静脈血栓症の電解下大静脈モデル（EIM）

Summary

内皮活性化と部分的な鬱血、ウィルヒョウの三つ組の二つの成分に起因する静脈型血栓形成における下大静脈の結果の内部表面に内皮活性化の電解誘導。

Abstract

動物モデルでは血栓形成、血栓溶解を研究するために、潜在的な治療用化合物（1）をテストするために、深部静脈血栓症（DVT）の研究において重要な役割を果たす。 DVTの治療と予防に利用される新たな化合物は、現在開発されている。影響を受ける血栓静脈への潜在的な治療アンタゴニスト化合物の配信が問題となっている。治療への応用の文脈では、部分的な停滞を使用し、一貫して主要な静脈内に血栓を生成するモデルは、最近設立されました。電解下大静脈モデル（EIM）は、連続的な血流の存在下で血栓形成を可能にDVTのマウスモデルです。このモデルでは、治療薬は、動的な方法で血栓と接触することができ、DVT（1）の他のモデルよりも敏感です。さらに、この血栓モデルは密接に血栓形成の臨床的な状況をシミュレートし、静脈内皮細胞の活性化、白血球遊走、静脈血栓、および治療への応用をテストする（1）を研究する理想的です。 EIMのモデルは簡単に​​再現可能な、技術的に簡単である、一貫性のある血栓の大きさを作成し、分析目的のために必要とされる大規模なサンプル（例：血栓と静脈の壁）が可能になります。

Protocol

1。マウスの麻酔の手順

1. 動物は彼らのケージから取り出し、2％イソフルランと毎分0.5リットル（気化器制御）の流量で100％酸素でガスの誘導のための麻酔術前誘導のチャンバー内に配置されます。
2. マウスは、麻酔の誘導チャンバ内鎮静チャンバーから除去し、髪の毛の脱毛は、（1分間）使用されている場合は腹側腹部を電気バリカンで剃毛、またはチャンバー内に保持されています。
3. まだ鎮静下で、彼らの重量を測定している間、目がその後イソフルランと酸素を使用してノーズコーンと全身麻酔下に温水循環加熱装置に背recumbancyに配置された無菌の眼軟膏と、で潤滑されています。この時点で、酸素の割合は、毎分0.2リットルに削減されます。
4. 腹部はクロルヘキシジン液（クロルヘキシジン二酢酸は急速にbacterialcidalと持続性がある）を噴霧し、滅菌ガーゼで拭いて三回か手術部位はきれいになるまでさ。

2。マウスマイクロ外科および回復手順

1. 腹側正中切開（2 cm）を腹部を露出皮膚や腹壁を通して虹彩をハサミで作られています。ガーゼの滅菌生理食塩水浸漬した2x2のは動物の左側に腸を反映するために使用されます。マウスの制止する人は、下大静脈（IVC）の可視化を可能にする場所に置かれている。
2. この時点では、イソフルランを2％の保守レベルに低減され、酸素の割合は、外科的処置の残りのための毎分0.2リットルのままです。
3. 鈍的切開は、滅菌アプリケーター綿棒や余分な繊細な虹彩の半分の湾曲した組織鉗子を用いて促進される。ケアは、彼らは非常に壊れやすいために、マウス組織の取り扱いには注意が必要です。
4. 腎静脈から腸骨分岐へのすべてのIVCの側枝は、,7 - 0非反応性prolene縫合糸で結紮されています。バックの枝は、特許残った。
5. 電解IVCモデル（EIM）には、銀コーティング銅線（KY - 30 - 1 - GRN、Electrospec、ドーバー、ニュージャージー州）に接続されている25Gのステンレススチール針は、露出尾IVC、（図1）に挿入されますと前壁（陽極）に対して配置されます。
6. 別の線は、皮下回路（カソード）を完了注入される。
7. 15分250以上のμAmpsの現在はグラスS48矩形波刺激装置と定電流ユニット（グラステクノロジー、アストロメッド社、ウェストワーウィ​​ック、ロードアイランド）を使用して適用した。血栓形成の環境とそれに続く血栓形成を促進するIVCの内皮表面を侵食し電気分解の有毒な生成物の形成における直流結果。
8. 15分後、針が削除され、綿棒は、出血を防ぐために、地域との接触で穏やかに開催されます
9. シャム動物では、針は現在のアプリケーションなしで、IVC内に配置されてから削除されます。
10. 開腹部位は、2層方式で閉じられます。当研究室では、腹壁を閉じるには、連続的なパターンで5〜0 vicryl、合成縫合糸を、使用しています。接着剤の皮膚接着剤は、皮膚を閉じるために使用されます。除去するための外付縫合糸はありません。
11. マウスは、その後、元の住宅に戻って、密接に加熱ランプ（24インチ離れてケージから分の距離）の下（2時間まで45分）手術後に観察された、個々のマウスのケージに回収されています。それは研究目的に干渉していない場合の鎮痛薬と抗炎症剤を用いることができる。科学的な鎮痛剤を差し控えることを正当化、獣医、そしてICUCAの承認が必要とされています。当研究室では、ブプレノルフィン,0.05 - 0 .1 mg / kgのSQは、マウスのための優秀なプリと術後の鎮痛剤であることを見出した。全身鎮痛薬は、実験結果を混乱させる可能性がある場合に加えて、4mg/kgでのリドカインは、（0.4 mlの1％溶液の/ kg）の切開部位に注入することができます。
12. 我々は一般的にDVTに起因する術後の副作用は発生しません。しかし、不利な術後の効果は、自発的な麻酔死、手術の失血、および神経の外傷に起因する部分的な麻痺を含めることができます。回復が遅い動物が飼育ヌートリアゲルであるか湿った固形飼料は、動物の回復を促進するためにケージの床に置くことができます。断絶術後合併症を有する動物を人道的に安楽死されるべきである。
13. 割り当てられた時点で、安楽死は、げっ歯類のための安楽死についてアメリカ獣医学協会のガイドラインで定められている勧告に従って人道的に行われます。

3。代表的な結果

EIMは、連続的な血流の存在下で血栓形成モデルです。次の図は、このような斬新なモデルで検討したパラメータを示す。

図1 25Gステンレス鋼のdefinesthe解剖学的領域銀被覆銅線（KY - 30 - 1 - GRN、Electrospec、ドーバー、ニュージャージー州）に接続されている針は、挿入されます。リンパ節がほとんど存在していると尾IVCを見つけるために目印として役立つことに注意してください。

図2：2日間、異なる菌株のEIM後の血栓重量。予想されたように、血栓重量はPAI - 1 KOマウスと凝固亢進デルタCTマウスで大きい（^ CT）で低かった。

図3：可溶性P -セレクチン、深部静脈血栓症のためのメーカーは、異なる株で測定した。最高レベルが亢進デルタCTマウスで発見されたのに対し、最も低いレベルは、PAI - 1 KOマウスで発見された。

血栓重量およびP -セレクチン可溶性の間に図4の相関は、異なる株で発見された。注目すべきは、短い血栓サイズを生成されたグループで、検出されたP -セレクチン可溶性（PAI - 1 KOマウス）最も低かった。最大の血栓サイズを生成したグループでは、検出されたP -セレクチン可溶性（凝固亢進デルタCT）最高であった。

図5：血流の存在を実証するためには、超音波がEIMを受けたマウスで行われた。図5は、2日EIM後にマウスで行われた超音波を示しています。その後、試料は収穫だった。血栓の形状が流れの存在下で血栓形成を示唆することに注意してください

Discussion

マウスは 、in vivo実験での優れた研究ツールです。このように、密接に疾患や病態を模倣するマウスモデルの開発が必要である。光化学（2）、うっ血（3-4）と機械的外傷（5-6）：いくつかの静脈血栓症のマウスモデルを含むDVTを研究するために使用されています。しかし、これらのモデルのどれも連続的な血流の存在下で血栓を生成するために内部内皮刺激を使用します。 EIMは、IVC内に電解刺激を使用して、血流の存在下で内皮活性化（1）で静脈血栓形成を促進する。それは簡単に再現可能な、技術的に簡単であり、高い生存率（99％）を持っています。電流が電解を作成するために使用されているという事実にもかかわらず、熱は、（1）生成されません。 EIMのモデルは密接に臨床DVTをシミュレートし、そのため血栓形成と解決の本質的なメカニズムを研究するための貴重なツールとして機能します。 EIMのモデルでは、血栓症の疾患に対する新しい治療法の進歩にも便利です。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	ABCD1234