직접 성인 Zebrafish의 신장에 세포의 이식

Summary

세포 이식은 조직 재생을 연구와 질병의 세포 기반 치료법​​을 개발하기위한 필수적인 기술입니다. 우리는 여기서 성인 zebrafish 물고기의 신장에 직접 레이블 유전자 세포의 이식을 허용 microsurgical 기법을 보여줍니다.

Abstract

손상된 조직에 줄기 또는 조상 세포의 이식에 따라 재생 의학은 만성 질환 ¹ 다양한 치료 가능성이있다. 그러나 대부분의 기관이 구조에 액세스할 수 외과 방법을 개발의 필요성을 necessitating 쉽게 액세스할 수 없습니다. 이 비디오를 문서에서, 우리는 직접 성인 zebrafish, 중생과 ^{질병이 공부를} 인기있는 모델의 신장에 세포를 이식하는 방법을 설명합니다. 받는 사람 물고기는 주입 세포 ³ 면역 거부를 억제하기 위해 방사선에 의해 사전 냉방 있습니다. 우리는 머리 신장이 직접 기관에 세포의 주입 다음에 물고기의 측면에 가로 절개에 의해 노출 수있는 방법을 보여줍니다. 모든 셀 기반의 재생 치료의 황금 표준 - 신장과 조혈 엽 성의 전구 물질의 혼합 인구로 구성된 찬란 분류 전체 신장 골수 세포를 사용하여, 우리는 nephron의 progenitors가 합치다하고 새로운 신장 조직으로 차별화 수 보여줍니다. 이 기법은 신장뿐만 아니라 다른 내부 장기의 줄기 또는 조상 세포 및 / 또는 작은 분자를 정화하고 추가 재생 의학을 공부하기 위해 다양한 모델로 zebrafish를 향상 전달하기 위해 적용할 수 있습니다.

Protocol

1. 비 - 유전자 변형받는 물고기의 컨디셔닝.

1. 이식에 필요한 시스템에서 가장 큰 남성 생선을 선택합니다.
2. 약 3 분 또는 수영 있지만, 심장 박동 중지 너무 오래하지 멈출 때까지 0.02 % Tricaine에있는 물고기 (산도 7) 장소.
3. 작업대 위에 젖은 종이 타월에 anesthetized 생선을 넣어.
4. 물고기의 intraperitoneal 구멍에 물을 20 UL에서 gentamicin 40 UG를 삽입하는 인슐린 주사 바늘을 사용합니다. 신장 재생 연구의 경우,이 단계는 향상된 engraftment을위한 유리한 환경을 유도하는 것이 중요합니다.
5. 복구를 위해 시스템 물로 다시 생선을 넣어.
6. 물고기 다루기 및 진동 등의 외부 자극에 민감 수 있습니다. 복구 3 시간 후, 감마 방사선 조사 25 회색으로 생선을 취급.
7. 이전 이식 음식없이 3 일간 다시 시스템에 물고기를 넣어.

2. 전구 기증자 세포의 준비는 유전 형광 마커 (EGFP 또는 mCherry)로 표시.

1. 그냥 이전에 수술로 이식하는 기증자 세포를 준비하고 얼음에 있습니다.
2. 신장과 조혈 전구 세포를 포함하는 유전자 변형 라인 : 신장 연구, 우리는 TG (EGFP cdh17)에서 전체 신장 골수 세포를 사용합니다. 이러한 전구 세포는 유전자 표시하고 그들이 합치다 및 신장 상피 세포로 차별화하는 경우에만 EGFP을 표현합니다. angioblast의 progenitors 이식을 위해 : 조혈 줄기 세포 또는 TG (EGFP fli1a)에 : 표시 전구 세포의 다른 종류는 또한 TG (EGFP SCL)으로 사용할 수 있습니다.
3. 5 분 0.2 % Tricaine에서 그들을 배치로 3 성인 유전자 변형 물고기를 안락사.
4. 복부 측면을 따라 정중선 절개를 만들기 위해 머리와 꼬리, 그리고 해부 가위를 제거하는 소독 면도날을 사용합니다.
5. 입체경에서 족집게로 수영 방광을 포함하여 뱃속에있는 내장을 모두 제거합니다. 구멍의 지느러미 벽에 부착된 평면과 색소 오르간있는 신장을 제거하지 않도록주의하십시오.
6. 다음, 등 부분의 벽면에서 신장을 해부하다하고 2퍼센트 소태아 혈청 (1X PBS / 2% FCS)와 보충 차가운 인산염 버퍼 호수 300 UL을 포함한 1.5 ML의 원심 관에 넣습니다.
7. 그것이 균질 될 때까지 전단 신장에 유봉을 사용합니다.
8. 50 ML 팔콘 튜브 안에 40 음 셀 스트레이너를 삽입하고 느슨한 세포 팔콘 튜브에 통과 필터 수 있도록 셀 스트레이너 위에 셀 솔루션을 전송할 수 있습니다.
9. 부드럽게 얼룩 더욱 조직을 깰 수있는 여과기에 남아있는 조직의 큰 조각을하는 유봉을 사용합니다.
10. 팰컨 튜브 셀 솔루션을두고 스트레이너의 잔여 세포를 수집하는 1X PBS / 2% FCS 1.2 ML로 스트레이너 씻으십시오.
11. ° C 300 RCF에서 5 분 4 새로운 1.5 ML 튜브와 원심 분리기에 셀 솔루션을 전송합니다.
12. 1X PBS / 2% FCS 1.5 ML로 세포 펠렛을 씻고 끈적끈적한 세포의 대단히 짧은 시간을 필터링하고 다시 원심 분리기에 새로운 스트레이너를 통해 전달한다.
13. 1X PBS의 / 2% FCS 200 UL의 세포 펠렛을 Resuspend 및 PCR 튜브에 전송할 수 있습니다.
14. PCR 튜브 (4 ° C, 300 RCF, 1 분)을 원심 분리기 및 뜨는의 대부분을 제거합니다.
15. 2-5 UL 최종 볼륨을하고 얼음에 저장하는 잔류 뜨는의 세포를 Resuspend.
16. 최종 세포 수율은 신장 약 2,000,000 전지해야합니다.
17. hemocytometer로 세포의 수를 계산하고 5 농도를 조절 UL 회 X 10 ⁵ 세포.

3. 해밀턴 주사기로 세포 솔루션을로드합니다.

1. 멸균 물 3 회와 해밀턴 주사기 린스.
2. 3 회 에탄올 75%과 주사기를 씻어.
3. 1X로 다시 PBS / 2퍼센트 FCS 3 번 주사기를 씻어.
4. 그런 다음 셀 솔루션 1 UL 방금 전에 주사로 약 5 × 10 ⁵ 세포를 포함하고있는 주사기를로드합니다.

4. 직접 신장에 전구 세포 이식.

1. 물고기가 안움직여 약 3 분, 또는 때까지 아니지만 너무 오래 심장 박동 중지에 대해 0.02 % Tricaine에서 에어컨받는 물고기를 마취.
2. stereomicroscope에서 이식 측면을 건조하기 위해, 최대 왼쪽 복부 쪽을 향해 머리를 종이 타월에 생선을 믿는다.
3. 그런 다음 마른 측면을 노출하기 위해 생선을 통해 롤.
4. 멸균 핀셋을 사용하여 아가미에 즉시 후부 지역에서 비늘을 제거합니다.
5. 핀셋으로 조직을 안정화하면서 때론 정중선에이 지역에서 1cm 측면 절개를합니다.
6. 깊은 충분히 절개를 계속하면서 핀셋을 사용하여 조직을 노출머리 신장을 폭로합니다.
7. 신장의 시각화를 방지 출혈이 많이있다면, 물고기를 euthenize 다른받는 물고기와 함께 다시 시작.
8. 머리 신장을 노출하기 위해 조직이 열려 캐고 있지만, 직접 머리 신장에 세포 솔루션 1 UL을 주입.
9. 조직이 주입된 세포의 누출 방지하기 위해 장소로 다시 떨어지는 것을 그럼, 주사기 바늘이 검색되는 것과 동시에, 족집게를 놓습니다.
10. 바늘 드라이버와 절개의 각 측면에있는 근육을 통해 피어스 그것으로 봉합 바늘을 잡아.
11. 이 매듭 묶는하고 초과 봉합을 차단. 오직 하나의 봉합은 1cm 절개를 위해 필요합니다.
12. 진정 진통 효과와 생선을 제공하는 5 시간 Tricaine의 백만 당 10 부품을 포함하는 물고기 물 속에 물고기를 놓습니다.
13. 정상 feedings와 복구 시스템으로 다시 물고기를 놓습니다.
14. 회복의 7-18일 후, 우리는 물고기를 해부하다 라이브 EGFP 형광에 의해 신장 전구 세포 engraftment를 분석합니다.

5. 대표 결과 :

이식의 전체적인 전략은 그림 1에서 그림입니다. 우리 신장 연구, 신장이 해부되고 EGFP 형광으로 분석했다. 신장 전구 세포의 Engraftment과 차별화는 7 일 이후 이식 빠르면 감지됩니다. 이것은 EGFP의 여러 클러스터 ⁺ 신장 상피 세포 (그림 2)의 존재에 의해 분명하다. 십팔일 게시물 이식함으로써, 우리는 기증자의 세포 (그림 3) 신장 이식 조직을 형성한다는 의미, 24 EGFP ⁺ nephrons의 평균을 감지. 장기 engraftment을 증명하기 위해, 우리는받는 물고기 59일 게시물 이식 (그림 4)를 해부 했어요. 이 물고기는 신장 전구 세포가 철새 것을 제안, 먼 사이트 (흰색 화살촉)에서 여러 nephrons 이외에 주입의 사이트 (빨간 화살촉)에서 많은 nephrons했다. 이 기술은 세포 engraftment을 감지까지 약 3 개월이 소요 심장을 통해 혈액 순환에 주입하는 경우에 비해보다 빠르고 효율적입니다.

그림 1. 이식. 비 유전자 변형받는 물고기의 전체 구조는 이식 세포의 면역 거부를 억제하기 위해 조사하고 있습니다. 사흘 후, 절개는 생선과 기증 전구 세포의 측면에서 이루어집니다은 노출된 머리 신장에 주입하고 있습니다. 절개는 복구를 위해 시스템에 다시 배치되는 하나 봉합와 물고기와 닫힙니다. 받는 물고기의 신장은 나중에 포인트로 해부하고 engraftment 및 시조 활동에 대한 분석입니다.

그림 2. 7 일 후에 전구 세포 Engraftment. 신장 전구 세포의 Engraftment은 같은 EGFP ⁺ 신장 상피 세포의 클러스터의 존재 (- 확대보기 삽입된 페이지)에 의해 결정, 7 일 이후 이식의 머리 신장의 주입 측면에 감지됩니다.

그림 3. 십팔일 후 전구 세포의 Engraftment 십팔일 게시물 이식 후, 24 EGFP의 평균 ⁺ 기증자 파생 nephrons를 (삽입 - 개인 EGFP ⁺ nephrons의 확대보기) 감지..

그림 4. 59일 후 Engraftment 및 전구 세포의 마이 그 레이션. 우리는 심지어 59일 (레드 애로우 헤드) 후 이식 후 긴 전구 세포 engraftment을 감지 계속. 나중에이 시점에서, 기증자 파생 nephrons은 전구 세포의 이주와 일치하는 주입 (흰색 화살표 머리)의 사이트에서 떨어진 장소에서 감지됩니다.

Discussion

세포 이식 기술은 재생 연구에 중요한되며 줄기 세포 활동을 측정하는 황금 표준 분석하고 있습니다. 여기서 우리는 줄기 및 전구 세포의 활동을 결정하기 위해 직접 성인 zebrafish의 신장에 세포를 이식하는 방법을보고합니다. 이 절차는 직접 신장에 세포의 주입 다음에 머리 신장을 노출하기 위해 근육을 통해 절개 포함됩니다. 절개는 단일 봉합과 함께 폐쇄하고 운영 물고기 90~100%의 생존 비율을 가지고있다. 우리의 실험에서, engrafted 신장 전구 세포는 7 일 게시 이식에 의해 이식 물고기의 80-100%에서 감지됩니다. 이 기법 중 하나는 한계는 절개 쉽게 메스에 의해 파열 수있는 등의 대동맥, 근처에있다는 것입니다. 그러나, 일단 마스터, 출혈의 속도 미만 %까지 줄일 수 있습니다. 우리의 방법은 신장에 다른 세포 유형 (혈액, stromal, 또는 혈관)뿐만 아니라 작은 분자를 제공하기 위해 적응 수 있습니다. 이 기법의 개발은 사전에 재생 연구를 도움 줄기 및 전구 세포의 잠재력은 생체내에서 평가하는 것을 허용합니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Insulin syringe needle (28 gauge)	BD Biosciences	329461
Cell strainer (40 uM)	BD Biosciences	352340
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Hamilton syringe (26 gauge)	Sigma-Aldrich	20734
Ethilon suture (size 9-0)	Ethicon Inc.	2819G