Summary
Äggledaren (FT) växer fram som en alternativ plats ursprungsbeteckningar för serös ovarialcancer (SOC). Detta protokoll beskriver en ny metod för isolering och
Abstract
Epitelial äggstockscancer är en ledande orsak till kvinnliga dödlighet i cancer i USA. I motsats till andra kvinnor, vissa cancerformer, som bröst-och livmodercancer cancer, där dödstalen har sjunkit de senaste åren har äggstockscancer botade varit relativt oförändrad under de senaste två decennierna 1. Detta beror till stor del av bristen på lämpliga analysverktyg för att upptäcka tidigt stadium sjukdom där kirurgi och kemoterapi är mest effektiva 2, 3. Som ett resultat av de flesta patienter närvarande med långt framskriden sjukdom och diffusa buken engagemang. Detta kompliceras ytterligare av det faktum att äggstockscancer är en heterogen sjukdom med flera histologisk subtyp 4, 5. Serös ovarialcancer (SOC) är den vanligaste och mest aggressiva subtyp och den form som oftast förknippas med mutationer i BRCA generna. Aktuella experimentella modeller inom detta område omfattar användning av cancercellinjer och modeller musen för att bättre förstå den initierande genetiska händelser och patogenes av sjukdomar 6, 7. Nyligen har äggledaren framträtt som en ny plats för ursprung SOC, med äggledaren (FT) sekretoriska epitelceller (FTSEC) som den föreslagna cellen ursprung 8, 9. Det finns för närvarande inga cellinjer eller system kulturen tillgänglig för att studera FT epitel eller FTSEC. Här beskriver vi ett nytt ex-system vivo kultur där grundläggande mänskliga FT epitelceller odlas på ett sätt som bevarar deras arkitektur, polaritet, immunofenotyp, och svar på fysiologiska och genotoxiskt stressfaktorer. Detta ex vivo modell ger ett användbart verktyg för studier av SOC, så att en bättre förståelse för hur tumörer kan uppstå från denna vävnad, och de mekanismer som är inblandade i tumör initiering och progression.
Protocol
1. Kollagen Beredning och filter Coating.
- För att förbereda mänskliga moderkakan kollagen, pincettliknande ut 30 mg av mänskliga moderkakan kollagen och sätta på toppen av 50 ml destillerat vatten (dH 2 O) i en 500 ml bägare med omrörare.
- Tillsätt 100 μls isättika direkt på kollagen för att göra det lättare att lösa. Värmas upp till 37 ° C och rör om att upplösa kollagen. Det bör lösas upp i 20-30 minuter. Om kollagen trådar kvar i lösning, kommer att filtrera sterilisering vara svårt.
- Späd 50 ml av med 450 ml dH 2 O och filter-sterilisera med 0,2 ìm membran. Detta är den sista fungerande lösning. Förvaras vid 4 ° C.
- Förbered Transwell filtret membran genom att täcka dem med kollagen (50-100 l) över natten. Kyld kollagen skall värmas till RT och läggs sedan till det övre facket för att täcka membranet över natten och vid RT. Innan plätering av dissocierade primära äggledaren (FT) epitel (se nedan) på Transwell filter, tvätta filter tre gånger i 1X fosfatbuffrad saltlösning (PBS) minst 1 timme före användning för att avlägsna överskott kollagen.
2. Tissue Insamling och dissociation.
- Färska äggledaren (FT) bör fimbria samlas i sterila 1X PBS i ett 50 ml centrifugrör och förvaras på is före snabb bearbetning i en steril vävnadsodling huva.
- Tvätta vävnadsprovet gång i 20 ml kylt 1X PBS (om provet har tagits i en annan typ av media eller är blodig tvätta minst 3X att bli av med så mycket blod och utländska medier som möjligt eftersom det kan störa plätering effektivitet).
- Använda steril pincett överföra FT till en 10 cm vävnadsodling maträtt med lite PBS och, med en steril skalpell och steril pincett, skära längsgående att maximera exponeringen av epitelceller. Öppna upp fimbria så att det inte längre är ett rör, men en nästan platt ark vävnad. Skärs sedan i mindre men fortfarande hämtas bitar (ca 3 mm i diameter).
- Överföring bitar för 45 ml av kylda dissociation medier (MEM innehåller 1,4 mg / ml Pronase och 0,1 mg / ml DNAse) i en 50 ml tub.
- Rock försiktigt vid 4 ° C i 24 till 72 timmar. (Av erfarenhet, är 48 timmar optimalt). För att kontrollera mängden dissociation, lägg en droppe dissociation media på en bild och kontrollera mängden bildning och vävnad bärkraft (slå cilierade celler). Du vill se både enskilda celler och några små klumpar.
3. Äggledare Plating.
- När mängden epitelceller dissociation är optimal, inaktivera medierna genom att tillsätta 10% volym FBS. Invertera ett par gånger för att lösgöra cellsuspension i mindre aggregat.
- Låt stora vävnad klumpar (stromaceller vävnad) att bosätta sig i botten på röret. Ta bort media som innehåller epitelceller i en andra 50 ml rör.
- Tillsätt 50 ml kall MEM (ingen FBS) till den ursprungliga 50 ml tub. Invertera att samla in ytterligare celler. Samla material till en tredje 50 ml rör (om provet är mycket stor och ett stort antal celler förväntas, kan detta steg upprepas för att maximera cell insamling). Den stora bitar av stromaceller / extracellulär vävnad kan nu kastas. Du har nu två 50 ml rör cellsuspension. Centrifugera vid 1000 rpm i 5 minuter och aspirera avståndstagande media från cell pellets.
- Resuspendera i ca 5-10 ml USG media (DMEM: F12 kompletteras med 2% USG och 1% Pen Strep) värmts till 37 ° C. Pipettera försiktigt. Var noga med att inte pipett alltför kraftigt eftersom det kan skada epitelceller och försämra kvaliteten på kulturer. Det bör finnas enskilda celler och små klumpar (Figur 1).
- Överlåtelse på primaria kultur rätter och inkubera i minst 1 timme eller upp till 3 timmar. Fibroblaster och röda blodkroppar fastnar på plast men FT epitelcellerna kommer inte. Ta en titt på plattan efter en timme för att se om något sticker. Förekomsten av cilierade celler kan ses genom att notera att slå av flimmerhår.
- Under denna inkubation kan kollagen belagda filter tvättas och göras klar för cell plätering (Se steg 1,4)
- Efter 1-3 timmars inkubering på primaria tallrikar, överföra cellsuspension till en 15 ml tub och skölj primaria plattan med 5 ml USG medier, överföra media till röret för att göra en slutlig volym på 15 ml. Centrifugera vid 1000 rpm i 5 minuter.
- Försiktigt aspirera media och undvika störningar i cellpelleten. Att döma av pellets storlek, resuspendera i lämplig mängd USG medier. (Vanligtvis mellan 1-3 ml) Mindre är bättre i början så att du kan späda ut mer om du behöver. Resuspendera försiktigt.
- Tillsätt 10 l av den suspenderade celler till en hemacytometer och bestämma celltäthet. Tips: Du söker epitelceller som har en distinkt mörk cellmembranet och är icke-kolumner. Du kan också räkna cilierade celler som definitivt är på väg. Mindre celler som har en gloria appearance är röda blodkroppar och bör inte räknas. Det kommer att finnas några klumpar, så du måste uppskattar att i dig celltal. Det seeding Målet är 1,65 x10 5 celler / membran, eller minst 75% filtret täckning (Figur 1). Om cellerna är pläterade alltför glest, kommer cellerna inte att kunna bilda en komplett epiteliala lager.
- Tillsätt 500 ìl av USG media till botten av brunnen av en 24 brunnar och sätt Transwell. Erforderlig volym FT cellsuspension (se ovan) sedan kan läggas på varje membran, detta är typiskt 100 l.
- Inkubera och växa i 1-2 dagar utan att störa toppen av membranet. Du kan ändra media på den basala sida under dessa dagar om det behövs. Efter 1-2 dagar kan du skölja noga toppen med USG media och lägga en liten mängd (50-100 l) av media ovanpå membranet. Det är lättare att bestämma sammanflödet av cellkulturer om media tas bort från apikala sidan av filter innan mikroskopi. Den lägre facket ska alltid innehålla medier. När kulturer är helt konfluenta (normalt inom 5 dagar), bör beloppet av media som färdas upp genom filter från basala till apikala sidor vara försumbar.
- Byt basala media gång varannan dag under de första 10 dagarna. Den nedre facket måste alltid ha media för att hålla cellerna vid liv. När cellerna har bildat en tät epitelceller skikt (figur 1 och 2) de kan användas i vidare studier, till exempel immunofluorescens (IF) eller immunohistokemi (IHC).
4. Membran Processing.
- Membran behandlingen är beroende på vilken typ av studie som ska utföras, men vanligtvis innebär avlägsnande av filtret från Transwell skär.
- Filtren är oftast tvättas tre gånger i 200 l 1X PBS innan de tas bort.
- Aspirera PBS från apikala och basala sidan av filter. Detta bör ske en väl åt gången för att hindra membranen från att torka ut.
- Ta bort insatsen från plattan, vänder upp och ner och använda en steril skalpell för att skära runt membranet. Försök att ta bort membran i ett stycke genom att göra raka snitt runt membranet kanten, istället för att dra skalpell runt kanten.
- Använd pincett för att ta bort filtret från insatsen, hålla reda på vilken sida cellerna är på. Filtret kan sedan bearbetas för IF, IHC, etc. som är lämpligt.
- Exempel: för IF studier, bör filtret (efter fixering, permeabilization, blockering och inkubation med lämpliga antikroppar, enligt standard IF förfaranden) placeras på en bild, är celler uppåt, Vectashield med DAPI föll på filtret och täckt med en glas täckglas.
5. Representativa resultat:
Den transwell filter lätt kan avlägsnas för att undersöka ex vivo epitel av både immunohistokemi (IHC) och immunofluorescens (IF). Använda härstamning specifika markörer, kan en bild och kvantifiera de sekretoriska (Pax8 positiv) och cilierade (Sall2 positiv) cell fack i dessa kulturer (Figur 3). Dessutom använder dessa markörer kan man följa hur varje celltyp svarar på olika fysiologiska signaler 10. Detta system har använts för att karakterisera förändringar i secretome och intracellulär phosphoproteome av FT epitel som svar på olika stimuli.
Figur 1. Illustration som visar hur ex vivo kulturer genereras från primär mänskliga äggledaren vävnad. Äggledaren fimbrial vävnad från det kirurgiska sviten och malet att generera små fragment 1 som tvättas och inkuberas med dissociation media för 24-72 timmar 2. När dissociation är klar är den vävnad fragment tillåtas sjunka till botten av inkubationstiden röret och media som innehåller dissocierade epitelceller skördas 3. Effektiviteten i dissociation kan kontrolleras genom undersökning i faskontrastmikroskop 4. Det dissocierade epitelceller sedan odlas på primaria plattor för att ta bort fibroblast och hematopoetiska celler som alltid uppblandade med de epitelceller 5. När icke-epitelceller är tillräckligt bort, epitelceller seedade på transwell filter som är belagda med humant placenta kollagen 5. Medierna ges genom diffusion genom transwell underifrån. Kulturerna inkuberas i 24-48 timmar och sedan apikala media tas bort. Den ex vivo kulturerna får sedan växa i 5-8 dagar för att bilda ett helt, komplett gräsmatta på transwell filter. Den ex vivo kulturer kan upprätthållas klara sig i detta tillstånd i upp till 4 veckor. Serien 5 visar en representation av fullvuxna ex vivo kultur med ett exempel på ett filter bort från insatsen och färgas med Hematoxylin och eosin (H & E) för att visa polaritet och arkitektur ex vivo epitelet.
Figur 2. Bright inom mikroskopi av FT ex vivo kulturer. Beläggs med mänskliga moderkakan porer kollagen 0.4μm Transwell skären är synliga (en). FT epitelceller odlas på kollagen belagda skär (b), där de bildar en epiteliala lager (c). En del skräp är normalt observeras ansluter sig till celler i epiteliala kulturen (indikeras med pilar), oftast till cilierade celler.
Figur 3. FT ex vivo kultur immunofluorescens (IF). Exempel på IF bilder av ex vivo kulturer fast och färgat med antikroppar mot (a) sekretoriska (Pax8) och (d) cilierade cell (Sall2) markörer. DAPI används som kontroll för lokalisering av cellkärnor (blå) (b och e) och slås samman antikropp och DAPI färgning visas också (C och F). Antalet celler beror på den tid som celler i kultur (Pax8 färgning, 7 dagar, Sall2 färgning, 3 dagar).
Discussion
Identifiering av FT som kandidat sajt ursprungsreglerna för SOC ger möjlighet till grund-och translationell forskning som syftar till att dechiffrera de mekanismer som förbinder kända riskfaktorer och den faktiska serösa cancerframkallande processen. Kritiskt för detta är att utveckla tractable modellsystem som gör det möjligt för oss att börja testa hypotesen att FTSEC är en cell om ursprungsland för bäcken serös karcinom. Den ex vivo kultur-modellen som beskrivs här är en roman system som tillåter isolering och co-kultur av primär FT sekretoriska och cilierade celler på ett sätt som bevarar morfologi och biologi infödda FT epitel. Med hjälp av detta system, som kännetecknas vi nyligen secretome detta epitel och hur epitelet svarar på mekaniska och genotoxiska skador 10. Ägglossning, en stor riskfaktor i samband med äggstockarna Tumörgenesens, kännetecknas av en kombination av vävnadsskada, inflammatoriska mediatorer, tillväxtfaktorer och hormoner 11. Detta system kan användas för att studera effekten av en ägglossningsproblem miljö på gensvaret och livskraft sekretoriska och cilierade celler. Dessutom kan effekten av andra celltyper (t.ex. inflammatoriska celler) undersökas för att möjliggöra en bättre förståelse av de händelser som driver celltyp differentiering och de faktorer som bidrar till neoplastiska omvandlingen av dessa celler. Liknande modeller har beskrivits i andra vävnader där polariserat epitel är närvarande. Till exempel i polariserade primära kulturer av slemhinnan, var effekten av heregulin på celltillväxt och svar på cellulär skadan 12. Dessa typer av modellsystem ger ett nytt och användbart sätt att studera initiering och patogenes av tumörer som uppstår epiteliala vävnader, och detta är av avgörande betydelse i vävnader som FT där inga cellinjer finns för närvarande, och där det finns en stor Behovet av identifieringen av viktiga vägar och utveckling av nya behandlingsstrategier.
Disclosures
Dr Drapkin är konsult till Novartis Pharmaceuticals. Ingen annan författare redovisa eventuella intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar fakulteten, kamrater, boende, och assistenter läkare av Brigham and Women sjukhus, avdelningen för patologi för att vävnad som finns för dessa studier. Detta arbete stöddes av forskningsanslag från NIH / National Cancer Institute (P50 CA105009, K08 CA108748, U01 CA152990), äggstockscancer Research Fund, i maj Kay Foundation, Novartis Pharmaceuticals, Robert och Deborah första fond, Randi och Joel Cutler äggstockscancer Research Fund, Marsha Rivkin Foundation - Vetenskaplig Scholar Award, AACR - George och Patricia Sehl Fellowship för cancerforskning genetisk forskning, och det amerikanska läkare Fellowship för medicin i Israel - Claire och Emmanuel G. Rosenblatt Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV) | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| DMEM:F12 media | Cellgro | 15-090-CV | |
| Ultroser G | Crescent Chemical Company | 67042 | Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration) |
| Pen Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| BD Primaria culture plates | BD Biosciences | 353802 | |
| 24 well Transwell Permeable supports | Corning | 3470 | Clear, 6.5 mm insert, 0.4 μm pore size, treated polyester |
| MEM (Minimal Essential Media) | Cellgro | 10-010-CV | |
| Pronase | Roche Group | 11459643001 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Sall2 antibody | Harvard - T. Benjamin Lab | Gift | 1:20 dilution |
| Pax8 antibody | Proteintech | 10336-1-AP | 1: 1000 dilution |
References
- Jemal, A., Siegel, R., Xu, J., Ward, E.
- Markman, M., Walker, J. L. Intraperitoneal chemotherapy of ovarian cancer: a review, with a focus on practical aspects of treatment. J. Clin. Oncol. 24, 988-994 (2006).
- Liu, J., Matulonis, U. A.
- Cannistra, S. A.
- Kurman, R. J., Shih, I. M. The origin and pathogenesis of epithelial ovarian cancer: a proposed unifying theory. Am. J. Surg. Pathol. 34, 433-443 (2010).
- Fong, M. Y., Kakar, S. S. Ovarian cancer mouse models: a summary of current models and their limitations. J Ovarian Res. 2, 12-12 (2009).
- Shan, W., Liu, J. Epithelial ovarian cancer: focus on genetics and animal models. Cell Cycle. 8, 731-735 (2009).
- Levanon, K., Crum, C. P., Drapkin, R. New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact. J. Clin. Oncol. 26, 5284-5293 (2008).
- Karst, A. M., Drapkin, R. Ovarian cancer pathogenesis: a model in evolution. J Oncol. 2010, 932371-932371 (2010).
- Levanon, K., Ng, V., Piao, H. Y., Zhang, Y., Chang, M. C., Roh, M. H., Kindelberger, D. W., Hirsch, M. S., Crum, C. P., Marto, J. A., Drapkin, R. Primary ex vivo cultures of human fallopian tube epithelium as a model for serous ovarian carcinogenesis. Oncogene. 25, 1103-1113 (2010).
- Landen, C. N. Jr, Birrer, M. J., Sood, A. K. Early events in the pathogenesis of epithelial ovarian cancer. J. Clin. Oncol. 26, 995-1005 (2008).
- Vermeer, P. D., Einwalter, L. A., Moninger, T. O., Rokhlina, T., Kern, J. A., Zabner, J., Welsh, M. J. Segregation of receptor and ligand regulates activation of epithelial growth factor receptor. Nature. 422, 322-326 (2003).
