Summary
우리는 3D 조직과 같은 집계 내의 세포 사이 조직 표면 장력으로 표현할 수있는 바인딩 에너지를 측정하는 방법을 설명합니다. 조직 표면 장력의 차이는 폐, 근육, 뇌 종양의 invasiveness와 연관시키는 시연하고, 다른 세포 유형 간의 공간 관계를 설립의 근본 determinants 아르되었습니다.
Abstract
세포 바인딩 에너지의 엄격한 측정은 평형에 시스템의 열역학적 원리에 기초 방법을 사용하여 만들 수 있습니다. 우리는 구체적으로 세포 사이의 상호 작용의 표면 자유 에너지를 측정하기 위해 조직 표면 tensiometry (TST)를 개발했습니다. TST를 기본 biophysical 개념은 이전에 세부 사항 1,2에 설명되어있다. 방법은 서로 응집 세포가 문화를 흔들림 유지한다면, 저절로 클러스터로 조립 것이라는 관측에 따라 달라집니다. 시간이지나면서,이 클러스터는 분야를 형성 모아 것입니다. 이 라운딩 - 최대 동작은 액체 시스템의 동작 특성을 모방한 것이었 지요. 세포 바인딩 에너지는 맞춤 설계 조직 표면 tensiometer의 병렬 플레이트 사이의 구형 집합체를 압축하여 측정됩니다. 액체 작은 물방울의 표면 장력을 측정하는 데 사용되는 동일한 수학적 방정식은 3 차원의 조직과 같은 구형 집계의 표면 장력을 측정하는 데 사용됩니다. 액체 표면 장력의 세포 이에 상응하는 세포 바인딩 에너지, 또는 그 이상 일반적으로 조직 cohesivity입니다. 저희 연구실에서 이전 연구는 배아 세포의 두 그룹이 서로 1-5와 상호 작용하는 것입니다 (2) 강하게 (3) 수 biomaterials 6 상호 작용하는 조직의 능력에 영향을 미칠 수있는 방법을 조직 표면 장력 (1) 예측하는 것으로 나타났습니다 뿐만 아니라 cadherin 기반 세포 응집 7 직접적인 조작을 통해, 또한 같은 FN 8-11 4 등 주요 ECM 분자)의 조작에 의해 변경될 수하면 폐암 암 12, fibrosarcoma 13, 뇌종양 14 전립선 종양의 침략 가능성과 연결합니다 셀 라인 15. 이 문서에서 우리는 장치, 세부 spheroids를 생성하는 데 필요한 단계, tensiometer 챔버에 spheroids를로드 집계 압축을 시작하고, 생성된 조직 표면 장력 측정을 분석하고 검증을 설명합니다.
Protocol
1. 조직 표면 장력의 측정 집계 준비.
자기편 세포 들어, spheroids이 중 매달려 드롭 방법을 사용하거나 다음 1mm 조각으로자를 수있는 세포의 일관된 시트를 생성하여 형성 수 있습니다.
매달려 드롭 방식으로 집계 형성 :
- 가까운 합류 자기편 세포 배양은 90 % 합류로 성장해야 뭘로 monolayers는 PBS로 두 번 씻어서해야합니다. 잘 배수 후, 0.05 % 트립신 - 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 2 MLS를 (100mm 접시)을 추가하고, 37 품어 ° C를 세포가 분리까지. 전체 중간 2 MLS를 추가하고 부드럽게 세포가 정지 때까지 혼합물을 씹다에 5 ML의 피펫을 사용하여 trypsinization를 중지합니다. 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다.
- 10 MG / ML DNAse 주식 솔루션 40 μl를 추가하고 RT에서 5 분 알을 품다. 5 분 200 XG에 소용돌이 짧게하고 원심 분리기.
- 뜨는 취소 1 ML 전체 조직 문화 매체와 펠렛을 씻으십시오. 반복 후, 전체 조직 문화 매체 2 MLS에 resuspend 세포.
- hemacytometer, 또는 자동 셀 카운터를 사용하여 셀을 카운트 및 2.5 X 10 6 세포 / ML로 농도를 조정합니다.
- 60mm 조직 문화 요리와 접시의 바닥에서 개최 PBS 5 MLS을에서 뚜껑을 제거합니다. 이것은 수화 챔버 역할을합니다.
- 뚜껑을 반전하고 뚜껑의 하단에 10 μl 방울을 입금 20 μl 피펫을 사용합니다. 만지지만큼 방울은 너무 충분히 떨어져 배치되었는지 확인합니다. 접시 당 최소한 20 방울을 배치하는 것이 가능합니다.
- 37 PBS - 채워진 바닥 챔버와 부화 ° C / 5 % CO 95분의 2 %의 습도에 뚜껑을 반전 매일 방울 모니터와 세포 시트 또는 집계 중 하나가 형성 때까지 알을 품다.
- 일단 시트 양식, 그들이 둥근 바닥 유리 쉐이크로 전송할 수 있습니다 전체 미디어 중 3 MLS가 포함된 37 흔들어 물을 욕조에 incubated flasks ° C와 spheroids 양식까지 5% CO 2.
세포 시트 방법으로 집계 형성 :
- 단세포 suspensions은 위에서 설명한 있지만 농도가 1x10 6 셀 / ML하도록 조정됩니다로서 준비하고 있습니다.
- 10 ML 둥근 바닥 flasks (Belco, 바인랜드, 뉴저지)에 세포 현탁액 3 ML을 전송합니다.
- 세포 trypsinization 복구까지 자이 러 토리 물을 욕조 / 37 쉐이크 (뉴 브 런 즈윅 과학, 에디슨, 뉴저지) ° C, 120 rpm으로 4h에 대한 5 % CO 2에서 flasks을 품어.
- 유리 둥근 바닥 원심 분리기 튜브와 얇은 펠렛으로 200 X g에서 원심 분리기에 세포를 전송합니다. 일관된 시트 양식까지 또 다른 24 H에 대한 부화.
- 부드럽게 소용돌이 문화 튜브는 시트를 이동시키다하고 작은 살균 유리 조직 문화 요리에 문화 튜브의 내용을 부어 있습니다.
- 다양한 크기의 조각으로 시트를 잘라 마이크로 scalpels를 사용합니다.
- 그들은 구형이 될 ° 120 RPM에서 자이 러 토리 waterbath 쉐이크에서 C % 2 3 일간 CO 2 5 이하 또는 때까지 37 조각을 품어.
2. 골재 표면 장력의 측정
- 조직 표면 tensiometer. 장치는 무화과로 표시됩니다. 1 2. 압축 세포 (그림 3) 2 방으로 구성되어 있습니다. 외부 챔버 (OC)는 37 ° C 물 순환 펌프에 연결하고, 내부 챔버 (IC)의 온도를 조절하는 역할을합니다. 여왕님 가공된 Delrin의 건설과 골재의 시각화에 대한 석영 창을 포함하고 있습니다. 3) 압축을 시작하기 위해 집계를 제고, 2) 내부 챔버의 바닥을 밀봉, 낮은 어셈블리 (라) 내부 챔버의 바닥에 나사와이 위치에게 1)에 대한 내부 챔버에서 집계를 사용하고 (4 ) 병렬 접시 따라서 골재의 압축 사이의 거리를 제어합니다. 어셈블리의 중앙 핵심 (CC)가 조절됩니다. 중앙 코어 (받침대)의 끝 부분이 부드러운 테플론의 구성 및 낮은 압축 판 (LCP) 역할을합니다. 상부 압축 플레이트 (UCP)는 (B) 불꽃 - 곧게 니켈 - 크롬 와이어 (NCW)에 의해 균형 암에서 중단되는 15mm 길이 테플론 실린더입니다 *. 실험 과정 동안 세포 집합 (A)는 하단 플레이트에 위치하고 연락처 상단 플레이트까지 증가합니다. 상부 판은 균형 암 (B)에 연결됩니다. 골재의 압축은 균형 팔 변위가 발생합니다. 균형은 NULL 균형의 원리에 작동 Cahn / Ventron 모델 2000 기록 electrobalance입니다. 균형 팔 받침은 영구적인 자기장 내에있는 전기자 있습니다. 잔액이 운영되면, 그것은 지속적으로 차례로 수평 위치에 균형을 유지 팔 전자 조립,을 통해 현재의 통과를 modulates. 개체는 잔액이 horizo에 팔을 유지에 적용 균형 팔, 전압에서 정지하는 경우ntal 위치는, 객체의 무게에 비례합니다. 이 전압은 집계에 적용된 외부 압축력을 측정합니다. 집계의 형태는 프레임 그래버가 장착된 컴퓨터에 결합 25 X 니콘 SMZ10A의 입체경을 통해 시각적 관찰에 의해 모니터링됩니다. 압축 접시에 세포 집계의 접착력을 최소화하기 위해 아래와 상부 압축 플레이트는 폴리 (2 - hydroxyethylmethacrylate) {폴리 (HEMA)}, 세포 16을 준수하지에 고분자 물질로 코팅했다 둘 다.
* 와이어는 화염 - 곧게 레토르트 스탠드에서 와이어의 15 인치 길이를 걸려하고 끝까지 작은 바인더 클립을 고정하여. 와이어가 붉은 빛이 때까지 알콜 램프는 다음 와이어의 길이를 아래로 실행하고 있습니다. 곧게 선은 다음 적절한 길이로 잘라 수 있습니다. 작은 후크가 약 와이어를 굽힘 ¼ 인치의 두 면도날을 사용하여 끝에서에 의해 형성됩니다. 다른 쪽 끝을 그런 다음 낮은 압축 판의 총구에 삽입됩니다. - 집계 압축.
- 내부 챔버는 미리 예열 CO 2 독립적인 조직 문화 매체 (Gibco / BRL, NY)으로 가득합니다.
- 약 200-300 μ부터 크기까지 집계는 낮은 압축 판 (그림 4A)에 위치하고 있습니다. 집계는 실리콘 전구가 장착되어 파스퇴르 피펫의 끝에까지 조직 문화 매체 절반 방식으로 집계를 aspirating 내부 챔버에 피펫을 전송하고, LCP 위의 피펫의 팁을 위치에 의해로드됩니다. 집계는 다음 부드럽게 부드럽게 전구를 당기고하여 LCP에 쫓겨입니다. 또는 집계는 LCP에 중력에 의해 낙하 수 있습니다.
- 상부 압축 플레이트 (UCP)은 집계 위에 위치하고 미리 압축 겉보기 UCP 무게 기준을 수립, 해결 수 있습니다.
- 집계는 UCP (그림 4B)에 대해 압축 때까지 LCP 그 다음 발생합니다. 하단 장치의 내부 코어의 높이를 조정하면 압축의 다른 정도를 제어합니다. 압축은 CCD 비디오 카메라가 장착되어 해부 현미경으로 관찰에 의해 모니터링됩니다.
- 집계 이미지는 캡처 디지털 및 ImageJ를 사용하여 분석하고 있습니다. 겉보기 UCP 무게 변화는 지속적으로 Cahn 밸런스의 전압 출력의 수평 - 오프으로 표시되는 스트립 차트 레코더, 모양 평형의 성과에 기록됩니다. 각 집합은 압축의 2 가지 정도를 받게됩니다.
- 골재 표면 장력의 계산.
형상 평형에서, 그것이 준수하지 않는 병렬 플레이트 사이의 압축 세포의 골재의 cohesivity는 cohesivity는, F가 집계를 압축 행동 힘이 σ 영 - 라플라스 방정식 (그림 5)에서 얻을 수 있습니다 , πr 3 2는 힘 F이 끼쳤다가되는 골재의 표면의 면적이며, R 2, R 3, 각각 압축 골재의 적도 반경과 표면 프로필 정상 정의 원호의 반경 아르 번호판을 압축하고 (그림 6) 사이에 확장합니다. 힘 및 형상 평형의 압축력과 기하학을 측정하고 영 라플라스 방정식 이러한 측정을 적용하는 것은 명백한 조직 표면 장력의 수치를 생성합니다. 평형 및 1 σ의 계산에 도달되면, 집계는 압축과 두 번째 평형에 접근하고 위에 설명된대로 2가 계산됩니다 σ 수 있습니다. - 골재 유동성의 확인.
액체 골재의 계산된 표면 장력은 두 가지 압박을 받게되면 지속적으로 유지됩니다. 이러한 집합체에의 비율은 2 σ / 1 1과 동일합니다 σ 각 연속 압축 (F 2 / F 1)에 적용되는 강제의 비율보다 적을 수 있습니다. 대조적으로, 탄성 골재의 계산된 표면 장력은 후크의 법칙에 순종하고 적용 강제로 비례 향상시킬 수 있습니다. 탄성 집합체에 대한의 비율은 2 σ / 1 1과 동일하지 않습니다 σ 대신 F 2 / F 1의 비율을 접근합니다. 액체 집합체의 표면 장력은 또한 골재 크기 2,17의 독립적인 것입니다. 표면 장력이 적용 힘 및 크기의 독립되는 단 측정은 평균 각 세포주에 대한 σ를 계산하는 데 사용됩니다.
3. 대표 결과 :
다음은 쥐의 전립선 섬유아 세포 (RPF)과 쥐의 전립선 평활근 세포 (RPSMC)의 집계에 대한 전형적인 TST 결과의 테이블입니다. 그림에서 볼 수 있듯이. RPF 세포 7 집계는 22.8의 표면 장력 ± 1.1 다인즈 / cm 있습니다. 또한, 압축 한 후 압축이 후에 측정한 평균 표면 장력 값은 통계 답하라되었습니다이점 T - 시험에 의해 비교 ICAL. 또한 그들이 탄성 고체로 행동면 등 2 σ / 이러한 집계는 후크의 법칙을 순종하지 않았 보장하기 위해 1과 F 2 / F 1 σ의 비율을 비교했다. 마찬가지로 표 1, 2 σ / 1 실제로 1.0을 접근하지 σ의 비율로 보여주었다. 또한, F 2 / F 1의 비율은 더 이상 이러한 집계는 후크의 법칙을 준수하고 실제로 액체처럼 행동하지 않는 것이 확인, 2 σ / (T - 테스트, P <0.05를 결합하여 1) σ보다 훨씬 컸습니다. 콘트라스트 RPSMCs에 후크의 법칙은 순종. 마찬가지로 표 1, 2 σ / σ 1의 비율로 나타난다하면 1보다 훨씬 큰이며, F 2 / F 1보다 통계적으로 다른되지 않았습니다. 추가로 액체와 같은 동작을 보여주기 위해, 우리는 표면 장력 (σ)와 집계 볼륨 사이의 관계를 탐구. 그림에서 볼 수 있듯이. RPSMCs (블루 회귀 선, R 2 = 0.146)에 대한 볼륨에 시그마의 일부 의존있을 나타나는 반면, 8, 볼륨, RPF 세포 (빨간색 회귀 선, R 2 = 0.002)에 대한 시그마의 독립적입니다. 이러한 데이터는 더 이상 RPSMCs의 사람들이 탄성 고체로 자세한 내용을 행동으로 나타나는 반면, RPF의 집계는 액체와 같은 방식으로 동작하는지 확인합니다. 액체와 같은 행동을 합산에서 얻은 자만 mesurements는 표면 장력을 계산하는 데 사용됩니다.
그림 1. 조직 표면 tensiometer의 개요.
그림 2. tensiometer 챔버 (오른쪽 패널)의 상세 볼 수 있습니다.
tensiometer 챔버의 그림 3. 도식보기.
그림 4. 압축 (A) 및 압축 (B) 집계 이미지.
그림 5. 라플라스 방정식.
그림 6. 형상 평형에서이 저조한 준수 두 평행 판 사이 압축 액체 작은 물방울의 다이어그램. R 1과 R 2는 각각 비말의 적도에서와 대칭 자사의 축을 통해 비행기에서 곡률의 두 가지 기본 반지름입니다. R 3 압축 판 중 접촉의 비말의 원형 영역의 반경이다. H는 위턱과 아래턱에 압축 플레이트 사이의 거리입니다. X는 비말의 표면 및 압축 판 중 사이의 접촉의 지점으로 확장이 hypotenuse의 R과 직각 삼각형의 한쪽이다.
| 1 (다인즈 / cm ± SEM)을 σ | 2 σ (다인즈 / cm ± SEM) | Pσ 1 VS 2 σ | 1,2 (다인즈 / cm ± SEM)을 σ | 2 σ / 1 σ | F 2 / F 1 | Pσ 2 / 1을 σ와 F 2 F 1 | |
| RPF | 22.6 ± 1.7 | 22.9 ± 1.4 | > 0.05 * | 22.8 ± 1.1 | 1.04 ± 0.04 | 1.47 ± 0.06 | <0.05 |
| RPSMC | 15.0 ± 2.8 | 23.0 ± 3.2 | 0.039 | NA | 1.9 ± 0.3 | 1.6 ± 0.1 | 0.16 * |
그림 7. TST 측정 및 쥐의 전립선 섬유아 세포 및 평활근 세포의 집계에 대한 총체적 유동성의 확인.
그림 8. 시그마와 RPF의 집계에 대한 볼륨 (레드 린)과 RPSMCs (블루 린) 간의 관계.
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Discussion
TST로 집계 결합을 측정하는 것은 비교적 간단합니다. 유용한 TST 데이터를 생성하기 위해서는 마스터해야합니다 주요 단계는, 그러나,있다; 1) 집계는 "건강"해야합니다. 이것은 집계 형성이 분리하기 전에 최적의 합류에있다 세포로 시작함으로써 제어할 수 있습니다. 문화 집계 크기와 시간도 집계 이내에 괴사 코어의 개발을 최소화하기 위해 통제되어야하며 2) TST 측정에 영향을 미칠 수있다 또 다른 매개 변수는 상부 또는 하부의 압축 판으로 골재의 접착력의 정도입니다. 따라서, 코팅하는 데 사용되는 폴리 - HEMA의 최적 농도는 접시가 경험적으로 골재의 각 유형에 대한 결정되어야하며 그것이 사전에 압축 집계가 가능한 구형되어야 바람직 동안) 3, 그것은 엄격하게 필요하지 않습니다. 특히 일부 집계, 약하게 함께 개최 것들은 완벽한 분야를 형성하지 않는 경향이 있습니다. 이에 대한 설명 순서로 완전히 라운드 - 업 세포로 이동하고 다시 배열하여 에너지를 소비해야한다는 것입니다. 에너지의 금액이 구면되기의 에너지 최소화를 초과하는 영역에 접속 라운드에 필요한 경우, 집계 일부 하위 구면 모양에서 스톨하는 경향이 있습니다. 우리의 경험에서 압축되고시 같은 집계는 정도로 압축력을 저항하는 완벽한 구형부터 시작한다면 그들이 것이 정확하게 집계 양식 세미 원의 측면, 4) 그것은 또한 중요하다는 것을 압축 플레이트 한 서로 평행입니다. 이것은 가장 니켈 - 크롬 와이어 정리와 악기 수준과 수직되었는지함으로써 수행됩니다. 이러한 조치가 붙어있다면, 조직 표면 tensiometry은 비교적 간단하고 조직의 그들의 근본적인 분자 determinants의 기계적 성질에 매우 유용한 정보를 생성할 수 있습니다.
집계 결합이 존재 측정하는 다른 방법, 예를 들면 Cahn의 electrobalance와 같은 전문 장비에 대한 필요성을 제거하는 일부. 한 이러한 방법은 일정한 흡입 압력, 회전 타원체의보다 작은 직경의 피펫으로 회전 타원체를 aspirates. 조직의 점탄성 특성은 그것이 피펫 18 내부 흐름으로 세포 재료의 길이 변화를 측정하여 변형의 변형에서 추론됩니다. 유용하지만,이 방법은 그것이 적용될 수있는 표면 긴장의 범위로 제한있을 수 있습니다. 함께 개최됩니다 집계가 매우 강력하게 전혀 aspirated되지 않을 수 있습니다 반면, 그들은, 피펫으로 aspirated 아르 매우 약한 집계 가능성이 파괴됩니다. 병렬 플레이트 압축은 0.33으로 낮은 표면 긴장을 측정했습니다 ± zebrafish의 배아 레이어 ectoderm에 대한 0.02 다인즈 / CM은 20.1 ± 0.5 다인즈 / 배아 병아리 사지 버드 mesoderm 2 집계에 대한 cm만큼 높음으로 E - cadherin morpholino 3 처리, 그를 보여주는 여러 배아 시스템을위한 광범위한 응집 범위에서 일반적인 유틸리티.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| water bath/shaker | New Brunswick Scientific | ||
| 10 ml round-bottom flasks | Bellco Glass |
References
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