oligonucleotide는 다음과 같습니다 :
5'ctagcTMDSEQUENCEg3 '
3 'gTMDSEQUENCEcctag5'
TMD 순서는 12-24 잔류물 (짧은 시퀀스는 아마도 벡터 인코딩 소수성의 잔류물로 길쭉한합니다)해야합니다. 순차 잔여 삽입 및 ToxR에 TMD 상대의 회전에 수반하는 잔류 삭제 결과가. 15,16가 마지막으로 arabinose 농도가 0.001와 0.01 % 사이에서 다양 있어야 할 곳에 인터페이스를 조사하기 위해, TMD 디자인 네 가지 변종이 만들어되어야합니다 (W / V) 다른 TMD 시퀀스 사이의 β - galactosidase 신호의 최대 차이가 관찰되는 농도를 확인하기 위해, 다양한 표현 수준을 테스트하는 것은 다른 동질성이 가장 구분할 수있는 아래의 조건을 확인하는 것이 좋습니다. arabinose와 항생제 이외에도, 0.4 MM의 IPTG는 여러 TMDS 간의 동질성의 차이를 개선하는 데 사용할 수 있습니다. ToxR 측정은 최소한 사통으로 작성된 수행해야합니다. 전체 절차는 서로 다른 플라스미드 변환 최소한 세 번 반복해야합니다.
2. 세균성 문화의 성장
- 부드럽게 15 ML 문화 튜브에 얼음과 송금에 FHK12 유능한 세포를 (200 μl) 해동. 플라스미드 DNA (200 NG)를 추가하고 30 분 얼음에 세포를 품어.
- 42 90 s에 대한 부화하여 열 충격 세포 ° 2 분 얼음 부화 다음 C.
- SOC 미디어 (800 μl) 추가하고 37 샘플을 품어 ° C 하나 H.위한 (300 RPM) 잡고
- 세중의 15 ML 문화 튜브의 변형 혼합물 50 μl와 chloramphenicol (30 μg / ML)와 arabinose (0.0025 % W / V) 5 ML의 LB 미디어의 예방. 37 샘플을 품어 ° C를 20 H.위한 (300 RPM) 잡고 (또는 문화의 5 μl은 96 - 웰 플레이트에 중간 100 μl를 예방하는 데 사용할 수 있습니다. 샘플의 큰 숫자를 처리 할 때이 방법은 유용합니다, 오류가 약간 높을 수 있지만. 이어질 것이 증발을 방지하기 위해 오류 매체와 가장 바깥쪽 우물을 채우기지만, 샘플을 사용하지 않는합니다. 마지막) 뚜껑과 parafilm와 접시 사이에 공동을 두 번 포장.
3. β - galactosidase 활동의 측정
- 앞서 열을 가하다 판 - 리더 28 ° C.
- 상단 (수성) 계층만을 차지해야하고, 대형 피펫 팁있는 저수지로 Z - 버퍼를 전송합니다. 96 - 웰 플레이트의 우물에 신선한 Z-buffer/chloroform 100 μl을 전송합니다. 사통으로 작성된 접시의 우물에 각 문화의 5 μl을 전송합니다. 빈 될 것입니다 푸르 웰스의 문화를 생략하십시오.
- 세포 밀도를 결정하기 위해 접시의 OD를 측정 595.
- 접시의 모든 우물을 Z-buffer/SDS 50 μl를 추가합니다. 세포를 lyze 10 분 접시 - Reader에서 접시를 흔들어. 셀 suspensions이 용해 후 명확한지, 그리고 필요한 경우 흔들림이 단계를 반복 있는지 확인하십시오. 불완전 용해는 Z-buffer/chloroform가 신선한 아니었 제안합니다.
- 갓 모든 우물을 Z-buffer/ONPG 준비 50 μl를 추가, 20 분 매 30의 플레이트 리더와 측정 OD 405에 접시를 반환합니다.
- 다음 방정식을 (를 비워 뺄 기억)를 사용하여 β - galactosidase 활동을 계산합니다. OD 405 / 분의 비율은 선형 모델 적합을 사용하여 1.0 OD 405 범위 0.0의 모든 데이터 요소를 사용하여 계산해야합니다.
다른 일에 기록된 때 밀러 단위 때로는 다릅니다. 그러므로, GPA와 같은 참조 구조는 각 시험에서 측정해야합니다. 그 값은 ToxR 값의 정상화를 위해 사용할 수 있습니다.
4. 단백질 표현을위한 컨트롤
- 서양은 구조 사이에도 단백질 발현을 확인하기 위해 모래 바닥 수행합니다. microcentrifuge에 세중의 문화와 원심 분리기 50 μl (2000 RPM, 4 분)을 결합합니다. pipetting하여 표면에 뜨는를 제거하고 2 X 샘플 로딩 버퍼에 잔류 펠렛을 resuspend.
- 표준 8 % 겔에서 7.5 μl를로드 1 시간당 5 분 125 V에서 electrophoreses를 수행합니다. 전송 후, 안티 MBP HRP - 복합 항체와 부화 및 시각화, 키메라 단백질은 때로는 48 KDA 주위에 본 몇 가지 열화 제품과 약 70 KDA에서 관찰됩니다. 내생 MBP도 (그림 5 참조) 45 KDA에서 관찰됩니다.
5. 적절한 막 삽입에 대한 제어
말토오스 결합 단백질에 부족한 세포 라인은 키메라 TMD 구조의 적절한 막 삽입을 평가하는 데 사용됩니다. 유일한 탄소 소스로 말토오스 최소한의 미디어에 성장하는 경우에만 세포가 제대로 periplasm에있는 말토오스 결합 단백질과 막 - 필수 표현 제품을 표현이 성장 할 수 있습니다.
- PD28 세포를합니다 (FHK12 세포에 대한 설명) 변환 및 LB 매체 2 ML의 예방. 37 세포를 성장 ° C를 하루 (300 RPM) 잡고.
- 펠렛은 3,500 rpm으로 원심 분리하여 세포를, 10 분, 4 ° C와 큰 팁 또는 부드러운 vortexing와 부드러운 pipetting하여 PBS (2 ML)에 resuspension로 씻으십시오. 펠렛 전지 (위)를, 두 번째 시간을 PBS로 세척 펠릿 그리고 마지막으로 PBS (1 ML)에 resuspend.
- 37 세중의와 부화 5 ML 최소한의 미디어를 예방 resuspended 세포의 25 μl를 사용 ° C를 (300 RPM) 잡고. 15-25 H, 접시 - 판독기를 사용하여 96 - 웰 플레이트와 읽기에 각 시료 200 μl를 전송로 약 2 시간마다 사이 OD 595 수치를 가져가라.
6. 대표 결과 :
그림 4에 transmembrane 도메인의 oligomerization의 성향을 분석 ToxR transcriptional 기자 분석의 사용 예. 이전부터 우리가 transmembrane 도메인의 oligomerization를 조사 multispanning 멤브레인 - 필수 단백질 잠재 막 단백질 - 1 ToxR 등 다양한 기술에 의해 (LMP - 1) 14 Transmembrane 도메인 오 (TM5)가 oligomerize에 강한 성향을 전시 표시되었다.; 이것은 긍정적인 제어 비교 높은 밀러 유닛, GPA, 잘 설립 dimerizing 순서에 의해 입증됩니다. TM5, D150A에 해로운 돌연변이 oligomerize에 순서의 능력을 감소시킵니다. LMP - 1 TM1 크게 oligomerize하지 않으며 단지 빈 아닌 변화 FHK12 세포의 신호 위에 매우 낮은 밀러 단위 신호를 전시하고 있습니다.
그림 1. 카툰은 ToxR 기자 분석을 묘사한. Transmembrane 도메인 (TMD)는 ToxR와 LacZ의 전사 활성화의 dimerization에 oligomerization 결과를 구동. LacZ 유전자의 제품은, β - galactosidase는 oligomerize에 대한 TMD의 성향의 측정으로 계량하실 수 있습니다.
그림 2. 빛을 흡수 종 O - nitrophenolate (ONP)의 생산에 β - galactosidase 결과에 의해 ONPG의 가수 분해 절단.
그림 3. pToxR7의 플라스미드지도.
그림 4. 대표 ToxR transcriptional 기자 분석은 잠재된 막 단백질 - 1 transmembrane 도메인의 oligomerization의 성향을 분석. transmembrane 도메인 1 (TM1)는 단지 약한 상호 작용을 전시 반면 Transmembrane 도메인 5 (TM5)은 강하게 oligomerizes. TM5에서 돌연변이의 D150A 상당히 oligomerize하기 위해 능력을 감소시킵니다. GPA는 강한 dimerization에 대한 긍정적인 제어 순서로 포함되어 있습니다. 빈은 untransformed FHK12 세포를 나타냅니다.
그림 5. 단백질 발현을위한 서양 얼룩.
그림 6. periplasm에 올바른 막 삽입에 대한 제어 PD28 complementation 분석. 대조군은 말토오스 결합 단백질에 결함 구조를 나타냅니다.
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Discussion
ToxR transcriptional 기자 분석은 oligomerize 수있는 잠재력을 지닌 transmembrane 시퀀스를 식별하는 손쉬운 방법입니다. 상호 작용은 세균 내부 멤브레인 내에서 발생하기 때문에,이 분석은 멤브레인 - 모방 환경에서 공부하는 시스템의 유효성과 관련된 문제를 circumvents. 하나의 플라스미드에 여러 개의 TMDS의 복제가 쉽게 병렬로 할 수 있으며, 전체 분석이 96 - 웰 플레이트 형식으로 진행 될 수 감안할 때,이 분석은 단백질 시퀀스 다수의 높은 처리량 분석에 사용할 수 있습니다. 17 번 상호 작용이 발견되었습니다, 주요 기능 잔류물은 관련된 구조적 기능의 매핑을 허용, mutational 분석에 의해 심문 수 있습니다. 대부분의 경우, transmembrane 단백질의 crystallographic 분석 함수의 분자 기초를 확립하기 위해 ToxR 분석과 같은 다른 도구를 필요로하는, 문제가있다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 국립 보건원을 (1R21CA138373 감사하고이 작품의 재정 지원을위한 암 (SU2C)에 일어나. HY은을 위해 시드니 킴멀 재단에서 암 연구, 킴멀 학술 상을 미국의 협회에서 2009 Elion 수상에 감사합니다 암 연구 (SKF - 08-101) 및 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 학부 조기 채용 수상 (NSF0954819).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI restriction enzyme | Invitrogen | 15201023 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| NheI restriction enzyme | Invitrogen | 15444011 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| 15 mL culture tubes | Fisher Scientific | 14-956-1J | |
| SOC media | TEKnova, Inc. | S0225 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| LB media | Sigma-Aldrich | L7275 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | CO378 | Stock solution of 30 mg/ mL in ethanol stored in freezer |
| Arabinose | Fluka | 10839 | Stock solution of 2.5% (w/v) in water stored in freezer |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6858-06 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Sodium dodecylsulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| 2-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside (ONPG) | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Z-buffer | 16.1 g Na2HPO4 5.5g NaH2PO4 0.75g KCl 0.246g MgSO4 Make up to 1 l, pH 7.0 |
||
| Z-buffer/chloroform | 200 mL β-mercapt–thanol, 2 mL chloroform, make up to 20 mL with Z-buffer. Vortex for 1 min, centrifuge for 1 min at 800 rpm. Make fresh for each plate. | ||
| Z-buffer/SDS | 160 mg SDS dissolved in 10 mL Z-buffer | ||
| Z-buffer/ONPG | 40 mg ONPG in 10 mL Z-buffer. Make fresh for each plate | ||
| β-mercapt–thanol | Calbiochem | 444203 | |
| Anti-MBP monoclonal antibody (HRP conjugated) | New England Biolabs | E8038S | |
| Minimal media with maltose | 1 x M9 salts, 0.4% maltose, 1 mg/ mL thiamin, 2 mM MgSO4 | ||
| 96-well flat bottom plate | Sarstedt Ltd | 83.1835.300 | |
| Plate-reader | Beckman Coulter Inc. | DTX880 Multimode Detector | |
| Water bath | VWR international | 89032-204 | |
| Shaking incubator | Forma Scientific |
References
- Parker, M. S. Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices. Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).
- Mo, W., Zhang, J. T. Oligomerization of human ATP-binding cassette transporters and its potential significance in human disease. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 1049-1063 (2009).
- von Heijne, G. Membrane-protein topology. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 909-918 (2006).
- Van Horn, W. D. Solution nuclear magnetic resonance structure of membrane-integral diacylglycerol kinase. Science. 324, 1726-1729 (2009).
- Hattori, M. Mg(2+)-dependent gating of bacterial MgtE channel underlies Mg(2+) homeostasis. Embo J. 28, 3602-3612 (2009).
- Ulmschneider, M. B., Sansom, M. S. Amino acid distributions in integral membrane protein structures. Biochim Biophys Acta. 1512, 1-14 (2001).
- Deber, C. M., Goto, N. K. Folding proteins into membranes. Nat Struct Biol. 3, 815-818 (1996).
- Gerber, D., Shai, Y. In vivo detection of hetero-association of glycophorin-A and its mutants within the membrane. J Biol Chem. 276, 31229-31232 (2001).
- Langosch, D., Brosig, B., Kolmar, H. p, Fritz, H. J. Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator. J Mol Biol. 263, 525-530 (1996).
- Russ, W. P., Engelman, D. M. TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 863-868 (1999).
- Berger, B. W. Consensus motif for integrin transmembrane helix association. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 703-708 (2010).
- Oates, J., King, G., Dixon, A. M. Strong oligomerization behavior of PDGFbeta receptor transmembrane domain and its regulation by the juxtamembrane regions. Biochim Biophys Acta. 1798, 605-615 (2010).
- Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins. J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).
- Sammond, D. W. Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1. , Forthcoming (2010).
- Li, R. Dimerization of the transmembrane domain of Integrin alphaIIb subunit in cell membranes. J Biol Chem. 279, 26666-26673 (2004).
- Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper. J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).
- Finger, C., Escher, C., Schneider, D. The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions. Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).
