直接アダルトゼブラフィッシュの腎臓への細胞の移植

Summary

細胞移植は、組織の再生を研究するための、病気の細胞ベースの治療法を開発するために必要不可欠な技術です。ここでは、成人のゼブラフィッシュの魚の腎臓に直接遺伝的に標識された細胞の移植を可能に顕微鏡下手術を示しています。

Abstract

損傷した組織に幹細胞または前駆細胞の移植に基づいて、再生医療は、慢性疾患¹の広い範囲を治療する可能性があります。しかし、ほとんどの臓器は、これらの構造にアクセスするために外科的方法を開発する必要性を必要と、簡単にアクセスできません。このビデオの記事では、我々が直接成体ゼブラフィッシュ、再生および疾患^2を研究する人気モデルの腎臓に細胞を移植する方法を説明します。受信者の魚が注入された細胞³の免疫拒絶反応を抑制するために照射によって事前に条件付けされています。私たちは、頭の腎臓が直接臓器への細胞の注入に続いて魚の脇腹の横切開により露出することができる方法を示しています。任意のセルベースの​​再生治療のゴールドスタンダードを - 腎と造血前駆細胞の混合集団を含む蛍光標識全体の腎臓の骨髄細胞を用いて、我々は、ネフロンの前駆細胞が生着し、新たな腎組織に分化できることを示している。この手法は腎臓だけでなく、他の臓器に幹細胞または前駆細胞および/または低分子化合物を精製し、さらに再生医療を研究するために汎用性の高いモデルとしてゼブラフィッシュを向上させる提供に適応させることができます。

Protocol

1。非トランスジェニックレシピエント魚のコンディショニング。

1. 移植のためのシステムの最大のオスの魚を選択してください。
2. 約3分間、またはそれは水泳が、それほど長い間心臓が鼓動を停止することを停止するまでの0.02パーセントTricaine液（pH7）で魚を置きます。
3. ベンチの上に湿らせたペーパータオルで麻酔した魚を置く。
4. 魚の腹腔内腔に水の20μlのでゲンタマイシンの40 UGを注入するインスリンの注射器の針を使用してください。腎再生研究のために、このステップでは、強化された移植のための好ましい環境を誘導するために重要である。
5. 回復のためにシステムの水に魚を戻す。
6. 魚はおとなしいし、振動などの外部刺激に対して非常に敏感かもしれない。回復の3時間後、ガンマ線照射の25グレイで魚を扱う。
7. 移植前の食品なしで3日間のシステムに魚を戻す。

2。遺伝的に蛍光マーカー（EGFPまたはmCherry）で標識前駆ドナー細胞の調製。

1. 直前に外科的処置に、移植されるドナー細胞を準備し、氷上で保管して下さい。
2. 腎および造血前駆細胞を含むトランスジェニックライン、：腎研究のために、我々は、Tg（EGFP cdh17）から全体腎臓の骨髄細胞を使用してください。これらの前駆細胞は、遺伝的に標識し、それらが生着し、腎上皮細胞に分化する場合のみ、EGFPを発現するであろう。血管芽細胞の前駆細胞移植のための：造血幹細胞またはTG（EGFP fli1a）のための：というラベルの前駆細胞の他のタイプはまた、TG（EGFP SCL）として、使用することができます。
3. 5分間で0.2％Tricaineにそれらを置くことによって3大人トランスジェニック魚を安楽死させる。
4. 腹側に沿って正中切開を作る頭と尾、そして解剖ハサミを削除するには、滅菌カミソリの刃を使用してください。
5. ステレオスコープの下に、ピンセットで浮き袋を含む体腔内の臓器のすべてを削除します。キャビティの背側壁に取り付けられたフラットや色素器官である腎臓を、削除しないように注意してください。
6. 次に、背側の壁から腎臓をばらばらにすると2％ウシ胎児血清（1X PBS / 2％FCS）を添加した冷リン酸緩衝生理食塩水の300 ULを含む1.5 mLの遠心管に入れてください。
7. それは、均質化になるまでせん断腎臓に乳棒を使用してください。
8. 50mlのファルコンチューブ内の40μMのセルストレーナーを配置し、バラセルはファルコンチューブに介してフィルタリングできるように、セルストレーナーの上に細胞溶液を移す。
9. 優しく汚れをさらにセルを分割するために、ストレーナーに残っている組織の大きな部分を乳棒を使用してください。
10. ファルコンチューブに細胞溶液のままにして、ストレーナーから残りの細胞を収集する1 × PBS / 2％FCS 1.2 mLでストレーナーを洗浄。
11. ° C 300 rcfで5分間4℃で新しい1.5 mlチューブと遠心分離機に細胞溶液を移す。
12. 1X PBS / 2％FCS、1.5 mLで細胞ペレットを洗浄すると粘着性細胞の塊を除外し、再び遠心分離する新しいストレーナを介して渡します。
13. の1X PBS / 2％FCS200μlの細胞ペレットを再懸濁し、PCRチューブに移す。
14. PCRチューブ（4 ° C、300 RCF、1分）遠心し、上清の大部分を取り除く。
15. 2月5日uLの最終容量を取得し、氷上で保存するために、残液中の細胞を再懸濁します。
16. 最終的な細胞の収率は腎臓あたり約200万セルにする必要があります。
17. 血球計数器で細胞数をカウントし、5 uLのあたり× 10 ⁵細胞の濃度を調整する。

3。ハミルトンシリンジにセルのソリューションを読み込みます。

1. 滅菌水で3回ハミルトンシリンジをリンス。
2. 3回、エタノール75％とシリンジをリンス。
3. 1X PBS / 2％FCSで3回、再びシリンジをリンス。
4. その後、細胞溶液の1μlのと注射器をロードするだけで注射前に約5 × 10 ^5個の細胞が含まれています。

4。直接腎臓に前駆細胞の移植。

1. 魚が移動を停止している約3分、またはまでではなく、あまりにも長い間、心臓が停止することを叩きのための0.02パーセントTricaineでエアコン受信者の魚を麻酔。
2. 実体顕微鏡下で、移植側を乾かすために、上、左、腹側に向かってヘッドと紙タオルで魚を置く。
3. その後、乾燥側を公開するために魚をロールオーバー。
4. 滅菌ピンセットを使用して、鰓のすぐ後方地域でのスケールを除去。
5. ピンセットで組織を安定化しながらメスで正中線にあるこのエリア1cmの横切開を加えます。
6. 深い十分な切開を行うために継続しながら、ピンセットを使用して、組織を公開頭の腎臓を公開する。
7. 腎臓の可視化を防ぐ出血の多くがある場合は、魚をeuthenizeと別の受信者の魚を使って最初から作業を開始。
8. 頭の腎臓を公開するオープンな組織を覗きながら、直接ヘッドの腎臓に細胞溶液1 ulを注入する。
9. その後、注射針が取り出されると同時に、組織が注入された細胞の漏出を防止するために元の場所に収まるようにピンセットを離します。
10. 針のドライバと切開の両側の筋肉を介して貫通することで縫合針を保持する。
11. 2ノットを結ぶと余分な縫合糸を切断。唯一の一針の縫合は、1cmの切開のために必要です。
12. 鎮静鎮痛効果で魚を提供するために5時間Tricaineの百万分の10部を含む魚の水中で魚を置きます。
13. 通常の栄養補給と回復のためのシステムに戻って魚を置きます。
14. 回復の7から18日後、私たちは魚を解剖し、ライブのEGFPの蛍光による腎前駆細胞の生着を​​分析する。

5。代表的な結果：

移植の全体的な戦略は、図1に示されています。私たちの腎臓研究のために、腎臓は、EGFP蛍光で解剖、分析されます。腎臓前駆細胞の生着と分化は7日間の移植後には早くも検出されます。これは、EGFPの複数のクラスタ⁺腎上皮細胞（図2）の存在によって明らかである。移植後18日間では、我々は、ドナーの細胞が新しい腎組織（図3）を形成したことを示す、24 EGFP ⁺ネフロンの平均を検出する。長期の生着を示すために、我々は、受信者の魚59日の移植後（図4）を解剖。この魚は腎臓前駆細胞が遊走していることを示唆し、遠隔部位（白矢頭）で、複数のネフロンに加えて、注射の部位（赤矢印）で多くのネフロンを有していた。この手法は、細胞が生着を検出するために約3ヶ月かかる心臓を経由して循環に注入されるときに比べてより速く、より効率的です。

図1。移植。非トランスジェニックレシピエント魚の全体的なスキームは、移植細胞の免疫拒絶反応を抑制するために照射されています。三日後、切開は、魚の側面で行われ、ドナーの前駆細胞が露出ヘッド腎臓に注入されています。切開は、回復のためにシステムに戻されているもの縫合と魚とまで閉じられます。受信者の魚の腎臓は、後の時点で解剖し、生着および前駆活性について分析されています。

図2。七日後の前駆細胞の移植 。腎臓前駆細胞の生着は、EGFP ⁺腎上皮細胞のクラスターの存在（ -拡大図挿入図）によって決定される、7日間の移植後におけるヘッドの腎臓の注入側で検出されている。

図3。 ... 18日後に前駆細胞の移植は、移植後18日後、我々は24 EGFP ⁺ドナー由来のネフロン（ -個々のEGFP ⁺ネフロンの拡大図の挿入）の平均値を検出する。

図4。 59日後の生着と前駆細胞の遊走は。私たちも、59日（赤い矢印の頭）の後に、移植後の長い前駆細胞の生着を検出するために続けた。この後の時点で、ドナー由来のネフロンは、前駆細胞の遊走と一貫性注入（白い矢印の頭）のサイトから離れている部位で検出されています。

Discussion

細胞の移植技術は、再生研究のために極めて重要であり、幹細胞活性を測定するためのゴールドスタンダードアッセイです。ここで、我々は、幹細胞や前駆細胞の活性を決定するために直接成体ゼブラフィッシュの腎臓に細胞を移植するための方法を報告する。この手順では、直接腎臓に細胞の注入に続いて、ヘッドの腎臓を露出させる筋肉を通して切開をとることが必要です。切開は、一針の縫合で閉じられ、運営魚は90〜100％生存率を持っています。我々の実験では、移植した腎臓前駆細胞は、7日後の移植によって移植魚80〜100％で検出されています。このテクニックの一つの制限は、切開が容易にメスによって破壊することができる背部大動脈、そばにいることです。しかし、一度マスターして、出血の率は1％未満に減らすことができます。我々の方法は、腎臓に他の細胞型（血液、間質、または血管）だけでなく、小分子を提供するように適合させることができる。この技術の開発は、事前に再生の研究を支援し、in vivoで評価される幹細胞や前駆細胞の可能性を許可します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Insulin syringe needle (28 gauge)	BD Biosciences	329461
Cell strainer (40 uM)	BD Biosciences	352340
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Hamilton syringe (26 gauge)	Sigma-Aldrich	20734
Ethilon suture (size 9-0)	Ethicon Inc.	2819G