Summary
Электролитические индукции активации эндотелиальных внутренней поверхности нижней полой результаты Кава в венозной типа тромба из-за активации эндотелиальных и частичное стаз крови, два компонента триады Вирхова.
Abstract
Животные модели служат жизненно важную роль в глубоких венозного тромбоза (ТГВ) исследования с целью изучения образования тромбов, тромбы разрешение и проверить потенциального терапевтического соединения (1). Новые соединения, которые будут использоваться в лечении и профилактике тромбоза глубоких вен в настоящее время разрабатываются. Доставка потенциальных терапевтических соединений антагониста пострадавших тромбированного вены была проблематичной. В контексте терапевтического применения, модель, которая использует частичный застой и последовательно формирует тромбы в основной вене была недавно установлена. Электролитические нижней полой вены Model (EIM) является мышиной модели ТГВ, который позволяет тромба при наличии непрерывного потока крови. Эта модель позволяет терапевтических агентов, чтобы быть в контакте с тромбом в динамической моде, и является более чувствительным, чем другие модели тромбоза глубоких вен (1). Кроме того, эта модель тромбоза тесно имитирует клинических ситуациях тромбообразования и идеально подходит для изучения венозного эндотелия активации клетки, миграции лейкоцитов, венозных тромбов, а также для проверки терапевтического применения (1). Модель EIM является технически простым, легко воспроизводимым, создает последовательную размеров тромбов и обеспечивает большой выборки (т.е. тромба и стенки вены), необходимую для целей аналитической.
Protocol
1. Процедуры Мышь Анестезия
- Животные будут удалены из их клетки и помещают в анестезии дооперационном индукции камеры для газовой индукции на уровне 2% изофлуран и 100% кислорода при расходе 0,5 л в минуту (испаритель управлением).
- Мыши седативные в камере индукции анестезии, удаляются из камеры и вентральной живот бритая с электрическими ножницами, либо поддерживать в камере, если волос для удаления волос используется (1 мин).
- Хотя до сих пор под действием успокоительного, они подняты, глаза смазываются мазью стерильные офтальмологические и, затем помещали в спинной recumbancy на теплые воды, циркулирующей нагревательного устройства под общим наркозом с использованием носового конуса изофлуран и кислорода. На данный момент кислорода ставка снижается до 0,2 литров в минуту.
- Живот опрыскивают решение хлоргексидина (хлоргексидин диацетат быстро bacterialcidal и стойкие) и протирают стерильной марли в три раза или до места операции чист.
2. Мышь микро-хирургических и процедур восстановления
- Вентральной срединной линии разреза (2 см) производится с диафрагмой ножницами через кожу и брюшной стенки подвергая живот. Стерильного физиологического раствора пропитанной 2x2 в марлю используется для отражения кишечника в левой части животного. Мышь фиксатор ставится на место позволяет визуализации нижней полой вены (НПВ).
- На данный момент, изофлуран сводится к прежнем уровне в 2% и кислорода ставка остается на уровне 0,2 литров в минуту в течение оставшейся части хирургического вмешательства.
- Блант рассечение облегчается использованием стерильного тампона аппликатор и дополнительные тонкие half диафрагмы изогнутые щипцы ткани. Необходимо соблюдать осторожность при обращении мыши тканей они очень хрупкие.
- Все побочные IVC отраслей, от почечной вены подвздошной бифуркации, лигируют с 7-0 нереактивный швов проленовой. Вернуться ветви остался патент.
- В электролитических IVC модели (EIM), 25G нержавеющей стальной иглой, прикрепленной к серебряной проволоки, покрытой медью (KY-30-1-GRN, Electrospec, Дувр, штат Нью-Джерси) вставляется в подвергается хвостового IVC, (рис. 1) и расположены против передней стенки (анод).
- Другой провод имплантируется подкожно завершения схемы (катод).
- Ток 250 μAmps в течение 15 минут была применена, используя травы S48 квадратных стимулятор волновой и постоянный ток единицы (Grass Technologies, Astro-Med, Inc, West Warwick, RI). Постоянного тока приводит к образованию токсичных продуктов электролиза, разъедающие эндотелиальной поверхности IVC содействия тромбогенного окружающей среды и последующее образование тромбов.
- Через 15 минут, игла удаляется и ватным тампоном, проводится осторожно в контакте с областью, чтобы предотвратить кровотечение
- У животных, обман, иглы помещается в IVC, а затем удален, без применения тока.
- Лапаротомия Сайт закрыт в двухслойной моды. Наша лаборатория использует 5-0 Викрил, синтетические шовные, в непрерывный узор, чтобы закрыть брюшной стенки. Клей клей кожа используется для закрытия кожи. Есть никаких внешних швов для удаления.
- Мыши затем восстановился в отдельные клетки мыши, внимательно наблюдал после операции (45 минут до 2 часов) под лампу нагрева (мин расстояние 24 см от клетки), а затем вернулся к своему первоначальному единиц жилья. Обезболивающие и противовоспалительные средства могут быть использованы, если она не вмешивается в исследовании цели. Научное обоснование отказать обезболивающие препараты, ветеринарные и ICUCA одобрение не требуется. Наша лаборатория обнаружила, что бупренорфин ,0.05-0 0,1 мг / кг SQ является отличным пред-и послеоперационного обезболивающего для мышей. Кроме того, лидокаин в 4mg/kg (0,4 мл / кг 1% раствора) могут вводиться в разрез сайт, когда системные анальгетики может вносить путаницу в результаты эксперимента.
- Мы обычно не испытывают послеоперационные неблагоприятные эффекты, связанные с ТГВ. Тем не менее, неблагоприятные послеоперационные эффекты могут включать спонтанные анестезии смерть, хирургические потери крови, и частичный парез из-за нервов травмы. Животные, которые не спешат восстанавливать можно подавать нутрии гель или влажные чау размещены на полу клетки, чтобы содействовать возвращению животного. Животные с разорвать послеоперационных осложнений должно быть гуманно усыпляют.
- В назначенный момент времени, эвтаназия осуществляется гуманно в соответствии с рекомендациями, изложенными Американской Ветеринарной Медицинской Ассоциации Руководство об эвтаназии для грызунов.
3. Представитель Результаты
EIM является моделью, которая образует тромб в присутствии непрерывным потоком крови. На следующих рисунках показаны параметры исследованных в этом романе модели.
Рисунок 1 definesthe анатомической области, в которых 25G из нержавеющей сталииглой, прикрепленной к серебряной проволоки, покрытой медью (KY-30-1-GRN, Electrospec, Дувр, штат Нью-Джерси) вставляется. Заметьте, что лимфатический узел почти настоящим и помогает в качестве ориентира, чтобы найти хвостового IVC.
Рисунок 2: Тромб веса через 2 дня после EIM в различных штаммов. Как и ожидалось, тромб вес был ниже в PAI-1 мышей нокаутом и больше в гиперкоагуляции Delta CT мышей (^ КТ).
Рисунок 3: Растворимый Р-селектина, мейкером тромбоз глубоких вен, была измерена в разных штаммов. Низкие уровни были найдены в PAI-1 мышей нокаутом в то время как высокие уровни были обнаружены в дельте гиперкоагуляции мышей КТ.
Рисунок 4 Зависимость между тромба вес и растворимого P-селектина был найден в различных штаммов. Следует отметить, что в группе, вызвавшего короткое тромба размер, растворимого Р-селектина обнаружен был самым низким (ИАП-1 KO мышей). В группе, создавший крупнейший тромба размер, растворимого Р-селектина обнаружен был самым высоким (гиперкоагуляции дельта КТ).
Рисунок 5: Для того, чтобы продемонстрировать наличие кровотока, УЗИ проводилось на мышах проходит EIM. На рисунке 5 показано ультразвуковое осуществляется в мышь через 2 дня после EIM. Затем образец был урожай. Обратите внимание, что тромб форме предложить тромба в присутствии потока
Discussion
Мышь является отличным инструментом исследований в естественных условиях эксперименты. Таким образом, развитие моделей мышей, что точно имитировать заболеваний или патологических состояний являются необходимыми. Некоторые модели венозного тромбоза мыши были использованы для изучения ТГВ в том числе: фотохимический (2), застой (3-4) и механической травмы (5-6). Однако ни одна из этих моделей использования внутренних эндотелиальных стимулом для создания тромба при наличии непрерывного потока крови. EIM с помощью электролитического стимулом в IVC, способствует венозного тромбообразования эндотелиальными активации в присутствии кровотока (1). Это технически простым, легко воспроизводимым и имеет высокую выживаемость (99%). Несмотря на то, что электрический ток используется для создания электролиза, тепло не генерируется (1). Модель EIM тесно имитирует клиническую ТГВ, и, следовательно, служит ценным инструментом для изучения внутренних механизмов образования тромбов и разрешение. Модель EIM также полезна для продвижения новых терапевтических подходов в отношении тромбоза болезни.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Поддержка NIH 1P01HL089407-01A1 (Lawrence, PI), Animal Основные, NIH 1 K01 HL080962-01A2 (Myers, П. И.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 |
References
- Diaz, J. A., Hawley, A. E., Alvarado, C. M. Thrombogenesis with continuous blood flow in the inferior vena cava. A novel mouse model. Thromb Haemost. 104, 366-375 (2010).
- Eitzman, D. T., Westrick, R. J., Nabel, E. G. Plasminogen activator inhibitor-1 and vitronectin promote vascular thrombosis in mice. Blood. 95, 577-580 (2000).
- Myers, D., Farris, D., Hawley, A. Selectins influence thrombosis in a mouse model of experimental deep venous thrombosis. J Surg Res. 108, 212-221 (2002).
- Myers, D. D., Hawley, A. E., Farris, D. M. P-selectin and leukocyte microparticles are associated with venous thrombogenesis. J Vasc Surg. 38, 1075-1089 (2003).
- Pierangeli, S. S., Barker, J. H., Stikovac, D. Effect of human IgG antiphospholipid antibodies on an in vivo thrombosis model in mice. Thromb Haemost. 71, 670-674 (1994).
- Pierangeli, S. S., Liu, X. W., Barker, J. H. Induction of thrombosis in a mouse model by IgG, IgM and IgA immunoglobulins from patients with the antiphospholipid syndrome. Thromb Haemost. 74, 1361-1367 (1995).
