Transplante de células diretamente no Rim de Adulto Zebrafish

Summary

Transplante de células é uma técnica essencial para o estudo da regeneração de tecidos e para o desenvolvimento de terapias baseadas em células da doença. Demonstramos aqui uma técnica de microcirurgia, que permite o transplante de células geneticamente marcado diretamente no rim de peixes paulistinhas adultos.

Abstract

Medicina regenerativa baseada no transplante de células-tronco ou progenitoras para os tecidos danificados tem o potencial para tratar uma vasta gama de doenças crônicas ^1. No entanto, a maioria dos órgãos não são facilmente acessíveis, exigindo a necessidade de desenvolver métodos cirúrgicos para ter acesso a essas estruturas. Neste artigo de vídeo, descrevemos um método de transplante de células diretamente no rim de adulto zebrafish, um modelo popular para estudo da regeneração e da doença ^2. Peixes destinatário são pré-condicionadas por irradiação para suprimir a rejeição imunológica das células injetadas ^3. Demonstramos como o rim cabeça pode ser exposto por uma incisão lateral no flanco dos peixes, seguido pela injeção de células diretamente para o órgão. Usando fluorescente etiquetado células de rim inteiro medula compreendendo uma população mista de precursores renal e hematopoiético, mostramos que progenitores néfron pode enxertar e se diferenciar em tecido renal novo - o padrão ouro de qualquer terapia baseada em células regenerativas. Esta técnica pode ser adaptada para entregar purificada-tronco progenitoras ou células e / ou pequenas moléculas para o rim, bem como outros órgãos internos e aumenta ainda mais o peixe-zebra como modelo versátil para estudar medicina regenerativa.

Protocol

1. Condicionamento da não-transgênicas peixes destinatário.

1. Selecione o maior peixe do sexo masculino no sistema para transplante.
2. Coloque o peixe em tricaina 0,02% (pH 7) por aproximadamente 3 minutos ou até que ele pára de nadar, mas não tanto tempo que o coração pára de bater.
3. Coloque o peixe anestesiados em uma toalha de papel úmida no topo de uma bancada.
4. Use uma agulha de seringa de insulina para injetar 40 ug de gentamicina em 20 uL de água na cavidade intraperitoneal dos peixes. Para estudos de regeneração renal, esta etapa é importante para induzir um ambiente favorável para o enxerto reforçada.
5. Coloque o peixe de volta à água do sistema para a recuperação.
6. O peixe pode ser dócil e muito sensível a estímulos externos, tais como vibração. Após 3 horas de recuperação, tratar os peixes com 25 cinza da radiação gama.
7. Coloque o peixe novamente no sistema, durante 3 dias sem comer antes do transplante.

2. Preparação de células progenitoras do doador geneticamente marcado com um marcador fluorescente (EGFP ou mCherry).

1. Pouco antes do procedimento cirúrgico, prepare as células dos doadores para serem transplantados e mantê-los no gelo.
2. Para estudos renal, usamos células de rim inteiro a partir da medula (cdh17: EGFP) Tg linhagem transgênica, que contém células progenitoras hematopoéticas e renal. Estas células progenitoras são geneticamente marcado e só vai expressar EGFP se enxertar e se diferenciar em células epiteliais renais. Outros tipos de células progenitoras rotulados também pode ser usado, como Tg (SCL: EGFP) para a célula-tronco hematopoiéticas ou Tg (fli1a: EGFP) para transplantes de células progenitoras angioblast.
3. Euthanize 3 peixes adultos transgênico, colocando-os em tricaina 0,2% por 5 minutos.
4. Use uma lâmina de barbear esterilizada para remover a cabeça ea cauda, ​​e tesouras de dissecação para fazer uma incisão mediana ao longo do lado ventral.
5. Sob um estereoscópio, remover todos os órgãos internos na cavidade do corpo, incluindo a bexiga natatória com pinças. Tenha cuidado para não remover o rim, que é um órgão plana e pigmentada fixados à parede dorsal da cavidade.
6. Em seguida, dissecar o rim da parede dorsal e colocá-lo em um tubo de centrífuga de 1,5 mL contendo 300 uL de solução salina fria tampão fosfato suplementado com 2% de soro fetal bovino (FCS 1X PBS / 2%).
7. Use um pilão para o rim de corte até que se torne homogêneo.
8. Coloque um filtro de 40 uM de células dentro de um tubo de Falcon 50 mL e transferir a solução da célula na parte superior do filtro de celular, permitindo que as células soltas para filtrar para dentro do tubo Falcon.
9. Use o pilão para gentilmente esfregaço grandes peças de tecido que são deixados no filtro para continuar a quebrar as células.
10. Deixe a solução da célula no tubo Falcon e lavar o filtro com 1,2 ml de 1X PBS FCS / 2% para coletar células residuais do filtro.
11. Transferir a solução de células em um tubo de 1,5 mL novo e centrifugar a 4 ° C a 300 rcf durante 5 minutos.
12. Lave o pellet celular com 1,5 ml de 1X PBS FCS / 2% e passá-lo através de um filtro novo para filtrar aglomerados de células pegajosa e centrifugar novamente.
13. Ressuspender o pellet celular em 200 uL de PBS 1X da FCS / 2% e transferir para um tubo de PCR.
14. Centrifugar o tubo de PCR (4 ° C, a 300 rcf, 1 min) e remover a maioria do sobrenadante.
15. Ressuspender as células no sobrenadante residual para obter um volume de 2-5 uL final e armazená-lo em gelo.
16. Rendimento celular final deve ser de aproximadamente 2 milhões de células por rim.
17. Contar o número de células com um hemocitômetro e ajustar a concentração de 5 x 10 ⁵ células por uL.

3. Carregue a solução de célula em uma seringa de Hamilton.

1. Enxágüe a seringa Hamilton com água estéril 3 vezes.
2. Enxágüe a seringa com 75% de etanol três vezes.
3. Enxágüe a seringa novamente com 1X PBS / 2% FCS 3 vezes.
4. Em seguida, carregar a seringa com uma uL de solução de células contêm cerca de 5 x 10 ⁵ células pouco antes da injeção.

4. O transplante de células progenitoras diretamente no rim.

1. Anestesiar os peixes acondicionados em recipiente tricaina 0,02% para cerca de 3 minutos, ou até o peixe parou de se mover, mas não muito tempo que o coração pára de bater.
2. Sob microscópio estereoscópico, coloque o peixe sobre uma toalha de papel com a cabeça para o lado, à esquerda ventral para cima, a fim de secar o lado transplantado.
3. Em seguida, rola o peixe mais para expor o lado seco.
4. Usando uma pinça esterilizada, retire as escamas na região imediatamente posterior às brânquias.
5. Faça uma incisão de 1 cm laterais nesta área na linha média com um bisturi, enquanto estabilizar o tecido com pinças.
6. Usando a pinça, expor o tecido enquanto continua a fazer a incisão profunda o suficientepara expor o rim cabeça.
7. Se existe uma grande quantidade de sangramento que impede a visualização do rim, euthenize o peixe e começar de novo com outro peixe destinatário.
8. Enquanto curiosos do tecido aberto para expor o rim cabeça, injectar 1 uL da solução de células diretamente no rim cabeça.
9. Então, ao mesmo tempo, como a agulha da seringa está sendo recuperado, solte a pinça de modo que o tecido cai de volta no lugar para evitar vazamento das células injetadas.
10. Segurar uma agulha de sutura com um motorista de agulha e fure-o através do músculo em cada lado da incisão.
11. Amarre dois nós e corte o excesso de sutura. Apenas uma única sutura é necessário para uma incisão de 1 cm.
12. Coloque o peixe em água de peixes contendo 10 partes por milhão de tricaina por 5 horas para fornecer peixe com um efeito calmante analgésico.
13. Coloque o peixe de volta ao sistema de recuperação com a alimentação normal.
14. Após 7-18 dias de recuperação, dissecamos o peixe e analisar o enxerto de células progenitoras renal por viver EGFP fluorescência.

5. Resultados representativos:

A estratégia global do transplante é ilustrada na Figura 1. Para os nossos estudos renal, o rim é dissecado e analisado por fluorescência de EGFP. Enxerto e diferenciação de células progenitoras renal é detectado logo aos sete dias após o transplante. Isto é evidente pela presença de vários clusters de EGFP ⁺ renal células epiteliais (Figura 2). Por 18 dias pós-transplante, detectamos uma média de 24 EGFP ⁺ néfrons, indicando que as células dos doadores formaram o tecido novo rim (Figura 3). Para demonstrar a longo prazo enxerto, dissecamos um peixe destinatário 59 dias após o transplante (Figura 4). Este peixe tinha muitos néfrons no local da injeção (vermelho ponta de seta), além de vários néfrons em locais distantes (setas brancas), sugerindo que as células progenitoras renal são migratórias. Esta técnica é mais rápida e mais eficiente em comparação com quando as células são injetadas na circulação através do coração, que leva cerca de três meses para detectar o enxerto.

Figura 1. Esquema geral de transplante de peixes destinatário. Non-transgênicos são irradiados para suprimir a rejeição imunológica das células transplantadas. Três dias depois, é feita uma incisão no flanco do peixe e as células progenitoras do doador são injetadas no rim cabeça exposta. A incisão é fechada com uma sutura e peixes são colocados de volta ao sistema para a recuperação. Rins de peixes destinatário são dissecados em momentos mais tarde e analisadas para enxerto e atividade de células progenitoras.

Figura 2. Enxerto de células progenitoras após sete dias. Enxerto de células progenitoras renal é detectada no lado injetado do rim cabeça em sete dias pós-transplante, conforme determinado pela presença de grupos de células EGFP ⁺ renal epitelial (inset - visão ampliada).

Figura 3. Enxerto de células progenitoras após 18 dias Após 18 dias pós-transplante, detectamos uma média de 24 EGFP ⁺ doador-derivado néfrons (inserir - visão ampliada de cada EGFP ⁺ néfrons)..

Figura 4. Enxerto ea migração de células progenitoras após 59 dias. Continuamos a detectar o enxerto de células progenitoras tempo após o transplante, mesmo depois de 59 dias (cabeça de seta vermelha). Neste ponto, mais tarde, doador-derivado néfrons são detectados em locais longe do local da injeção (cabeças de seta branca), consistente com a migração de células progenitoras.

Discussion

Técnicas de transplante de células é crucial para estudos de regeneração e são o teste padrão ouro para medir a atividade das células-tronco. Aqui, relatamos um método de transplante de células diretamente no rim de peixe-zebra adulto para determinar a atividade das células-tronco e progenitoras. Este procedimento envolve fazer uma incisão através do músculo para expor o rim a cabeça, seguida pela injeção de células diretamente no rim. A incisão é fechada com uma sutura simples e os peixes têm operado uma taxa de sobrevivência 90-100%. Em nossos experimentos, enxertada células progenitoras renal são detectados em 80-100% dos peixes transplantado por sete dias pós-transplante. Uma limitação desta técnica é que a incisão é perto da aorta dorsal, que pode ser facilmente rompido pelo bisturi. No entanto, uma vez dominada, a taxa de sangramento pode ser reduzido a menos de um por cento. Nosso método pode ser adaptado para oferecer outros tipos de células (sangue, estromais, vasculares), bem como pequenas moléculas para o rim. O desenvolvimento desta técnica ajudará estudos antecedência regenerativa e permitir-tronco e células progenitoras potencial para ser avaliada in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Insulin syringe needle (28 gauge)	BD Biosciences	329461
Cell strainer (40 uM)	BD Biosciences	352340
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Hamilton syringe (26 gauge)	Sigma-Aldrich	20734
Ethilon suture (size 9-0)	Ethicon Inc.	2819G