Die Transplantation von Zellen direkt in die Niere von Adult Zebrafisch

Summary

Zell-Transplantation ist eine wesentliche Technik zur Untersuchung der Geweberegeneration sowie für die Entwicklung zellbasierter Therapien von Krankheiten. Wir zeigen hier eine mikrochirurgische Technik, dass die Transplantation von genetisch markierten Zellen ermöglicht direkt in der Niere der erwachsenen Zebrafisch Fisch.

Abstract

Regenerative Medizin über die Transplantation von Stamm-oder Vorläuferzellen in geschädigtes Gewebe Basis hat das Potenzial, ein breites Spektrum von chronischen Erkrankungen ^{1 zu} behandeln. Allerdings sind die meisten Organe nicht leicht zugänglich, erfordern die Notwendigkeit, chirurgische Methoden zu entwickeln, um Zugang zu diesen Strukturen zu gewinnen. In diesem Video-Beitrag beschreiben wir eine Methode zur Transplantation von Zellen direkt in der Niere der erwachsenen Zebrafisch, ein beliebtes Modell, um die Regeneration und ^{Krankheit-2-Studie.} Empfänger Fische sind durch die Bestrahlung der Immunabwehr der injizierten Zellen ³ unterdrücken vorkonditioniert. Wir zeigen, wie der Kopf Niere durch einen seitlichen Schnitt in der Flanke des Fisches, durch die Injektion von Zellen direkt in die Orgel folgte ausgesetzt werden kann. Mit fluoreszenzmarkierten gesamte Niere Knochenmarkzellen mit einer gemischten Bevölkerung von Nieren-und hämatopoetischen Vorläufer zeigen wir, dass Nephron Vorläuferzellen können einprägen und differenzieren sich in neuen Nierengewebe - dem Goldstandard von Zell-basierten regenerativen Therapie. Diese Technik kann angepasst zu liefern gereinigt Stamm-oder Vorläuferzellen und / oder kleinen Molekülen, um die Niere sowie andere innere Organe und eine weitere Verbesserung der Zebrafisch als vielseitiges Modell, um die regenerative Medizin zu studieren.

Protocol

1. Konditionierung von nicht-transgenen Empfänger Fisch.

1. Wählen Sie das größte Männchen in das System für eine Transplantation.
2. Den Fisch in 0,02% Tricaine (pH 7) für ca. 3 Minuten oder bis zum Anschlag Schwimmen, aber nicht so lang, dass das Herz aufhört zu schlagen.
3. Setzen Sie den narkotisierten Fisch auf einem feuchten Papiertuch auf einer Tischplatte.
4. Verwenden Sie eine Insulinspritze Nadel auf 40 ug von Gentamicin in 20 ul Wasser spritzen in die Bauchhöhle des Fisches. Für Nieren-Regeneration Studien, ist dieser Schritt für die Induktion ein günstiges Umfeld für eine verstärkte Anwachsen wichtig.
5. Legen Sie den Fisch wieder ins Wasser System für die Verwertung.
6. Der Fisch kann gelehrig und sehr empfindlich auf äußere Reize wie Vibration. Nach 3 Stunden der Erholung, behandeln die Fische mit 25 Grau der Gamma-Bestrahlung.
7. Legen Sie den Fisch wieder in das System für 3 Tage ohne Essen vor der Transplantation.

2. Vorbereitung von Vorläuferzellen Spenderzellen genetisch mit einem fluoreszierenden Marker (EGFP oder mCherry) gekennzeichnet.

1. Kurz vor dem chirurgischen Eingriff, bereiten die Spenderzellen zu verpflanzen und halten sie auf dem Eis.
2. Für Nieren-Studien, verwenden wir die gesamte Niere Knochenmarkzellen aus der Tg (cdh17: EGFP) transgene Linie, die Nieren-und hämatopoetischen Vorläuferzellen enthalten. Diese Vorläuferzellen sind genetisch markiert und wird nur ausdrücken, EGFP, wenn sie und einprägen differenzieren sich in Nieren-Epithelzellen. Andere Typen von markierten Stammzellen können auch verwendet werden, wie Tg (scl: EGFP) für hämatopoetische Stammzellen oder Tg (fli1a: EGFP) für angioblast Vorfahren Transplantationen.
3. Euthanize 3 Erwachsene transgene Fische, indem sie in 0,2% Tricaine für 5 Minuten.
4. Verwenden Sie einen sterilisierten Rasierklinge an den Kopf und Schwanz, und Präparierscheren entfernen, um eine Mittellinienschnitt entlang der Bauchseite zu machen.
5. Unter einem Stereoskop, entfernen Sie alle inneren Organe in der Körperhöhle einschließlich der Schwimmblase mit einer Pinzette. Achten Sie darauf, nicht auf die Niere, die eine flache und pigmentierte Orgel an der dorsalen Wand des Hohlraums zu entfernen.
6. Als nächstes sezieren die Niere von der dorsalen Wand und legen Sie sie in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen mit 300 uL der kalten Phosphatpuffer Kochsalzlösung mit 2% fetalem Kälberserum (1X PBS / 2% FCS) ergänzt.
7. Verwenden Sie einen Mörser zu scheren der Niere, bis sie homogenisiert wird.
8. Legen Sie eine 40 uM Zellsieb in einem 50 mL Falcon-Röhrchen und übertragen Sie die Zell-Lösung auf der Oberseite der Zelle Sieb, so dass die losen Zellen zu filtern durch in das Falcon-Röhrchen.
9. Verwenden Sie den Stößel sanft Abstrich der große Gewebestücke, die auf dem Sieb bleiben, um weiter die Zellen aufzubrechen.
10. Lassen Sie die Zelle Lösung in der Falcon-Röhrchen und waschen Sie das Sieb mit 1,2 ml 1X PBS / 2% FCS, um restliche Zellen aus dem Sieb sammeln.
11. Übertragen Sie die Zell-Lösung in ein neues 1,5-ml-Tube und zentrifugieren bei 4 ° C bei 300 rcf für 5 Minuten.
12. Waschen Sie die Zellpellet mit 1,5 ml 1X PBS / 2% FCS und geben es durch ein neues Sieb herausgefiltert Klumpen von Zellen und klebrige Zentrifuge wieder.
13. Zellpellet in 200 uL der 1X PBS / 2% FCS und in ein PCR-Röhrchen.
14. Zentrifugieren Sie die PCR-Röhrchen (4 ° C, 300 rcf, 1 min) und die Abschaffung der meisten Überstand.
15. Resuspendieren der Zellen in der restlichen Überstand auf eine 2-5 uL Endvolumen zu erhalten und bewahren Sie sie auf Eis.
16. Finale zellulären Ausbeute sollte etwa 2 Millionen Zellen pro Niere.
17. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einer Zählkammer und passen Sie die Konzentration auf 5 x 10 ⁵ Zellen pro UL.

3. Laden Sie die Zell-Lösung in einer Hamilton-Spritze.

1. Spülen Sie den Hamilton-Spritze mit sterilem Wasser 3-mal.
2. Spülen Sie die Spritze mit 75% Ethanol 3 mal.
3. Spülen Sie die Spritze wieder mit 1X PBS / 2% FCS 3 mal.
4. Legen Sie dann die Spritze mit 1 uL von Zell-Lösung enthält etwa 5 x 10 ⁵ Zellen unmittelbar vor der Injektion.

4. Transplantation von Vorläuferzellen direkt in die Niere.

1. Anesthetize das konditionierte Empfänger Fisch in 0,02% Tricaine für ca. 3 Minuten, oder bis der Fisch sich nicht mehr bewegt, aber nicht zu lange, dass das Herz aufhört zu schlagen.
2. Unter einem Stereomikroskop, lag der Fisch auf einem Papiertuch mit dem Kopf nach links, Bauchseite nach oben, um zu trocknen die transplantierten Seite.
3. Dann rollen Sie den Fisch über dem getrockneten Seite freizulegen.
4. Mit sterilisiert Pinzette entfernen Sie die Waage in der Region unmittelbar hinter den Kiemen.
5. Machen Sie eine 1 cm seitlichen Einschnitt in diesem Bereich an der Mittellinie mit einem Skalpell und stabilisiert das Gewebe mit einer Pinzette.
6. Mit der Pinzette, setzen das Gewebe während sie weiterhin den Einschnitt tief genug machenauf den Kopf Niere freizulegen.
7. Wenn es gibt eine Menge von Blutungen, die Visualisierung der Niere verhindert, euthenize die Fische und beginnen mit einem anderen Empfänger Fisch.
8. Während neugierigen Gewebe offen auf den Kopf Niere freizulegen, spritzen 1 UL der Zelle Lösung direkt in den Kopf Niere.
9. Dann, zur gleichen Zeit wie die Nadel der Spritze wird abgerufen, lassen Sie die Pinzette, so dass das Gewebe fällt zurück an ihren Platz zu verhindern Auslaufen der injizierten Zellen.
10. Halten Sie ein Suturnadeln mit einer Nadel durchstechen Fahrer und es durch den Muskel auf jeder Seite des Schnittes.
11. Tie 2 Knoten und schneiden Sie das überschüssige Faden. Nur eine einzige Naht ist für eine 1 cm lange Inzision erforderlich.
12. Legen Sie den Fisch im Fisch Wasser mit 10 Teilen pro Million Tricaine für 5 Stunden zum Fischen mit einem beruhigenden analgetische Wirkung zu erzielen.
13. Legen Sie den Fisch wieder in das System für die Verwertung mit normaler Fütterung.
14. Nach 7-18 Tage der Erholung, zerlegen wir die Fische und analysieren Transplantation von Nieren-Vorläuferzellen von Live-EGFP-Fluoreszenz.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Die allgemeine Strategie der Transplantation ist in Abbildung 1 dargestellt. Für unsere Nieren Studien, ist die Niere seziert und analysiert durch EGFP-Fluoreszenz. Engraftment und der Differenzierung der renalen Progenitorzellen wird so früh wie 7 Tage nach der Transplantation festgestellt. Dies wird durch das Vorhandensein mehrerer Gruppen von EGFP ⁺ renalen Epithelzellen (Abbildung 2) ersichtlich. Durch 18 Tage nach der Transplantation, erkennen wir einen Durchschnitt von 24 EGFP ⁺ Nephronen, was darauf hinweist, dass Spenderzellen wurden neue Nierengewebe gebildet (Abb. 3). Um zu demonstrieren, langfristige engraftment wir einen Empfänger Fisch 59 Tage nach der Transplantation (Abbildung 4). Dieser Fisch hatte viele Nephrone an der Injektionsstelle (roter Pfeil) neben mehreren Nephronen an entfernten Stellen (weiße Pfeilspitzen), was darauf hindeutet, dass die renale Vorläuferzellen Zugvögel sind. Diese Technik ist schneller und effizienter im Vergleich zu, wenn die Zellen in den Blutkreislauf über das Herz, das etwa drei Monate dauert, bis engraftment erkennen injiziert.

Abbildung 1. Insgesamt Schema der Transplantation. Nichttransgenen Empfänger Fische bestrahlt, um immun gegen Abstoßung von transplantierten Zellen zu unterdrücken. Drei Tage später wird ein Schnitt an der Flanke des Fisches und Spender Stammzellen hergestellt werden in den freiliegenden Kopf Niere injiziert. Der Schnitt wird mit einer Naht verschlossen und Fische sind wieder in das System für die Verwertung gelegt. Nieren des Empfängers Fische sind zu späteren Zeitpunkten seziert und analysiert für Transplantation und Vorläuferzellen Aktivität.

Abbildung 2. Transplantation von Vorläuferzellen nach sieben Tagen. Transplantation von Nieren-Vorläuferzellen ist auf den injizierten Seite des Kopfes Niere 7 Tage nach der Transplantation erkannt, wie durch die Anwesenheit von Clustern von EGFP ⁺ renalen Epithelzellen (kleines Bild - vergrößerte Ansicht) bestimmt.

Abbildung 3. Transplantation von Vorläuferzellen nach 18 Tagen Nach 18 Tagen nach der Transplantation, erkennen wir einen Durchschnitt von 24 EGFP ⁺ Spender-derived Nephrone (insert - vergrößerte Ansicht der einzelnen EGFP ⁺ Nephrone)..

Abbildung 4. Engraftment und Migration von Vorläuferzellen nach 59 Tagen. Wir setzten Transplantation von Vorläuferzellen lange nach der Transplantation erkennen, auch nach 59 Tagen (roter Pfeil Kopf). Zu diesem späteren Zeitpunkt, sind Spender-derived Nephrone an Standorten abseits der Injektionsstelle (weißer Pfeil Köpfe), im Einklang mit Progenitorzellen Migration erkannt.

Discussion

Zell-Transplantation Techniken sind entscheidend für regenerative Studien und sind der Goldstandard-Test zur Messung der Stammzell-Aktivität. Hier berichten wir über eine Methode zur Transplantation von Zellen direkt in der Niere der erwachsenen Zebrafisch auf Stamm-und Progenitorzellen Aktivität zu bestimmen. Dieses Verfahren beinhaltet einen Einschnitt durch den Muskel, den Kopf Niere, durch Injektion von Zellen direkt in die Niere, gefolgt aussetzen. Der Schnitt wird mit einer einzigen Naht geschlossen und das operierte Fische haben eine 90-100% Überlebensrate. In unseren Experimenten eingepflanzt renalen Progenitorzellen in 80-100% der transplantierten Fisch von sieben Tagen nach der Transplantation festgestellt. Eine Einschränkung dieser Technik ist, dass der Schnitt in der Nähe der Aorta dorsalis, die leicht durch das Skalpell kann gebrochen werden soll. Doch sobald sie beherrscht, kann die Rate der Blutungen auf weniger als ein Prozent reduziert werden. Unsere Methode könnte angepasst zu anderen Zelltypen (Blut, Bindegewebs-, oder vaskulären) sowie kleine Moleküle, um die Niere zu liefern. Die Entwicklung dieser Technik wird dazu beitragen, regenerative Studien und erlauben Stamm-und Progenitorzellen Potenzial in vivo zu beurteilen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Insulin syringe needle (28 gauge)	BD Biosciences	329461
Cell strainer (40 uM)	BD Biosciences	352340
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Hamilton syringe (26 gauge)	Sigma-Aldrich	20734
Ethilon suture (size 9-0)	Ethicon Inc.	2819G