Summary
Biz 3D doku gibi agrega içinde hücreleri arasında, bağlayıcı enerji, doku yüzey gerilimi olarak ifade ölçme yöntemi açıklanmaktadır. , Akciğer, kas, ve beyin tümörleri invazivliğini ile ilişkili doku yüzey gerilimi farklar göstermiştir ve farklı hücre türleri arasındaki mekansal ilişkilerin kurulması temel belirleyicileri olmuştur.
Abstract
Içi bağlayıcı enerji sıkı ölçümü sadece denge sistemleri termodinamik ilkeleri temelinde yöntemler kullanılarak yapılabilir. Biz özellikle hücreleri arasındaki etkileşimin yüzey serbest enerji ölçmek için doku yüzeyinin tensiometresi (TST) geliştirdik. TST temel biyofiziksel kavramları daha önce ayrıntılı 1,2 tarif edilmiştir. Bu metot, karşılıklı olarak birbirine bağlı hücreler, kültür sallayarak muhafaza, kendiliğinden kümeler halinde monte edeceği gözleme dayanır. Zamanla, bu kümeleri oluşturmak için küreler kadar yuvarlak. Bu yuvarlama-up davranışı sıvı sistemlerinin davranış özelliği taklit eder. Hücreler arası bağlayıcı enerji, özel tasarlanmış bir doku yüzeyine tansiyometre paralel plakalar arasında küresel agrega sıkıştırarak ölçülür. Aynı matematiksel denklemi, bir sıvı damlacık yüzey gerilimi ölçmek için kullanılan 3D doku gibi küresel agrega yüzey gerilimi ölçmek için kullanılır. Sıvı yüzey gerilimi hücresel eşdeğer içi bağlayıcı enerji, ya da daha genel olarak, doku cohesivity. Laboratuvarımızda Önceki çalışmalar, embriyonik hücreler iki grup, başka bir 1-5 ile etkileşim (2) güçlü (3), biyomalzemeler 6 ile etkileşim dokuların yeteneği nasıl etkileyebilir doku yüzey gerilimi (1) öngördüğünü göstermiştir sadece kaderin tabanlı hücrelerarası uyum 7 doğrudan manipülasyonu yoluyla değil, aynı zamanda FN 8-11 ve 4 gibi önemli ECM moleküller) manipülasyon tarafından değiştirilebilir akciğer kanseri 12, fibrosarkoma 13, 14 beyin tümörü ve prostat tümörlerinde invaziv potansiyeli ile ilişkilidir hücre hatları 15. Bu yazıda, aparatı, detay parçacıklarının oluşturmak için gerekli adımları tansiyometre odasına parçacıklarının yüklemek için toplam sıkıştırma başlatmak için oluşturulan doku yüzey gerilimi ölçümleri analiz etmek ve doğrulamak için anlatacağız.
Protocol
1. Agrega doku yüzey gerilimi ölçümü için hazırlanması.
Yapışık hücreler için parçacıklarının ya asılı bırak yöntemini kullanarak ya da tutarlı bir sayfa sonra 1 mm parça halinde kesilebilir hücreleri üreterek oluşturulabilir.
Asılı damla yöntemi ile toplam oluşumu:
- Yakın konfluent yapışık hücre kültürleri,% 90 izdiham büyüdü olmalıdır Bunun üzerine mono tabakaları PBS ile iki kez durulanır olmalıdır. De boşalttıktan sonra, 2 ml% 0.05 tripsin-1 mM EDTA (100 mm plaka için) ekleyin ve 37 inkübe ° C hücreleri ayırmak kadar. 2 ml tam orta ekleme ve hücreleri süspansiyon kadar karışımı hafifçe çiğnemek için 5 ml pipet kullanın trypsinization Dur. 15 ml konik tüp hücreleri aktarın.
- 10 mg / ml DNAz stok solüsyonu 40 ul ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. 5 dakika boyunca 200 xg'de Vortex kısa ve santrifüj.
- Süpernatant atın ve 1 ml tam doku kültür ortamı ile yıkayın pelet. Tekrarlama, daha sonra tekrar süspansiyon hücrelerin doku kültürü orta 2 ml.
- Hemasitometre, ya da otomatik hücre sayıcı kullanarak hücre sayımı ve 2.5 x 10 6 hücre / ml konsantrasyon ayarlayabilirsiniz.
- 60 mm doku kültürü çanak ve çanak alt PBS 5 ml kapağını kaldırın. Bu hidrasyon odası olarak hareket edecektir.
- Kapağını ters çevirin ve alt kapağın üzerine 10 ul damla yatırmak için 20 ul pipet kullanın. Dokunmatik olarak damla yeteri kadar ayrı yerleştirildiğinde olduğunu emin olun. Bulaşık başına en az 20 damla yerleştirmek mümkündür.
- 37 ° PBS-dolu alt odası ve inkübe ° C /% 5 CO 2 /% 95 nem üzerine kapağı, invert günlük damla izlemek ve hücre yaprak veya agrega ya oluşturmuşlardır kadar inkübe.
- Yaprak formunda yuvarlak alt cam çalkalayıcı transfer olabilir tam orta 3 ml içeren ve 37 sallayarak bir su banyosunda inkübe şişeler ° C ve% 5 CO 2 parçacıklarının formu kadar.
Hücre levha yöntemi ile toplam oluşumu:
- Tek hücre süspansiyonları, yukarıda açıklanan ancak 1x10 6 hücre / ml konsantrasyonu ayarlanır hazırlanmıştır .
- Hücre süspansiyonu 3 ml, 10 ml yuvarlak alt şişeler (Belco, Vineland, NJ) aktarın.
- Konili bir su banyosu / 37 çalkalayıcı (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) ° C, 120 rpm'de 4h için% 5 CO 2 hücreleri trypsinization kurtarmak kadar şişeler inkübe edin.
- Cam bir yuvarlak alt santrifüj tüpü ve ince bir pelet içine 200 X g de santrifüj hücreleri aktarın. Tutarlı bir sayfa kıvamına gelinceye kadar başka bir 24 saat inkübe edin.
- Yavaşça girdap kültür tüp levha yerinden ve kültür tüp içeriği, steril cam doku kültürü çanak içine dökün.
- Çeşitli büyüklüklerde parçalara yaprak kesmek için mikro neşter kullanın.
- Küresel hale ° C 120 rpm'de Konili su banyosunda çalkalayıcı üzerinde% 2 ya da 3 gün için CO 2 5 altında veya kadar 37 parçaları inkübe edin.
2. Toplam yüzey geriliminin ölçülmesi
- Doku yüzeyine tansiyometre. Aparat İncir gösterilmektedir. 1 ve 2. Sıkıştırma hücresi (Şekil 3), iki odadan oluşmaktadır. Dış odası (OC) 37 ° C dolaşan su pompası bağlı ve iç odanın (IC) ısısını düzenlemek için hizmet vermektedir. Odaları öğütülmüş Kemik inşa ve toplu bir görünüm için kuvars pencereleri içerir. 3) sıkıştırma başlatmak için agrega yükseltmek; 2) iç odasının alt mühür; alt montaj (LA) iç odasının tabanına vida ve konumu) 1 iç odasında agrega kullanılır ve (4 Paralel plakalar ve dolayısıyla toplam sıkıştırma arasındaki mesafe kontrolü). Toplanma merkezi çekirdek (CC) ayarlanabilir. Merkezi bir çekirdek (kaide) ucu pürüzsüz Teflon oluşan ve alt sıkıştırma plakası (LCP) gibi davranır. Üst sıkıştırma plakası (UCP) Teflon silindir 15mm uzun denge kolu (B) alev doğruldu nikel-krom tel (NCW) sarkan *. Bir denemenin seyri sırasında, hücre agrega (A) alt plaka üzerine yerleştirilir ve üst plaka temas kadar yükseltti. Üst plaka denge kolu (B) bağlıdır. Agrega Sıkıştırma denge kolu yerinden neden olur. Dengesi boş denge prensibi üzerine çalışan bir Cahn / Ventron model 2000 kayıt Elektronik terazi,. Denge kol dayanak noktası, kalıcı bir manyetik alan içinde bir armatür vardır. Denge çalışırken, sürekli denge kolu da yatay konumda tutar elektromanyetik montaj, elektrik akımını geçirerek modüle. Bir nesne, denge Horizo kolunu tutmak için geçerlidir, gerilim, denge kolu askıya alınırsantal konumu, nesne tartmak orantılıdır. Bu gerilim, toplam uygulanan dış basınç kuvveti ölçer. Agrega şekli bir frame grabber ile donatılmış bir bilgisayar ile birleştiğinde 25 x Nikon SMZ10A Stereoskop yoluyla görsel gözlem ile takip edilmektedir. Sıkıştırma plakaları, hücre agrega yapışma en aza indirmek için, alt ve üst sıkıştırma plakaları poli (2-hydroxyethylmethacrylate), {poli (HEMA)}, hücreler 16 yapışamayan polimerik malzeme ile kaplı her ikisi de.
* Tel alev doğruldu imbik stand 15-inç uzunluğunda bir tel askı ve sonunda küçük bir bağlayıcı klip sıkma. Bunsen beki, daha sonra tel kırmızı yanıyor kadar telin uzunluğu aşağı yukarı çalıştırın ve. Doğruldu tel sonra uygun boylarda kesilebilir. Küçük bir kanca, tel bükme yaklaşık ¼ inç sonundan itibaren iki Jilet kullanarak oluşur. Diğer ucunu sonra daha düşük bir sıkıştırma plakası namlu içine eklenir. - Agrega sıkıştırma.
- Iç haznesi, önceden ısıtılmış CO 2 bağımsız doku kültür vasatı (Gibco / BRL, NY) ile doludur .
- Agregalar yaklaşık 200-300 μ arasında değişen, düşük sıkıştırma plakası (Şekil 4A) konumlandırılmış. Agregalar, toplu bir silikon ampul takılmış bir Pasteur pipeti ucu kadar doku kültürü orta yarı yolda aspire, iç odasına pipet ve pipet LCP yukarıdaki ucu konumlandırma yüklenir. Agrega yavaşça ampul hafifçe sıkarak, LCP üzerine atılır. Alternatif olarak, toplam LCP üzerine ağırlık düşmesi için izin verilir.
- Üst sıkıştırma plakası (UCP) agrega üzerine yerleştirilmiş ve bir ön sıkıştırma belirgin UCP ağırlığı temel kurarak, yerleşmek için izin verilir.
- Agrega UCP (Şekil 4B) karşı sıkıştırılmış kadar LCP sonra ortaya çıkar. Alt aygıtının iç çekirdek yükseklik ayarlama sıkıştırma farklı derecelerde kontrol eder. Sıkıştırma CCD video kamera ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu ile gözlem ile izlenir.
- Agrega görüntüler, yakalanan, sayısallaştırılmış ve ImageJ kullanılarak analiz edildi. Görünür UCP ağırlık değişimi sürekli Cahn denge gerilim çıkışı tesviye-off gösterilir bir şerit grafik kaydedici, şekil denge başarı kaydedilir. Her agrega sıkıştırma 2 farklı derecelerde maruz kalmaktadır.
- Toplam yüzey gerilimi hesaplanması.
Uymazsa için paralel plakalar arasında sıkıştırılmış hücrelerinin şekil denge, agrega cohesivity cohesivity olan F toplam sıkıştırmak için hareket kuvvet σ Young-Laplace denklemi (Şekil 5), elde edilebilir , πr 3 2 F kuvveti sarf edildiği toplam yüzey alanı, ve R 2 ve R 3, sırasıyla, sıkıştırılmış agrega ekvator yarıçapı ve yüzey profili normal tanımlayan bir yay yarıçapı plakalar sıkıştırmak ve onları (Şekil 6) arasında uzanan. Kuvvet ve şekil denge basınç kuvveti ve geometri Ölçüm ve Young-Laplace denklemi için bu ölçümler uygulayarak belirgin doku yüzey gerilimi sayısal değerler üretir. Denge ve 1 σ hesaplama ulaştıktan sonra, agrega sıkıştırılmış ve ikinci bir denge yaklaşımı ve yukarıda açıklandığı gibi hesaplanır 2 σ izin. - Toplam likidite Onay.
Sıvı bir agrega hesaplanan yüzey gerilimi, iki farklı sıkıştırma maruz kaldığında sabit kalır. Gibi agrega oranı 2 σ / σ 1 1'e eşit olacak ve birbirini izleyen sıkıştırma (F 2 / F 1) uygulanan kuvvet oranına göre daha az olacaktır. Buna karşılık, elastik bir agrega hesaplanan yüzey gerilimi Hooke kanunu itaat ve uygulanan kuvvete orantılı olarak artış. Elastik agrega oranı 2 σ / 1 1 eşit olmayacak σ ancak bunun yerine F 2 / F 1 oranı yaklaşım olacaktır. Ayrıca, sıvı agregaların yüzey gerilimi toplam boyutu 2,17 bağımsız olacaktır . Uygulanan kuvvet ve büyüklük yüzey gerilimi bağımsız olduğu sadece ölçüm ortalama her hücre hattı için σ hesaplamak için kullanılır.
3. Temsilcisi sonuçları:
Aşağıda tipik TDT sonuçlarının sıçan prostat fibroblastlar (RPF) ve sıçan prostat düz kas hücreleri (RPSMC) agrega bir tablo. Şekil görüleceği gibi. 7 RPF hücrelerinin agrega bir yüzey gerilimi 22.8 ± 1.1 dynes / cm. Ayrıca, sıkıştırma sonra 1 ve 2'den sonra sıkıştırma ölçülen ortalama yüzey gerilimi değerleri istatistiksel olarak identeşleştirilmiş t-testi ile karşılaştırıldığında ical. Biz de onlar elastik katılar gibi davranmış olsaydı, 2 σ / bu rakamlar, Hooke kanunu itaat etmediğini sağlamak için 1 ve F 2 / F 1 σ oranları karşılaştırıldı. Tablo 1, 2 / 1 gerçekten 1.0 yaklaşım σ σ oranı gösterilmiştir. Ayrıca, F 2 / F 1 oranı daha fazla, bu rakamlar, Hooke kanunu itaat ve aslında sıvı gibi davranır olduğunu teyit σ 2 / 1 σ (eşleştirilmiş t-testi, p <0.05) daha anlamlı olarak daha fazla idi . Hooke kanunu kontrast RPSMCs itaat. Tablo 1, 2 σ / 1 σ oranı bellidir 1 den anlamlı olarak daha fazla ve daha F 2 / F 1 istatistiksel olarak farklı değildi. Daha fazla sıvı gibi davranış göstermek için, yüzey gerilimi (σ) ve toplam hacmi arasındaki ilişkiyi araştırdı. Şekil görüleceği gibi. 8 RPSMCs (mavi regresyon çizgisi, r 2 = 0,146) hacim sigma bazı bağımlılığı var ise, hacim, RPF hücreleri (kırmızı regresyon hattı, r 2 = 0.002) sigma bağımsız. Bu veriler daha RPSMCs, elastik katılar gibi davranmaya RPF agrega ise, sıvı-benzeri bir şekilde davrandığını onaylayın. Sadece bu ölçüleri sıvılar gibi davranıyor agrega elde edilen yüzey gerilimi hesaplamak için kullanılan olurdu.
Şekil 1 doku yüzeyine tansiyometre Genel Bakış.
Şekil 2 tansiyometre odası (sağ panel) daha ayrıntılı bir görünüm.
Şekil 3 tansiyometre odasının şematik görünümü.
Şekil 4 sıkıştırılmamış (A) ve sıkıştırılmış (B) agrega Görüntüler.
Şekil 5 Laplace Denklemi.
Şekil 6 şeklini dengede kötü yapışır iki paralel plakalar arasında sıkıştırılmış bir sıvı damlacık diyagramı. R 1 ve R 2 sırasıyla, damlacık ekvator ve simetri ekseni boyunca bir düzlemde, iki temel eğrilik yarıçapları. R 3 kompresyon pla ile temas, damlacık dairesel alanın yarıçapı. H, alt ve üst sıkıştırma plakalar arasındaki mesafedir. X damlacık yüzey arasındaki temas ve sıkıştırma plakası ya bir noktaya kadar uzanan 2 hipotenüs R ile dik açılı üçgenin bir tarafında.
| σ 1 (dynes / cm ± SEM) | 2 σ (dynes / cm ± SEM) | Pσ 1 vs 2 σ | 1,2 (dynes / cm ± SEM) σ | 2 σ / σ 1 | F 2 / F 1 | Pσ 2 / 1 σ ve F 2 F 1 | |
| RPF | 22.6 ± 1.7 | 22.9 ± 1.4 | > 0.05 * | 22.8 ± 1.1 | 1.04 ± 0.04 | 1.47 ± 0.06 | <0.05 |
| RPSMC | 15.0 ± 2.8 | 23.0 ± 3.2 | 0,039 | NA | 1.9 ± 0.3 | 1.6 ± 0.1 | 0.16 * |
Şekil 7 TST ölçümleri ve sıçan prostat fibroblastlar ve düz kas hücreleri büyüklükler toplam likidite onayı.
Şekil 8 sigma ve RPF agregatları için hacim (kırmızı çizgi) ve RPSMCs (mavi çizgi) arasındaki ilişki.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TST toplam uyum nispeten basittir. Ancak, kullanışlı TST veri oluşturmak amacıyla hakim olmalıdır önemli adımlar vardır: 1) agrega "sağlıklı" olmalıdır. Bu, toplam oluşumu dekolmanı önce optimum izdiham hücreleri ile başlar sağlanarak kontrol edilebilir. Kültür Agrega boyutu ve süresi de toplam içinde nekrotik çekirdek gelişimini en aza indirmek için kontrol edilmesi gerekir; 2) TST ölçümleri etkileyebilecek bir başka parametre üst veya alt sıkıştırma plakaları büyüklüğün yapışma derecesi. Buna göre, kat kullanılan poli-HEMA optimum konsantrasyon plakalar ampirik agrega her türü için tespit edilmelidir; sıkıştırma öncesi agrega mümkün olduğunca küresel gerektiğini tercih edilir) 3, kesinlikle gerekli değildir. Özellikle bazı büyüklükler, zayıf bir araya düzenlenen olanları, mükemmel küre formunda değil eğilimindedir. Bu açıklama, tamamen yuvarlak hücreler, hareketli ve yeniden düzenlenmesi enerji tüketmek gerekir. Enerji miktarı, küresel olma enerji minimizasyonu aşan bir küre içine yuvarlak Gerekirse, agrega bazı alt küre şeklini durma eğiliminde olacaktır. Deneyimlerimize göre, sıkıştırılmış olma üzerine, bu büyüklükler, mükemmel bir küre başlayarak yapacağını tam olarak toplu halde yarı daireler, iki tarafın; 4) de önemli bir ölçüde basınç kuvveti karşı sıkıştırma plakaları biri başka bir paralel. Bu en iyi nikel-krom tel, düz ve enstrüman ve çekül olduğunu olduğunu sağlanarak gerçekleştirilir. Bu önlemlere uyulması iseniz, doku yüzeyinin tensiometresi nispeten basit ve mekanik özellikleri dokuların ve onların temel moleküler belirleyicileri hakkında çok yararlı bilgiler üretebilir.
Toplam uyum var ölçmek için diğer yöntemler gibi Cahn Elektronik terazi gibi özel ekipman ihtiyacını ortadan kaldırmak bazı. Böyle bir yöntem, sürekli bir emme basıncı, sfero daha küçük çaplı bir pipet içine bir sfero aspiratlarda. Doku viskoelastik özellikleri, pipet 18 içinde akar gibi hücresel malzeme uzunluğu değişimi ölçerek suşu varyasyon çıkarılabilir . Yararlı olsa da, bu yöntem uygulanabilir olan yüzey gerilimi aralığında kısıtlamaları olabilir. Çok zayıf agrega birlikte düzenlenecek olan agrega çok güçlü aspire edilebilir değil ise, pipetle aspire olarak muhtemelen yok olacaktır. Paralel plaka sıkıştırma yüzey gerilimi 0.33 gibi düşük olarak ölçülen ± 20.1 ± 0.5 dynes embriyonik civciv bacak tomurcuk mezoderm 2 agrega / cm gibi yüksek zebrafish germ tabakası ektoderm 0.02 dynes / cm 3 ile E-cadherin morfolino tedavi, gösteren birkaç embriyonik sistemleri için geniş bir uyum aralığı üzerinde genel bir yardımcı program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| water bath/shaker | New Brunswick Scientific | ||
| 10 ml round-bottom flasks | Bellco Glass |
References
- Foty, R. A., Forgacs, G., Pfleger, C. M., Steinberg, M. S. Liquid properties of embryonic tissues: Measurement of interfacial tensions. Phys Rev Lett. 72, 2298-2301 (1994).
- Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. Development. 122, 1611-1620 (1996).
- Schotz, E. -M. Quantitative differences in tissue surface tension influence zebrafish germ layer positioning. HFSP Journal. 2, 42-56 (2008).
- Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells. Dev Dyn. 236, 2039-2049 (2007).
- Schwarz, M. A., Zheng, H., Legan, S., Foty, R. A. Lung Self-Assembly is Modulated by Tissue Surface Tensions. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2010).
- Ryan, P. L., Foty, R. A., Kohn, J., Steinberg, M. S. Tissue spreading on implantable substrates is a competitive outcome of cell-cell vs. cell-substratum adhesivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4323-4327 (2001).
- Foty, R. A., Steinberg, M. S. The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. Dev Biol. 278, 255-263 (2005).
- Robinson, E. E., Foty, R. A., Corbett, S. A. Fibronectin matrix assembly regulates alpha5beta1-mediated cell cohesion. Mol Biol Cell. 15, 973-981 (2004).
- Robinson, E. E., Zazzali, K. M., Corbett, S. A., Foty, R. A. alpha5beta1 integrin mediates strong tissue cohesion. J Cell Sci. 116, 377-386 (2003).
- Winters, B. S., Raj, B. K., Robinson, E. E., Foty, R. A., Corbett, S. A. Three-dimensional culture regulates Raf-1 expression to modulate fibronectin matrix assembly. Mol Biol Cell. 17, 3386-3396 (2006).
- Caicedo-Carvajal, C. E., Shinbrot, T., Foty, R. A. Alpha5beta1 integrin-fibronectin interactions specify liquid to solid phase transition of 3D cellular aggregates. PLoS One. 5, e11830-e11830 (2010).
- Foty, R. A., Steinberg, M. S. Measurement of tumor cell cohesion and suppression of invasion by E- or P-cadherin. Cancer Res. 57, 5033-5036 (1997).
- Foty, R. A., Corbett, S. A., Schwarzbauer, J. E., Steinberg, M. S. Dexamethasone up-regulates cadherin expression and cohesion of HT-1080 human fibrosarcoma cells. Cancer Res. 58, 3586-3589 (1998).
- Winters, B. S., Shepard, S. R., Foty, R. A. Biophysical measurement of brain tumor cohesion. Int J Cancer. 114, 371-379 (2005).
- Foty, R. A., Cummings, K. B., Ward, S. Tissue surface tensiometry: a novel technique for predicting invasive potential of prostate tumors based on tumor cell aggregate cohesivity in vitro. Surgical Forum L. , 707-708 (1999).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Foty, R. A., Forgacs, G., Pfleger, C. M., Steinberg, M. S. Liquid properties of embryonic tissues: Measurement of interfacial tensions. Physical Review Letters. 72, 2298-2301 (1994).
- Guevorkian, K., Colbert, M. J., Durth, M., Dufour, S., Brochard-Wyart, F. Aspiration of biological viscoelastic drops. Phys Rev Lett. 104, 218101-218101 (2010).
