Summary
फैलोपियन ट्यूब (एफटी) मूल के तरल डिम्बग्रंथि कार्सिनोमा (समाज) के लिए एक वैकल्पिक स्थल के रूप में उभर रहा है. इस प्रोटोकॉल के अलगाव के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन करता है और
Abstract
उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर संयुक्त राज्य अमेरिका में महिला कैंसर मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण है. अन्य महिलाओं विशिष्ट कैंसर के विपरीत, स्तन और गर्भाशय के कार्सिनोमा है, जहां मृत्यु दर में हाल के वर्षों में गिर गया है की तरह, डिम्बग्रंथि के कैंसर का इलाज दरों अपेक्षाकृत पिछले दो दशकों से अधिक 1 अपरिवर्तित बनी हुई है. यह बड़े पैमाने पर प्रारंभिक स्तर रोग जहाँ सर्जरी और कीमोथेरेपी सबसे 2 प्रभावी है, 3 का पता लगाने के के लिए उपयुक्त स्क्रीनिंग उपकरणों की कमी के कारण है. एक परिणाम के रूप में, सबसे अधिक रोगियों के उन्नत चरण रोग और फैलाना पेट भागीदारी के साथ प्रस्तुत करते हैं. यह आगे तथ्य यह है कि डिम्बग्रंथि के कैंसर के कई histologic उपप्रकारों 4, 5 के साथ एक विषम बीमारी है द्वारा जटिल है . तरल डिम्बग्रंथि कार्सिनोमा (समाज) सबसे आम है और आक्रामक subtype और सबसे अक्सर BRCA जीन में परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है. इस क्षेत्र में अभी प्रयोगात्मक मॉडल कैंसर कोशिका लाइनों और माउस मॉडल का उपयोग शामिल करने के लिए बेहतर शुरुआत आनुवंशिक घटनाओं और रोग 6, 7 के रोगजनन को समझने . हाल ही में, फैलोपियन ट्यूब समाज की उत्पत्ति के लिए एक उपन्यास साइट के रूप में उभरा है फैलोपियन (एफटी) मूल 8, 9 की प्रस्तावित सेल के रूप में ट्यूब स्रावी उपकला कोशिका (FTSEC ) के साथ. वहाँ वर्तमान में कर रहे हैं कोई सेल लाइनों या संस्कृति एफटी उपकला या FTSEC का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध है सिस्टम. यहाँ हम एक उपन्यास पूर्व vivo संस्कृति प्रणाली है जहां प्राथमिक मानव एफटी उपकला कोशिकाओं एक तरह से है कि उनकी वास्तुकला, polarity, immunophenotype, और शारीरिक और genotoxic तनाव के लिए प्रतिक्रिया को बरकरार रखता है में सुसंस्कृत हैं का वर्णन करता है. इस पूर्व vivo मॉडल समाज के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है, कैसे ट्यूमर इस ऊतक से पैदा कर सकते हैं की एक बेहतर समझ की अनुमति, और तंत्र ट्यूमर दीक्षा और प्रगति में शामिल है.
Protocol
1. कोलेजन तैयारी और फ़िल्टर कोटिंग.
- मानव placental कोलेजन तैयार करने के लिए, मानव अपरा कोलेजन के 30 मिलीग्राम tweeze और हलचल पट्टी के साथ एक 500 मिलीलीटर की बीकर में आसुत पानी की 50 मिलीलीटर (DH 2 हे) के शीर्ष पर डाल दिया.
- कोलेजन पर सीधे हिमनदों एसिटिक एसिड के 100 μls जोड़ें बनाने के लिए यह आसान भंग करने के लिए. 37 तक गर्म डिग्री सेल्सियस और यह हलचल कोलेजन भंग करने के लिए. यह 20-30 मिनट में भंग चाहिए. यदि कोलेजन किस्में समाधान में रहते हैं, फिल्टर नसबंदी मुश्किल हो जाएगा.
- DH 2 हे और एक 0.2 सुक्ष्ममापी झिल्ली के साथ फिल्टर बाँझ के 450 मिलीलीटर के साथ 50 मिलीलीटर शेयर पतला . यह अंतिम काम हल है. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस
- उन्हें कोलेजन (5-10 μl) रातोंरात के साथ कोटिंग के द्वारा Transwell फिल्टर झिल्ली तैयार करें. ठंडा कोलेजन आरटी के लिए गर्म होना चाहिए और फिर ऊपरी डिब्बे में जोड़ा झिल्ली रातोंरात और आरटी पर कवर. Transwell फिल्टर पर dissociated प्राथमिक फैलोपियन ट्यूब (एफटी) उपकला (नीचे देखें) चढ़ाना इससे पहले, फिल्टर 1X फॉस्फेट में तीन बार उपयोग करने से पहले अतिरिक्त कोलेजन हटायें खारा (पीबीएस) कम से कम 1 घंटे buffered धो लो.
2. ऊतक संग्रह और पृथक्करण.
- ताजा फैलोपियन ट्यूब (एफटी) fimbria एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में बाँझ 1X पीबीएस में एकत्र होना चाहिए और बर्फ पर पहले एक बाँझ ऊतक संस्कृति हुड में प्रसंस्करण शीघ्र रखा.
- ऊतक का नमूना 20 मिलीलीटर ठंडा 1X पीबीएस में एक बार धो (अगर मीडिया का एक और प्रकार में नमूना एकत्र किया है या खूनी कम से कम करने के लिए और संभव के रूप में ज्यादा रक्त विदेशी मीडिया के रूप में से छुटकारा पाने के रूप में इस चढ़ाना दक्षता के साथ हस्तक्षेप कर सकता है है 3X धो रहा है).
- एक थोड़ा पीबीएस और के साथ एक 10 सेमी टिशू कल्चर पकवान बाँझ चिमटी हस्तांतरण एफटी का प्रयोग, एक बाँझ स्केलपेल और बाँझ चिमटी का उपयोग कर, longitudinally कटौती उपकला कोशिकाओं के एक्सपोज़र. ऊपर fimbria खोलें इतना है कि यह अब एक ट्यूब, लेकिन ऊतक के लगभग एक फ्लैट शीट है. फिर छोटे लेकिन अभी भी बहाली करने योग्य टुकड़े (व्यास में 3 मिमी के बारे में) में कटौती.
- ठंडा हदबंदी मीडिया के एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 45 मिलीलीटर (सदस्य Pronase 1.4 मिलीग्राम / एमएल और 0.1 मिलीग्राम / मिलीलीटर DNase युक्त) टुकड़े स्थानांतरण.
- 4 ° 24 से 72 घंटे के लिए सी में धीरे रॉक. (अनुभव से, 48 घंटे इष्टतम है). हदबंदी की राशि की जांच करने के लिए, किसी स्लाइड पर पृथक्करण मीडिया की एक बूंद डाल दिया है और clumping और ऊतकों व्यवहार्यता (रोमक कोशिकाओं पिटाई) की राशि की जांच. तुम दोनों एकल कक्षों और कुछ छोटे clumps देखना चाहते हैं.
3. फैलोपियन ट्यूब चढ़ाना.
- जब उपकला कोशिका पृथक्करण की राशि इष्टतम है, FBS के 10% की मात्रा को जोड़कर मीडिया निष्क्रिय. उलटें एक बार कुछ छोटे समुच्चय में सेल निलंबन बेदखल.
- बड़े ऊतक clumps (stromal ऊतक) को व्यवस्थित करने के लिए नीचे में ट्यूब की अनुमति दें. एक दूसरे 50 मिलीलीटर ट्यूब में उपकला कोशिकाओं से युक्त मीडिया निकालें.
- मूल 50 मिलीलीटर ट्यूब ठंड सदस्य के 50 मिलीलीटर (कोई FBS) जोड़ें. अतिरिक्त कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए उलटें. एक तिहाई 50 मिलीलीटर ट्यूब (अगर नमूना बहुत बड़ी है और कोशिकाओं के एक उच्च संख्या की उम्मीद है, इस कदम सेल संग्रह को अधिकतम करने के लिए दोहराया जा सकता है है) में मीडिया ले लीजिए. stromal / कोशिकी ऊतक के बड़े टुकड़े अब खारिज किया जा सकता है. अब आप दो सेल निलंबन के 50 मिलीलीटर ट्यूबों है. सेल छर्रों से 5 मिनट और aspirate पृथक्करण मीडिया के लिए 1000 rpm पर अपकेंद्रित्र.
- USG मीडिया (DMEM: F12 USG 2% और 1% पेन Strep के साथ पूरक) के बारे में 5-10 मिलीलीटर में Resuspend 37 सी. सेंटीग्रेड के लिए गर्म धीरे पिपेट. बहुत सख्ती नहीं विंदुक के रूप में इस उपकला कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा और संस्कृतियों की गुणवत्ता को कम कर सकते हैं सावधान रहो. एकल कक्षों और छोटे clumps (चित्रा 1) होना चाहिए.
- Primaria संस्कृति व्यंजन और सेते पर 1 घंटे या 3 घंटे की एक न्यूनतम के लिए स्थानांतरण. Fibroblasts और लाल रक्त कोशिकाओं को प्लास्टिक की छड़ी लेकिन एफटी उपकला कोशिकाओं नहीं होगा. एक घंटे देखने के लिए अगर कुछ चिपके हुए है बाद थाली पर एक नज़र रखना. रोमक कोशिकाओं की उपस्थिति cilia की धड़कन टिप्पण द्वारा देखा जा सकता है.
- इस ऊष्मायन के दौरान, कोलेजन लेपित फिल्टर और धोया जा सकता है सेल चढ़ाना के लिए तैयार किया (1.4 कदम देखें)
- Primaria प्लेटों पर ऊष्मायन के 1-3 घंटे के बाद, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब सेल निलंबन हस्तांतरण और 5 मिलीलीटर USG मीडिया के साथ Primaria थाली कुल्ला, ट्यूब के लिए इस मीडिया को हस्तांतरण करने के लिए 15 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा. 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर अपकेंद्रित्र.
- ध्यान मीडिया aspirate और सेल गोली में खलल न डालें से बचें. गोली आकार को देखते हुए, USG मीडिया का उचित मात्रा में resuspend. (आमतौर पर 1-3 मिलीलीटर के बीच) कम शुरुआत में बेहतर है, ताकि आप आगे पतला अगर आप की जरूरत सकता है. धीरे Resuspend.
- एक hemacytometer resuspended कोशिकाओं के 10 μl जोड़ें और सेल घनत्व निर्धारण. सुझाव: आप उपकला कोशिकाओं है कि एक साफ़ अंधेरे कोशिका झिल्ली और गैर - स्तंभ हैं के लिए देख रहे हैं. तुम भी रोमक कोशिकाओं है कि निश्चित रूप से आगे बढ़ रहे हैं भरोसा कर सकते हैं. छोटे कोशिकाओं है कि है एक प्रभामंडल appearanCE के लाल रक्त कोशिकाओं रहे हैं और नहीं गिना जाना चाहिए. कुछ clumping को हो सकता है, तो आप कि आप कोशिका गिनती में अनुमान की जरूरत है. बोने लक्ष्य 1.65 x10 5 कोशिकाओं / झिल्ली, या कम से कम 75% फिल्टर कवरेज (चित्रा 1) है. यदि कोशिकाओं को बहुत कम चढ़ाया जाता है, कोशिकाओं एक पूरी उपकला परत के रूप में करने में सक्षम नहीं होगा.
- एक 24 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह के नीचे करने के लिए USG मीडिया के 500 μl जोड़ें और Transwell सम्मिलित. एफटी सेल निलंबन (ऊपर देखें) के लिए आवश्यक मात्रा तो प्रत्येक झिल्ली पर जोड़ा जा सकता है है, यह आम तौर पर 100 μl है.
- सेते हैं और झिल्ली के परेशान शीर्ष बिना 1-2 दिनों के लिए विकसित. आप उन दिनों के दौरान बेसल तरफ मीडिया में परिवर्तन यदि आवश्यक हो सकता है. 1-2 दिनों के बाद, आप ध्यान से USG मीडिया के साथ शीर्ष कुल्ला और झिल्ली के शीर्ष पर मीडिया की एक छोटी राशि (5-10 μl) जोड़ सकते हैं. यह आसान है सेल संस्कृतियों के संगम का निर्धारण करने के लिए अगर मीडिया माइक्रोस्कोपी से पहले फिल्टर के शिखर की ओर से निकाल दिया जाता है. कम डिब्बे हमेशा मीडिया को शामिल करना चाहिए. एक बार पूरी तरह से संस्कृतियों मिला हुआ (5 दिनों के भीतर सामान्य), मीडिया की राशि है कि शिखर पक्षों बेसल से फिल्टर के माध्यम से यात्रा नगण्य होना चाहिए.
- पहले 10 दिनों के लिए एक बार हर दो दिनों के बेसल मीडिया बदलें. कम डिब्बे हमेशा कोशिकाओं को जीवित रखने के लिए मीडिया है चाहिए. एक बार कोशिकाओं के एक तंग उपकला परत वे (यदि) immunofluorescence या immunohistochemistry (आईएचसी) के रूप में आगे के अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है (आंकड़े 1 और 2) का गठन किया है.
4. झिल्ली प्रसंस्करण.
- झिल्ली प्रसंस्करण अध्ययन के प्रकार है कि प्रदर्शन किया जाएगा पर निर्भर है, लेकिन आम तौर पर फिल्टर के Transwell आवेषण से हटाने शामिल है.
- फिल्टर आम तौर पर हटाने से पहले 200 1X पीबीएस के μl में 3 बार धोया.
- फिल्टर के शिखर और बेसल ओर से पीबीएस Aspirate. यह 1 किया जाना चाहिए अच्छी तरह से एक समय में बाहर सुखाने से झिल्ली को रोकने के.
- थाली से डालने के निकालें, यह फ्लिप उल्टा और एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करने के लिए झिल्ली के आसपास कटौती. झिल्ली किनारे के आसपास किनारे के आसपास स्केलपेल खींचने के बजाय सीधे कटौती, बनाने के द्वारा एक टुकड़ा में झिल्ली को दूर करने की कोशिश करो.
- चिमटी का प्रयोग डालने से फ़िल्टर निकालने के लिए, ट्रैक पक्ष जो कोशिकाओं पर कर रहे हैं रखते हुए. फिल्टर तो अगर, आईएचसी, आदि के लिए उचित रूप में संसाधित किया जा सकता है.
- उदाहरण के लिए, फिल्टर (निर्धारण, permeabilization, अवरुद्ध और उचित एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन के बाद, प्रक्रियाओं यदि मानक के अनुसार) यदि अध्ययन एक स्लाइड पर रखा होना चाहिए, उत्तर प्रदेश का सामना करना पड़ रहा है, DAPI साथ Vectashield कोशिकाओं फिल्टर पर गिरा दिया है और एक साथ कवर कांच coverslip.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
transwell फिल्टर दोनों immunohistochemistry (आईएचसी) और immunofluorescence (यदि) द्वारा पूर्व vivo उपकला जांच के लिए आसानी से हटाया जा सकता है. विशिष्ट मार्करों वंश का उपयोग करना, एक छवि और (सकारात्मक Pax8) स्रावी और रोमक (Sall2 सकारात्मक) इन संस्कृतियों में सेल डिब्बों (चित्रा 3) यों कर सकते हैं. इसके अलावा, इन मार्करों का उपयोग, एक की निगरानी कर सकते हैं कैसे प्रत्येक कोशिका प्रकार विभिन्न शारीरिक 10 cues का जवाब . इस प्रणाली के विभिन्न stimuli करने के लिए जवाब में एफटी उपकला के secretome और intracellular phosphoproteome में परिवर्तन विशेषताएँ इस्तेमाल किया गया है.
चित्रा 1. चित्रण चित्रण कैसे पूर्व vivo संस्कृतियों प्राथमिक मानव फैलोपियन ट्यूब के ऊतकों से उत्पन्न कर रहे हैं फैलोपियन ट्यूब fimbrial ऊतक शल्य सूट से प्राप्त की है और छोटे टुकड़े एक कि धोया और 24-72 दो घंटे के लिए हदबंदी मीडिया के साथ incubated उत्पन्न करने के लिए कीमा बनाया हुआ.. बाद हदबंदी पूरा हो गया है, ऊतक टुकड़े ऊष्मायन ट्यूब के नीचे और अलग उपकला कोशिकाओं से युक्त मीडिया व्यवस्थित है 3 काटा करने के लिए अनुमति दी जाती है. हदबंदी की दक्षता चरण विपरीत एक खुर्दबीन 4 के तहत परीक्षा द्वारा नजर रखी जा सकता है. dissociated उपकला कोशिकाओं तो Primaria प्लेटों पर सुसंस्कृत fibroblast और hematopoietic कोशिकाओं है कि हमेशा उपकला कोशिकाओं के साथ 5 admixed निकालने में मदद करने के लिए. एक बार गैर उपकला कोशिकाओं को पर्याप्त रूप से हटा रहे हैं, उपकला कोशिकाओं transwell फिल्टर है कि मानव अपरा कोलेजन 5 के साथ लेपित हैं पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं. मीडिया के प्रसार के नीचे से transwell के माध्यम से प्रदान की जाती है. संस्कृतियों 24-48 घंटे के लिए incubated रहे हैं और तब शिखर मीडिया हटा दिया जाता है. पूर्व vivo संस्कृतियों तो 5-8 दिनों के लिए विकसित करने के लिए transwell फिल्टर पर एक पूर्ण, पूरा लॉन के रूप में अनुमति दी जाती है. पूर्व vivo संस्कृतियों इस राज्य में viably बनाए रखा जा करने के लिए 4 सप्ताह के लिए कर सकते हैं. 5 कार्टून डालने और hemato साथ दाग से हटा फिल्टर का एक उदाहरण के साथ पूर्ण विकसित पूर्व vivo संस्कृति का प्रतिनिधित्व दिखाता हैxylin और eosin (एच एंड ई) और पूर्व vivo उपकला के polarity वास्तुकला प्रदर्शित करने के लिए.
चित्रा 2. एफटी पूर्व vivo संस्कृतियों के उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी Transwell सम्मिलित करता है. मानव अपरा कोलेजन 0.4μm pores के साथ लेपित हैं दिखाई (क) कर रहे हैं . एफटी उपकला कोशिकाओं पर कोलेजन लेपित (ख) आवेषण, जहां वे एक उपकला परत (ग) के रूप में सुसंस्कृत हैं. कुछ मलबे सामान्य उपकला संस्कृति में कोशिकाओं का पालन (तीर द्वारा इंगित), रोमक कोशिकाओं को सबसे अधिक बार मनाया जाता है.
चित्रा 3. एफटी पूर्व vivo संस्कृति immunofluorescence (यदि) के उदाहरण. यदि तय पूर्व vivo संस्कृतियों की छवियों और (क) स्रावी (Pax8) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग और (घ) रोमक सेल (Sall2) मार्करों . DAPI सेल नाभिक का स्थान (नीला) (ख और ई) और मर्ज किए गए एंटीबॉडी और DAPI धुंधला हो जाना भी दिखाया गया है (ग और च) के लिए एक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है. कोशिकाओं की संख्या समय कोशिकाओं संस्कृति में हैं (, Sall2 धुंधला हो जाना, 3 दिन Pax8 धुंधला हो जाना, 7 दिनों) की लंबाई पर निर्भर करता है.
Discussion
समाज के लिए मूल के एक उम्मीदवार की साइट के रूप में एफटी की पहचान ज्ञात जोखिम कारकों और वास्तविक तरल कासीनजन प्रक्रिया को जोड़ने तंत्र का गूढ़ रहस्य के उद्देश्य से बुनियादी और translational अनुसंधान के लिए अवसर प्रदान करता है. इस के लिए क्रिटिकल विनयशील मॉडल प्रणाली के विकास कि हमें परिकल्पना है कि FTSEC श्रोणि तरल कार्सिनोमा के लिए एक सेल के मूल है परीक्षण शुरू करने के लिए सक्षम हो जाएगा है. पूर्व vivo संस्कृति मॉडल के साथ साथ वर्णित एक उपन्यास प्रणाली है कि एक तरह से है कि आकारिकी और देशी एफटी उपकला के जीव विज्ञान को बरकरार रखता है और प्राथमिक एफटी स्रावी और रोमक कोशिकाओं के सह संस्कृति अलगाव परमिट है. इस प्रणाली का उपयोग करना, हम हाल ही में इस उपकला के secretome विशेषता और उपकला यांत्रिक और genotoxic 10 चोट करने के लिए कैसे प्रतिक्रिया. Ovulation, डिम्बग्रंथि tumorigenesis के साथ जुड़े एक प्रमुख जोखिम कारक, ऊतक चोट, सूजन मध्यस्थों, वृद्धि कारक, और 11 हार्मोन का एक संयोजन द्वारा विशेषता है . इस प्रणाली और स्रावी और रोमक कोशिकाओं की प्रतिक्रिया और व्यवहार्यता पर एक ovulatory परिवेश के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, अन्य प्रकार की कोशिकाओं (यानी भड़काऊ कोशिकाओं) के प्रभाव के लिए घटनाओं का एक बेहतर समझ की अनुमति देने के लिए जांच की जा सकता है कि ड्राइव सेल प्रकार भेदभाव और कारक है कि इन कोशिकाओं के neoplastic परिवर्तन के लिए योगदान. इसी तरह के मॉडल के अन्य ऊतकों में वर्णित किया गया है जहां polarized उपकला मौजूद है. उदाहरण के लिए, airway उपकला polarized प्राथमिक संस्कृतियों में सेल के विकास और सेलुलर चोट के जवाब पर heregulin के प्रभाव 12 मूल्यांकन किया गया था. मॉडल प्रणाली के इन प्रकार दीक्षा और ट्यूमर है जो उपकला ऊतकों से उत्पन्न के रोगजनन के अध्ययन के लिए एक नए और उपयोगी तरीका प्रदान करते हैं, और इस एफटी जहां कोई सेल लाइनों वर्तमान में मौजूद हैं जैसे ऊतकों में महत्वपूर्ण महत्व का है, और जहाँ वहाँ एक महान है कुंजी रास्ते की पहचान और उपन्यास उपचार कार्यनीतियों के विकास के लिए की जरूरत है.
Disclosures
डा. Drapkin नोवार्टिस दवा के लिए एक सलाहकार है. कोई अन्य लेखकों ब्याज की किसी भी संभावित संघर्ष की घोषणा.
Acknowledgments
हम संकाय, साथियों, निवासियों, और ब्रिघम और महिला अस्पताल के चिकित्सक सहायकों, पैथोलॉजी विभाग ऊतक इन अध्ययनों के लिए उपलब्ध बनाने के लिए धन्यवाद. यह काम NIH / राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (CA105009 P50, CA108748 K08, CA152990 U01), डिम्बग्रंथि के कैंसर रिसर्च फंड से अनुदान अनुसंधान द्वारा समर्थित किया गया Kay फाउंडेशन, नोवार्टिस फार्मास्यूटिकल्स, रॉबर्ट और Deborah पहले फंड, Randi और योएल कटलर डिम्बग्रंथि के कैंसर मई रिसर्च फंड, मार्शा Rivkin फाउंडेशन - वैज्ञानिक विद्वान पुरस्कार, AACR - जॉर्ज और कैंसर आनुवंशिकी अनुसंधान के लिए पेट्रीसिया Sehl फैलोशिप, और इस्राएल में चिकित्सा के लिए अमेरिकी चिकित्सकों फैलोशिप क्लेयर और Emmanuel जी Rosenblatt फाउंडेशन अनुदान.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV) | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| DMEM:F12 media | Cellgro | 15-090-CV | |
| Ultroser G | Crescent Chemical Company | 67042 | Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration) |
| Pen Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| BD Primaria culture plates | BD Biosciences | 353802 | |
| 24 well Transwell Permeable supports | Corning | 3470 | Clear, 6.5 mm insert, 0.4 μm pore size, treated polyester |
| MEM (Minimal Essential Media) | Cellgro | 10-010-CV | |
| Pronase | Roche Group | 11459643001 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Sall2 antibody | Harvard - T. Benjamin Lab | Gift | 1:20 dilution |
| Pax8 antibody | Proteintech | 10336-1-AP | 1: 1000 dilution |
References
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