Summary
ऑप्टिकल संकल्प photoacoustic माइक्रोस्कोपी (या PAM) एक उभरती इमेजिंग ऑप्टिकल अवशोषण के लिए सक्षम प्रौद्योगिकी विरोधाभासों
Protocol
1. सिस्टम कॉन्फ़िगरेशन
- ऑप्टिकल विकिरण
- ऑप्टिकल विकिरण स्रोत: एक डायोड पंप ठोस राज्य (INNOSLAB, Edgewave) स्पंदित लेजर और डाई लेजर (सीबीआर - डी, Sirah).
- उत्पादन लेजर बीम (पल्स चौड़ाई: एनएस 7) एक संघनित्र (LA1131, Thorlabs) लेंस एक pinhole 50-सुक्ष्ममापी (P50C, Thorlabs) के माध्यम से पारित द्वारा ध्यान केंद्रित है.
- pinhole कंडेनसर लेंस के ध्यान से थोड़ा दूर तैनात है मौलिक मोड प्रभावी स्थानिक फ़िल्टरिंग के लिए बीम व्यास के साथ pinhole व्यास मैच.
- फ़िल्टर बीम एक तटस्थ घनत्व (एनडीसी-50C-2M, Thorlabs) फिल्टर और फिर एक एकल मोड ऑप्टिकल फाइबर (P1-460A-FC-2, Thorlabs) में मिलकर तनु है.
- एक सीमित विवर्तन 570 एनएम के तरंग दैर्ध्य में ~ 2.6 सुक्ष्ममापी ऑप्टिकल ध्यान को प्राप्त करने के फाइबर उत्पादन एक खुर्दबीन उद्देश्य के पीछे एपर्चर (RMS4X, Thorlabs) भरता है.
- अल्ट्रासोनिक पता लगाने
- अल्ट्रासोनिक transducer: 50 मेगाहर्ट्ज केंद्रीय आवृत्ति (V214 BB-RM, ओलिंप NDT).
- अल्ट्रासोनिक transducer अल्ट्रासोनिक का पता लगाने, जो coaxially विवर्तन सीमित ऑप्टिकल विकिरण के साथ गठबंधन किया है के लिए एक घर बनाया ध्वनिक ऑप्टिकल बीम 11 combiner से जुड़ी है.
- एक गोलाकार गुहा combiner के नीचे की जमीन के लिए एक ध्वनिक लेंस का उत्पादन. इस ध्वनिक लेंस पानी में 0.5 की संख्यात्मक एपर्चर है और 50 मेगाहर्ट्ज केंद्रीय आवृत्ति में एक ध्वनिक 43 सुक्ष्ममापी का केन्द्र व्यास देता है.
- ऑप्टिकल और ध्वनिक foci confocally गठबंधन कर रहे हैं का पता लगाने संवेदनशीलता को अधिकतम करने के.
- ध्वनिक युग्मन
- ड्राई अल्ट्रासोनिक युग्मन के लिए पानी में प्रायोगिक पशुओं submerging, जो जल्दी photoacoustic इमेजिंग सिस्टम 12 में इस्तेमाल किया गया था से बचने के लिए कार्यरत है.
- एक इमेजिंग खिड़की एक पेट्री डिश (व्यास में 9 सेमी) के नीचे में खोला है और एक ultrasonically और ऑप्टिकली पारदर्शी पॉलीथीन झिल्ली के साथ बंद है.
- पॉलीथीन झिल्ली और वस्तु imaged उत्पन्न वस्तु से photoacoustic पेट्री डिश के लिए लहर, और विआयनीकृत जल पेट्री डिश में आगे जोड़े जलमग्न या PAM इमेजिंग सिर लहर जोड़े के बीच अल्ट्रासोनिक जेल (साफ छवि, SonoTech) .
- इलेक्ट्रॉनिक्स
- photoacoustic अल्ट्रासोनिक transducer द्वारा पता लगाया संकेत दो cascaded एम्पलीफायरों (ZFL 500LN, मिनी सर्किट) से परिलक्षित होता है
- प्रवर्धित संकेत एक 14 बिट डेटा (DAQ) एक नमूना दर पर 200 एमएस एस / के अधिग्रहण बोर्ड (14,200 CompuScope, पण एप्लाइड साइंसेज) के द्वारा डिजीटल है
- योजना स्कैनिंग
- (2 डी) दो आयामी रेखापुंज या PAM क्षैतिज विमान (xy) के साथ इमेजिंग सिर की स्कैनिंग एक व्यक्तिगत कंप्यूटर है, जो दोनों DAQ बोर्ड और लेजर पंप से चलाता है के द्वारा नियंत्रित है. ट्रिगर संकेत DAQ बोर्ड से संकेत बाहर घड़ी के साथ सिंक्रनाइज़ है.
- 2 - डी स्कैनर के तेजी से धुरी पार के अनुभागीय स्कैन (बी स्कैन) की दिशा के रूप में परिभाषित किया गया है.
- बी स्कैन छवियों का एक अनुक्रम धीमी अक्ष के साथ इमेजिंग सिर अनुवाद करने के लिए एक बड़ा छवि, जो एक सीधा 3 - डी प्रतिपादन या 2 - डी अधिकतम आयाम (एमएपी) प्रक्षेपण छवि में भी देखा जा सकता है के रूप में द्वारा अधिग्रहीत किया जा सकता है है .
2. सिस्टम संरेखण
- पल्स गूंज अल्ट्रासाउंड और एक अल्ट्रासोनिक प्रतिक्षेपक का उपयोग ध्वनिक फोकल हवाई जहाज़ (यानी, ट्रिगर संकेत से समय अधिकतम पल्स गूंज अल्ट्रासोनिक संकेत देरी) की स्थिति निर्धारित करने के लिए. यह कदम केवल एक बार प्रदर्शन हो सकता है जब या-PAM प्रणाली के निर्माण की आवश्यकता है.
- एकल मोड फाइबर के युग्मन दक्षता अधिकतम.
- एक ऑप्टिकली अवशोषित ऑब्जेक्ट (उदाहरण के लिए, काले टेप का एक टुकड़ा) के शीर्ष पर अल्ट्रासोनिक जेल लागू करें और धीरे विआयनीकृत जल से भरा पेट्री डिश में इमेजिंग खिड़की के नीचे देते हैं.
- पानी में कम इमेजिंग सिर, और हवा ध्वनिक लेंस के तहत फंस बुलबुले को हटा दें.
- इमेजिंग सिर समायोजित करें जब तक अवशोषित वस्तु के photoacoustic संकेत ध्वनिक नाभीय विमान है, जो ध्वनिक देरी से न्याय किया जा सकता से है.
- खुर्दबीन उद्देश्य के ऊर्ध्वाधर स्थिति के लिए (यानी, Z स्थिति) photoacoustic फ्लैट वस्तु से उत्पन्न संकेत के आयाम को अधिकतम समायोजित करें. अधिकतम संकेत आयाम पता चलता है कि ऑप्टिकल ध्यान ऊर्ध्वाधर दिशा में ध्वनिक ध्यान केंद्रित के साथ गठबंधन किया है.
- खुर्दबीन उद्देश्य (यानी, x और y पदों) की क्षैतिज स्थिति को समायोजित करें जब तक photoacoustic लक्ष्य से उत्पन्न संकेत एक सममित पैटर्न से पता चलता है. समरूपता पता चलता है कि ऑप्टिकल ध्यान क्षैतिज दिशा में ध्वनिक ध्यान केंद्रित के साथ गठबंधन किया है.
- 2.6 और 2.7 कदम दोहराएँ जब तक photoacoustic संकेत दोनों समरूपता और आयाम में अनुकूलित है.
3. एक सा mple प्रयोगात्मक प्रक्रिया में vivo-PAM माउस कान vasculature की
- नग्न चूहों के लिए यह कदम की आवश्यकता नहीं है. एक कॉकटेल intraperitoneal इंजेक्शन [:; 0.1 ml/10 छ खुराक 1 मिलीलीटर (100 मिलीग्राम / एमएल) ketamine, 0.1 मिलीलीटर (100 मिलीग्राम / एमएल) xylazine, और 8.9 मिलीलीटर खारा नुस्खा] के साथ पशु anesthetize. कान में बाल दाढ़ी, और आगे SURGI क्रीम (# श्रेणी: 82565, अमेरिकन इंटरनेशनल इंडस्ट्रीज) के साथ अवशिष्ट बाल बाल मूंड़ना विआयनीकृत जल के साथ सफाई करने से पहले. ध्यान दें कि ऐसे depilation थोड़ा त्वचा vasculature जलन और हो सकता है इस प्रकार प्रयोग से पहले की योजना बनाई है 24 घंटे के प्रदर्शन.
- Photoacoustic लेजर प्रणाली पर मुड़ें, और सिस्टम संरेखण की जाँच करें.
- माउस के साथ साँस लेना गैस (विशिष्ट प्रवाह दर 1.0-1.5 एल / मिनट है, जानवर के शरीर के वजन पर निर्भर करता है) द्वारा 3 isoflurane% vaporized anesthetize, और एक प्रयोग भर isoflurane% के साथ संज्ञाहरण बनाए रखने. चिकित्सा ग्रेड हवा में साँस लेना करने के लिए सामान्य शारीरिक स्थिति पर माउस बनाए रखने के लिए गैस के रूप में सिफारिश की है.
- एक stereotactic चरण के लिए माउस स्थानांतरण, और एक हीटिंग पैड के साथ 37 पर शरीर का तापमान ° C पर नियंत्रण.
- समतल एक प्लास्टिक की थाली पर माउस कान और कान के शीर्ष पर अल्ट्रासाउंड जेल की एक परत को लागू. जेल के अंदर हवा बुलबुले फँसाने से बचें. फिर, इमेजिंग खिड़की के नीचे कान जगह है और धीरे धीरे जब तक अल्ट्रासाउंड जेल polyethylene झिल्ली के नीचे संपर्क पशु चरण बढ़ा. शीतल संपर्क क्योंकि झिल्ली के खिलाफ कान दबाकर कान में रक्त के प्रवाह को प्रभावित कर सकते हैं की आवश्यकता है.
- माउस पैर या पूंछ के लिए एक नाड़ी oximeter दबाना करने के लिए अपनी शारीरिक स्थिति की निगरानी, और आंखों को मरहम लागू करने के लिए सूखापन और आकस्मिक लेजर माउस आँखों को नुकसान को रोकने.
- कम इमेजिंग सिर तक ध्वनिक लेंस विआयनीकृत जल में डूब जाता है, और हवा ध्वनिक लेंस के तहत फंस बुलबुले को हटा दें.
- लेजर प्रभाव की जाँच के लिए यकीन है कि यह अमेरिकी राष्ट्रीय मानक संस्थान 13 के लेजर सुरक्षा मानकों के भीतर है . लेजर प्रभाव MJ 20 / 2 सेमी है, जो लेजर पल्स ऊर्जा जब त्वचा की सतह के नीचे 150 सुक्ष्ममापी पर लेजर बीम ध्यान केंद्रित की 80 NJ में तब्दील अधिक नहीं होनी चाहिए.
- बाह्य - ट्रिगर मोड सेट करने के लिए लेजर और परीक्षण स्कैनिंग शुरू. इमेजिंग सिर के z स्थिति को समायोजित करें जब तक मजबूत photoacoustic संकेत ध्वनिक फोकल हवाई जहाज़ से.
- सही स्कैनिंग पैरामीटर सेट और औपचारिक छवि अधिग्रहण शुरू.
- प्रयोग के बाद, बंद लेजर बारी, इमेजिंग सिर विआयनीकृत पानी से बाहर लिफ्ट, जानवर मंच कम करने के लिए माउस को रिलीज, विआयनीकृत जल के साथ माउस कान साफ करने के लिए, संज्ञाहरण प्रणाली और तापमान नियंत्रक बारी करने के लिए, और माउस अनलोड stereotactic मंच से.
- यदि दोहराव इमेजिंग आवश्यक है इनक्यूबेटर में पर्यावरण 37 पर सेट तापमान डिग्री सेल्सियस के साथ माउस डाल जानवरों की सुविधा के लिए माउस वापसी के बाद यह स्वाभाविक रूप से उठता है. अन्यथा, पशु प्रोटोकॉल के लिए euthanatize और इसे के निपटान का पालन करें.
4. कार्यात्मक या-PAM कुल एकाग्रता और हीमोग्लोबिन के ऑक्सीजन संतृप्ति
- (2 HBO) Oxyhemoglobin और deoxyhemoglobin (HBR) हीमोग्लोबिन की दो प्रमुख रूपों, प्रबल दिखाई वर्णक्रमीय रेंज में अंतर्जात photoacoustic स्रोत हैं. एचबीओ 2 और HBR अलग ऑप्टिकल अवशोषण स्पेक्ट्रा है और इस प्रकार spectrally दोनों कुल (HBT) एकाग्रता और 5 हीमोग्लोबिन के ऑक्सीजन संतृप्ति (2 इतनी) यों विभेदित कर सकते हैं. यहाँ दो दिशा निर्देशों में मदद करने के लिए इतना 2 मापन के लिए उचित ऑप्टिकल तरंगदैर्ध्य का चयन कर रहे हैं:
- तरंग दैर्ध्य हीमोग्लोबिन अवशोषण स्पेक्ट्रम (यानी, 550-600 एनएम) के क्यू बैंड के भीतर चयनित किया जाना चाहिए पर्याप्त संकेत से शोर अनुपात और पर्याप्त प्रवेश सुनिश्चित.
- तरंग दैर्ध्य जहां दो HBO और HBR के अवशोषण गुणांक एक स्पष्ट अंतर है (उदाहरण के लिए, HBR प्रमुख 561 एनएम और 2 प्रमुख 578 एनएम HBO) की सिफारिश कर रहे हैं .
इतना 2 के अलावा, HBT जोड़कर गणना की जा सकती [HBR] और [2 HBO] एक साथ, या यह सीधे हीमोग्लोबिन की दाढ़ विलुप्त होने के गुणांक (उदाहरण के लिए, 530 एनएम, 545 एनएम, 570 एनएम, और स्पेक्ट्रा के isosbestic तरंगदैर्य पर मापा जा सकता है 14 584 एनएम), जहां HBR और एचबीओ 2 बराबर दाढ़ विलुप्त होने के गुणांक है.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1 में दिखाया गया है संवहनी और रहने वाले नग्न माउस दोहरे तरंगदैर्य (561 और 570 एनएम) या PAM द्वारा imaged कान में शारीरिक रचना 2 इतनी . दोहरे तरंगदैर्य के लिए विशिष्ट छवि अधिग्रहण समय है तो ब्याज की एक क्षेत्र के दो माप (छवि आकार: 10 मिमी x 10 मिमी, कदम आकार: 2.5 सुक्ष्ममापी x 5 सुक्ष्ममापी) ~ 80 मिनट है.
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1 में vivo ऑप्टिकल संकल्प photoacoustic माइक्रोस्कोपी में चित्रा. (ए) कुल हीमोग्लोबिन एकाग्रता दिखा नाड़ी शरीर रचना विज्ञान (570 एनएम अधिग्रहीत) और (बी) एक नग्न माउस कान में हीमोग्लोबिन ऑक्सीजन संतृप्ति (561 एनएम और 570 एनएम पर अधिग्रहीत) के एमएपी छवियाँ. (सी) पैनल में बॉक्स्ड क्षेत्र (ए) के बंद ऊपर. पैनल में पैमाने पर पट्टी (A) दोनों (एक) लागू होता है और (बी).
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Discussion
इस वीडियो में, हम या PAM के प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल सिस्टम विन्यास, प्रणाली, संरेखण, और ठेठ प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं सहित, पर एक विस्तृत निर्देश प्रदान करते हैं. लेबल मुक्त noninvasive या PAM microvascular और एक एकल केशिका आधार पर कामकाज चयापचय के अध्ययन के लिए सक्षम है और जिससे microcirculation संबंधित फिजियोलॉजी और विकृति के बारे में हमारी समझ का विस्तार क्षमता रखती है. Microphotoacoustics वर्तमान में इस प्रणाली या-PAM निर्माण है.
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Disclosures
सभी प्रयोगात्मक पशु प्रक्रियाओं प्रयोगशाला पशु चिकित्सा सेंट लुइस में वाशिंगटन विश्वविद्यालय के पशु अध्ययन समिति के स्कूल द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के साथ conformance में किए गए.
Acknowledgments
लेखक डा. Lynnea Brumbaugh पांडुलिपि के पास पढ़ने की सराहना करते हैं. यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य EB000712 R01 अनुदान, EB008085 R01, R01 CA134539, CA136398 U54, और DK02057933 5P60 संस्थान के द्वारा प्रायोजित किया गया था. प्रो Lihong वी. वांग Microphotoacoustics इंक, और Endra, Inc, में एक वित्तीय हित है जो, हालांकि, इस काम का समर्थन नहीं किया है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Home-made acoustic-optical beam combiner: | |||
| right-angle prism | Edmund Scientific | NT32-545 | |
| rhomboid prism | Edmund Scientific | NT49-419 | |
| silicone oil | Clearco Products | 1000cSt | |
| OR-PAM system | Microphotoacoustics | ||
References
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