Summary
Быстрый метод получения проникновения лейкоцитов из мышиного мозга описывается. Этот метод использует непрерывный градиент Перколла и разрывные градиент Ficoll, чтобы выбрать и очистить лейкоцитов обогащенного слоя. Изолированные лейкоцитов может затем быть охарактеризованы с помощью проточной цитометрии измерений.
Abstract
Мы опишем способ получения мозг проникают лейкоциты (BILS) от мышей. Мы показываем, как заразить мышей с мышиным энцефаломиелит Theiler это вирус (TMEV) с помощью быстрой внутричерепного технике инъекций и как очистить лейкоцитов обогащенного населения проникают клетки весь мозг. Короче говоря, мышей анестезировали изофлуран в закрытой камере, и от руки вводят с помощью шприца Гамильтона в лобной коре. Мыши затем убили в разное время после заражения изофлуран передозировки и весь мозг извлекаются и гомогенизировали в RPMI с мясорубки ткани Tenbroeck. Мозг гомогенатах центрифугируют через непрерывный 30% Перколла градиента, чтобы удалить миелина и другой клетке мусора. Клеточной суспензии затем напряженными при 40 мкм, промывают и центрифугируют на разрывной Ficoll-Paque Плюс градиента, чтобы выбрать и очистить лейкоцитов. Лейкоциты, затем промывали и ресуспендировали в соответствующие буферы для иммунофенотипирования с помощью проточной цитометрии. Проточная цитометрия выявляет населения врожденных иммунных клеток на ранних стадиях инфекции в C57BL / 6 мышей. Через 24 часа после инфекции, несколько подмножеств иммунные клетки присутствуют в BILS, с населением обогащенных Gr1 +, CD11b + и F4/80 + клеток. Таким образом, этот метод полезен при характеристике иммунного ответа на острую инфекцию в мозгу.
Protocol
1. Внутричерепное инъекции вируса:
Следующий прием был модифицирован и использован широко в нашей лаборатории и коллег. Короче говоря, внутричерепное введение штамма Даниила мышиных энцефаломиелит Theiler это вирус (TMEV) или фиктивных-инфекции (1, 10) проводится на молодых мышей (желательно 5-6 недель), чтобы выявить мозг проникают лейкоциты (BILS). Обратите внимание, что результаты будут отличаться между деформацией Даниила, Боб напряжение, и напряжение GDVII. Для уборки BILS, мыши получать 2x10 5 БОЕ из TMEV и инфицированы в течение 24 часов.
- Прикрепить инъекционной иглой (27 калибр, ¼ в Кендалл), для автоматического шприца 1 мл Гамильтон и набор для доставки 10 мкл вируса.
- Составить TMEV в 10 мкл DMEM в шприц с пристальное внимание пузырьков воздуха. При необходимости, притворство инфицированных мышей получают 10 мкл вирусов DMEM.
- Просто перед инъекцией, залить примерно 1 мл изофлуран в колоколе, который содержит проволочной сетки с хлопковыми подложки под ним.
- Место мышей direclty на проволочные сетки в колпаком пока они не станут слегка под наркозом, нечувствительным до пят-пинча и обездвижен ингаляционных анестетиков, примерно 10-15 секунд. Мыши не должна быть в непосредственном контакте с изофлуран, как вещество может вызвать раздражение и каустика.
- Находясь под наркозом, подготовить мышей для инъекций за счет быстрого поиска подходящих координатах в лобной области коры на черепе использовании бритья и писать чернилами. Общее расположение для инъекций составляет 1 мм впереди брегмы и 1 мм латеральнее сагиттального шва на правой стороне (рис. 1). Хотя стереотаксической инъекции могут быть неподходящими для некоторых экспериментальных ситуациях, мы обнаружили, что от руки инъекции без бритья или красочного подходит для большинства экспериментов. Расставание меха с острие иглы по обеим осям подходит для инъекций.
- Чтобы сделать инъекцию, ориентироваться иглу перпендикулярно к черепу и нажмите через кость приблизительно 3 мм глубиной.
- Экспресс вируса в мозг, нажав на кнопку Гамильтон шприца вниз и ждать 2 секунды, что вирус может проникать в мозг до снятия.
- Осторожно снимите иглу и место мыши в чистые, сухие клетки. Мыши пробудиться от наркоза быстро и возобновить нормальную работу в течение нескольких минут. Уделять должное внимание мышей, которые обладают ненормальной симптомы, такие как кровотечение из места инъекции, как эвтаназия животного может быть целесообразно. Правильная обработка животных 6 и соблюдение Национального института здоровья и Уходу за животными и руководящие принципы Используйте комитета должны соблюдаться.
2. Брейн-проникновения лейкоцитов подготовке ячейки:
- Подготовка круглым дном Oak Ridge пробирок в котором можно хранить емкостью 30 мл с 10 мл RPMI 1640, 9 мл Перколла и 1 мл 10 раз PBS и трубки должны сидеть при комнатной температуре на скамейке во время процесса удаления мозга.
- Принесите Ficoll-Paque Plus до комнатной температуры (РТ).
- Усыпить животное изменение изофлуран передозировки 5 и быстро удалить мозга с помощью шпателя из нержавеющей стали ткани и поместите в 15 мл коническую трубку с 5 мл RPMI на льду. В некоторых случаях, ПБС-перфузии может быть целесообразно для удаления циркулирующих клеток периферической крови от подготовки BILS. Мыши должны быть полностью и надлежащим образом анестезии до PBS-перфузии.
- Передача головного мозга и RPMI решение 7 мл стекла Pyrex бренда мясорубку ткани Tenbroeck и мягко гомогенизации с 10-15 ударов.
- Внесите дополнительные 5 мл RPMI в гомогенизатор и пипетки вверх и вниз в два раза. Передача гомогената мозга (около 10 мл) на заранее подготовленные с круглым дном трубки и аккуратно переверните 2-3 раза перемешать.
- Спиновые гомогената мозга при 7800g пр. в течение 30 мин при комнатной температуре в F0360 фиксированным углом ротора в Бекман Allegra X-22R клинической центрифуге.
- После центрифугирования, удалить миелина мусора, который плавал в начало градиента. Сбор лейкоцитарный слой, который парит над эритроцитов гранулы (рис. 2).
- Штамм лейкоцитарного слоя через сито 40 мкм ячейки в 50 мл коническую. Доведите раствор до 50 мл объема с RMPI.
- Спиновые пробирки с разбавленной суспензии клеток в клинической центрифуге при 1500 оборотов в минуту (600 г. пр.) в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Аспирируйте супернатант и собрать осадок клеток. Ресуспендируют гранул в 1 мл FACS буфера (1% бычьего сывороточного альбумина, 0,02% азида натрия кальцием и магнием без PBS) и передачи клеточной суспензии по 5 мл круглым дном FACS труб.
- Тщательно подложки подвеска с 1 мл Ficoll-Paque Plus.
- Спиновые трубки при 2500 оборотов в минуту (1400 дал) в клинической центрифуге в течение 25 минут при комнатной температуре, без тормозов.
- Удалить белый, пушистый слой на границе раздела фаз (рис. 2) с 1 мл пипетки и перехода на новые трубки 5 мл FACS. Вымойте слоктя с 4 мл буфера FACS.
- Спиновые трубки при 1500 оборотов в минуту (600 г. пр.) в течение 5 минут при комнатной температуре в клинической центрифуги для осаждения клеток.
- Аспирируйте супернатант и собрать осадок клеток. Ресуспендируют лейкоцитов пеллет в соответствующий буфер и держать на льду в новую пробирку СУИМ.
- Граф клетки, оценивает жизнеспособность клеток Трипановый синий изоляции и анализировать с помощью проточной цитометрии. В общем, следователи могут рассчитывать на приобретение примерно 5 х 10 5 клеток / животное.
3. Проточной цитометрии иммунофенотипирования
- После выделения и подсчета лейкоцитов, спина клетки в течение 3 минут со скоростью 1500 оборотов в минуту (600 дал) в клинической центрифуге.
- Ресуспендируют гранул в блокирующем буфере, содержащем следующее: FACS буфера, супернатант из 2.4G2 гибридомы (Fc блок; anti-CD16/32) и эмбриональной телячьей сыворотки в соотношении 10:05:01 и инкубировать 30 минут при 4 ° С .
- Подготовить и добавить конъюгированных антител против внеклеточных антигенов заблокирован клетки в концентрации 1:200 и инкубировать 30 минут при 4 ° С в темноте. Красителей и инкубировать клеток в 200 мкл в 96-и V-нижней пластине. Соответствующие управления включают неокрашенных клеток и флуорохромом образцы компенсации, в случае необходимости.
- Спиновые окрашенных клеток при комнатной температуре в течение 3 минут при 1500 оборотов в минуту (600 дал) в клинической центрифуге использованием ротора подходит для 96-луночных планшетах.
- Аспирируйте супернатант и промыть клетки с 200 мкл буфера FACS, осторожно пипетирования вверх и вниз три раза.
- Повторите описанную выше технику мытье дважды.
- После мытья ресуспендирования клеток в 2% параформальдегида и трансфер в FACS труб. Фиксация необходима для проточной цитометрии клеток, инфицированных по биобезопасности 2-го уровня реагентов.
- Выполнить фиксированных клеток на BD FACS Calibur следующий модифицированный метод проточной цитометрии 8 и анализа файлов оффлайн, используя FlowJo, WinMDI или других имеющихся проточной цитометрии анализа программного обеспечения.
- Анализ 50-100,000 событий на образец, как правило, необходимых для адекватного иммунофенотипирование.
Непосредственно конъюгированных антител, используемых в этом эксперименте:
CD45 был обнаружен клон с 30-F11. Ly6C / G была обнаружена с клоном Gr1, RB6-8C5. CD11b был обнаружен клон M1/70. F4/80 был обнаружен клон BM8.
4. Представитель Результаты:
Мы показываем, клетка фенотипирование результаты для мыши BILS через 24 часа после заражения (рис. 3). Лейкоциты были окрашены PerCP-сопряженных анти-CD45 мыши для выявления иммунных клеток, PE-сопряженных антимышиным Ly6C / G для выявления воспалительных моноциты, APC-сопряженных антимышиным CD11b и APC-сопряженных антимышиным F4/80 обнаружить клетки моноцитов линии. Анализ был проведен с инструментом BD FACS Calibur.
Рисунок 1. Анатомические локализации места инъекции. Инъекции находится на расстоянии 1 мм впереди брегмы и 1 мм латеральнее сагиттального шва на правой стороне.
Рисунок 2. Иллюстрация градиент разделение лейкоцитов и BILS. Лейкоциты первоначально собраны непосредственно под слоем мусора миелина и выше РБК гранул в градиенте Перколла. Белый, пушистый слой (BILS) на границе взимается с градиентом Ficoll.
Рисунок 3. Иммунофенотип мозгов infilatrating лейкоцитов в 24 часов после заражения. Лейкоцитов мыши были выделены из мозга дифференциального центрифугирования плотность ткани гомогенатах приготовленные из животных через 24 ч после внутричерепной инфекции. Клетки окрашивали флуоресцентно конъюгированных антител против CD45 мыши, Ly6C / G, CD11b и F4/80. Первоначальные стробирования был выполнен путем нанесения CD45, маркер для иммунных клеток, от рассеяния вперед (ФСБ), показатель размера ячейки (C). CD45 привет (A, D), CD45 вот (В, Е) и CD45 нег (F, G) населения были затем проанализированы на относительный уровень экспрессии моноцитов и макрофагов маркеры Ly6C / G, F4/80 (A, B , F), и CD11b (D, E, G). Ly6C / G + + F4/80 CD11b + воспалительных моноцитов были обнаружены почти исключительно в CD45 привет населения (A, D), в соответствии с проникновением этих клеток с периферии. В противоположность этому, Ly6C/G-F4/80 вот CD11b + макрофагов были обнаружены почти исключительно в CD45 ло (В, Е) и CD45 нег (G) населения, в соответствии с резидентами фенотипа. В многочисленных экспериментах, мы никогда не наблюдали CD45 привет клеток или Ly6C / G + + F4/80 CD11b + воспалительных моноцитов в мозг неинфицированных или фиктивных-инфекцииТед мышей (данные не приведены).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы регулярно пользоваться проточной цитометрии для определения как качества мозг проникают ячейки подготовки, и различать различные популяции иммунных клеток, 2, 9. При острых временных точках, наши BILS метод дает высокий процент воспалительных моноцитов в CD45hi населения, а также высокий процент макрофагов в CD45lo населения. Это означает, что воспроизводимый иммунного ответа в мозге может энергично характеризуется наш метод.
Эта техника имеет особое значение для экспериментов, которые требуют хорошо известных населению иммунных клеток из мозга мыши. Ранее мы уже выполнены эксперименты приемных передачи путем введения наш мозг проникают в лейкоциты реципиента через хвостовую вену инъекцию 7, и мы охарактеризовали BILS через различные эксперименты в пробирке 9. Наши BILS подготовки особенно выгодно в экспериментах, которые должны отличать разные популяции иммунных клеток-резидентов клетки головного мозга, в том числе резидентов макрофагов и микроглии. Другое применение проценты включают в режиме реального времени RT-PCR анализ, проведенный на общую РНК, выделенной из BILS на 7 дней после инфекции для выявления эффекторные функции 3. Например, мы измерили GAPDH, гранзима B и перфорина РНК в BILS собранных в 7 дней после инфекции от перфорина-компетентных и с дефицитом животных, инфицированных TMEV. Мы также использовали нашу BILS метод определить, как NKG2D способствует очистке TMEV из мозга зараженных мышей остро 4.
Есть несколько важных аспектов метода. Важно, чтобы привести все решения до комнатной температуры до подготовки, чтобы избежать чрезмерных нагрузок на лейкоциты и для обеспечения надлежащего денситометрических разделения. Стресс на лейкоциты способствует гибели клеток, что делает их особенно ненадежным для экспериментов в естественных условиях, где жить популяция клеток является восприимчиво переданы в животного-хозяина. Мы также определили, что использование холодной Перколла не только изменения плотности разрывных градиент, но и влияет на качество лейкоцитов. Другим важным элементом является достаточным и нежный гомогенизации ткани головного мозга. Мы обнаружили, что неадекватный и грубый гомогенизации тканей головного мозга приводит к обильным количеством клеточного мусора видели микроскопии и проточной цитометрии. Сотовые мусора также может быть вызвано не напрягая мозг гомогената с соответствующего размера ячейки фильтра. Должное внимание к деталям является ключевым в подготовке достаточно и достаточно BILS для дальнейших экспериментов и анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом NS64571 от NINDS (CLH), на ранних награду развития карьеры из клиники Майо (CLH), а щедрый подарок от Дональда и Фрэнсис Herdrich (CLH). Мы хотели бы поблагодарить потока клиники Майо цитометрии основной для получения помощи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TMEV | Howe Lab | N/A | |
| Daniel’s strain | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurane | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes | Nalge Nunc international | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche Group | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Trypan Blue 0.4% (w/v) | Mediatech, Inc. | 25-900-CI | |
| 15 ml conical tubes | BD Biosciences | 352097 | |
| 7 mL glass Pyrex brand Tenbr–ck tissue grinder | Fisher Scientific | 08-414-10B | |
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 50 mL conical | BD Biosciences | 352070 | |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352054 | |
| fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| 2.4G2 hybridoma | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-bottom plate | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrifuge or equivalent | Beckman Coulter Inc. | N/A | |
| 96-well plate bucket and rotor | Beckman Coulter Inc. | S2096 | |
| Fixed-angle rotor | Beckman Coulter Inc. | F0360 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N/A | |
| FlowJo 7.5 | Tree Star, Inc. | N/A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C/G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | eBioscience | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | eBioscience | 17-4801-82 | clone: BM8 |
References
- Buenz, E. J., Howe, C. L. Picornaviruses and cell death. Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).
- Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay. Cytometry A. 71, 170-173 (2007).
- Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis. J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).
- Deb, C., Howe, C. L. NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain. J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).
- Donovan, J., &, P. B. rown, , P. Euthanasia. Current Protocols in Neuroscience. , A.4H.1-A.4H.4 (2005).
- Donovan, J., Brown, P. Handling & restraint. Current Protocols in Immunology. 73, 1.3.1-1.3.6 (2006).
- Donovan, J., Brown, P. Parenteral injections. Current Protocols in Neuroscience. , A.4F.1-A.4F.9 (2005).
- Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur. Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).
- Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination. J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).
- Lipton, H. L. Theiler's virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
