의 생성에 대한 신속, 간단하고 비용 효율적인 프로토콜 기증자 파생 CMV, EBV 감염 또는 교수실을 개발하는 위험 allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 수신자에게 주입을위한 multivirus 특정 CTLs (rCTL을). 이 제조 과정은 GMP 준수하고 전문 센터 이외 T – 세포 immunotherapy의 광범위한 구현을 보장한다.
바이러스성 감염은 allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 수신자의 병적 상태와 사망률의 원인이됩니다. 우리와 다른 사람이 성공적으로 생성되고 엡스타인 바 바이러스 (EBV), 사이토 메갈로 바이러스 (CMV)와 monocytes와를 사용하여 아데노 바이러스 (교수실)에 대한 T – 세포를 특정 주입이 EBV – 변환 lymphoblastoid 셀 (EBV – LCL) 아데노 바이러스 벡터와 마찬가지로 유전자 – 수정 항원 제시 세포 (APCs). 마찬가지로 몇 가지 2×10으로 5 / kg trivirus 특정 세포 독성 T의 lymphocytes (CTL)은 주입 후 몇 가지 로그의 확산 및 다른 가능한 치료에 내성도 심각한 바이러스성 질병을 예방하고 치료 나타났다. 준비 -이 장려 접근법의 광범위한 구현은 높은 생산 비용, 제조의 복잡 성과 연장 시간 (총 10-14주 CTL 제조 EBV – LCL의 생성 및 4~8주에 대한 4~6주)에 의해 제한됩니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 우리는 새로운 GMP 준수 CTL 생산 프로토콜을 개발했습니다. 첫째, 우리는 항원 제시와 같은 DNA plasmids 인코딩 LMP2, EBNA1 및 BZLF1 (EBV), Hexon 및 펜톤 (교수실), 그리고 pp65 및 IE1 (CMV)와 nucleofected 돌기 세포 (DCS)를 사용하여 T – 세포를 자극하는 adenovectors 대신에 세포. 이러한 APCs는 모든 자극 항원에 대한 T 세포가 특정 재활 성화. 둘째, 문화는 IL – 4의 존재에 T – 세포를 활성화 (1,000 U / ML)와 IL – 7 (10ng/ml)은 증가 및 라인에서 특정 T 세포의 레퍼토리와 주파수를 부양하고 있습니다. 셋째, 우리는 따라서 EBV – LCLs에 대한 요구 사항을 제거하고 기술자의 개입을 줄이고, 하나의 자극 후 대형 세포 숫자의 확장과 생존을 촉진 새로운 가스 투과 문화 장치를 (G – 렉스) 사용하고 있습니다. 이러한 변경 사항을 구현함으로써 우리는 지금> 90%에 의해 줄어 듭니다 10 6 세포 당 비용 EBV, CMV 및 교수실을 대상으로 multispecific CTL를 생산하고, 수있는 추가로 연장할 수 있습니다 접근법을 사용 단 십일 오히려 10 주 보호 바이러스 항원. 우리의 FDA 승인 접근 방식은 높은 위험 allogeneic HSCT받는 사람에 대한 예방 및 치료 응용 프로그램에 가치가 있어야합니다.
바이러스성 감염은 자신의 질병 또는 치료에 의해 immunocompromised 아르 환자에서 상당한 병적 상태와 사망률을 차지합니다. HSCT 후, 예를 들어, EBV와 CMV뿐만 아니라 호흡 Syncytial 바이러스 (RSV)와 같은 호흡기 바이러스와 같은 영구 herpesviruses에 의한 감염은 잘 알려진 반면 교수실, BK 바이러스에 의한 감염의 중요성, 인간 herpesvirus는 (HHV) -6 더 최근에는 감사하고 있습니다. 약리 대리인 어떤 감염에 대한 표준 치료하는 동안, 그들은 실질적인 toxicities을 가지고, 강한 변종을 생성하고, 자주 비효 있습니다. 대조적으로, 줄기 세포 기증자에서 파생된 바이러스 구체적인 T 세포는 hemopoietic 줄기 세포 이식에 바이러스 감염 또는 질병 (HSCT) 설정 2,5,6,18-21의 예방 및 치료에 안전하고 효과적인 입증했습니다. 그러나 T 세포 immunotherapy의 광범위한 구현 궁극적으로 CTL 생산에 필요한 비용, 복잡하고 시간에 따라 제한됩니다.
현재 원고에 기술된 multivirus CTL을 생성하기 위해 우리의 소설과 빠른 접근 방식은 실질적으로 immunocompromised 호스트에 대한 치료의 표준이 될 수있는 전략을 사용, 바이러스성 질환에 대한 세포 독성 T 세포 치료의 가능성을 증가한다. APCs로 플라스미드 nucleofected DC가의 사용은 다른 DC의 집단은 각각의 플라스미드 3 활용되기 때문에 하나의 셀 안에 표시되고 여러 바이러스 항원의 바이러스성 벡터는 물론 경쟁없이는 MHC 클래스 I 및 II 모두에서 항원 프레 젠 테이션을 수 있습니다. correspondingly 16,17 항원에 특정한 T 세포 응답의 주파수와 레퍼토리을 높일 수 있습니다 IL – 7분의 4 증가 T 세포 생존과 확산의 사용합니다. 마지막으로, G – 렉스의 문화는 크게 문화 중 T 세포 apoptosis을 줄일 수 있습니다. 가스 교환 (에서 O 2, CO 2 아웃)가 더 많은 영양소를 제공하고 폐기물을 diluting, 세포 위의 매체보다 깊이있게하면서 hypoxia을 방지, 술병의 바닥에 가스 투과 실리콘 막에 걸쳐 발생합니다. 이 플랫폼은 또한 보호 항원을 식별하는 경우 추가로 바이러스 확장될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 셀룰러 테라피 (계약 NIH – NHLBI (HB – 10 – 03) HHSN26820100000C) (CMR), 셀 기반의 치료를위한 전문 센터에 대한 생산 지원에 의해 지원됩니다 부여 NIH – NHLBI 1 U54 HL081007 (CMR), ASBMT 영 인베스티게이터 수상 (UG와 JV), 임상 연구 수상 (UG)에서 백혈병과 림프종 사회 특별 연구원, 그리고 에이미 Strelzer Manasevit 학술 수상 (AML).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
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CellGenix | CellGenix | 2005 |
IL4 | R+D Systems | 204-IL/CF |
IL7 | Peprotech | 200-15 |
Hyclone RPMI 1640 | Thermo Scientific | SH30096.01 |
Human AB serum | Valley Biomedical Inc. | HP1022 |
Nucleofector | Amaxa/Lonza | AAF-1001B & AAF-1001X |
Nucleofection Kit | Amaxa/Lonza | V4XP-3012 |
Plasmids | NTC | n/a |
GM-CSF | R&D | 215-GM/CF |
IL1 | R&D | 201-LB-025 |
IL6 | R&D | 206-IL-CF |
TNFα | R&D | 210-TA-010 |
PGE2 | Sigma | P6532-1MG |
G-Rex | Wilson Wolf Manufacturing | AY11-00027 |